馬長(zhǎng)路，焦揚(yáng)，吳蕓，逄曉陽(yáng)，張書(shū)文，蘆晶，呂加平

（1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院食品與生物工程系，北京102442；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京100193；3.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅張掖，734000；4.北京華禧軒食品有限公司，北京100018）

0 引 言

褐色酸奶是近年來(lái)興起的新產(chǎn)品，與傳統(tǒng)酸奶相比最大的區(qū)別在不添加任何色素，通過(guò)工藝，配料加工形成暖色調(diào)，并帶有獨(dú)特的焦糖味。而功能性低聚糖[1]，如低聚異麥芽糖、低聚果糖、低聚木糖等，因具有超強(qiáng)的雙歧桿菌增殖功能而成為一種重要的功能性食品的基料。將功能性低聚糖與酸奶有機(jī)結(jié)合，既保留了酸奶的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和獨(dú)特風(fēng)味，同時(shí)強(qiáng)化了低聚糖的功能特性，非常適合現(xiàn)代人群的消費(fèi)需求。

電子鼻是一種20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的一種分析、識(shí)別和檢測(cè)復(fù)雜嗅覺(jué)和揮發(fā)性成分的儀器。電子鼻主要由傳感器陣列、氣路及測(cè)試腔、數(shù)據(jù)采集設(shè)備及模式識(shí)別算法組成。目前，電子鼻被廣泛應(yīng)用在食品行業(yè)，郭奇慧[2]等應(yīng)用電子鼻區(qū)分不同貨架期的酸奶，研究表明，利用電子鼻的主成分分析法和判別函數(shù)分析法可以準(zhǔn)確的區(qū)分不同貨架期的酸奶。

電子舌技術(shù)是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來(lái)的一種分析、識(shí)別液體成分的智能儀器技術(shù)，它主要由傳感器陣列、信號(hào)處理和模式識(shí)別系統(tǒng)組成，實(shí)現(xiàn)了由儀器“味覺(jué)”對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行的客觀(guān)分析[3]。國(guó)外已經(jīng)開(kāi)始應(yīng)用電子舌技術(shù)進(jìn)行酸奶品質(zhì)評(píng)價(jià)及在線(xiàn)生產(chǎn)監(jiān)測(cè)[4-5]。

本試驗(yàn)利用感官評(píng)價(jià)，結(jié)合電子舌的判別因子分析法、電子鼻的主成分分析法及色差儀分析，對(duì)菌種添加量、葡萄糖添加量、褐變時(shí)間、褐變溫度及復(fù)合低聚糖的最優(yōu)添加量進(jìn)行優(yōu)化分析，以此為低聚糖褐色酸奶工藝配方的確定提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 原料與試劑

原料與試劑：牛奶、娃哈哈純凈水（食品級(jí)），市售；葡萄糖、瓊脂（食品級(jí)），嘉吉亞太食品系統(tǒng)（北京）有限公司；低聚糖（食品級(jí)），北京廣達(dá)恒益科技有限公司；發(fā)酵劑YF-L904（保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌）（發(fā)酵劑），天津?yàn)I海捷成專(zhuān)類(lèi)化工有限公司；氯化鈉、氫氧化鈉（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酚酞（化學(xué)試劑），北京瀛海精細(xì)化工廠(chǎng)；MRS瓊脂培養(yǎng)基（生化試劑），北京廣達(dá)恒益科技有限公司。

1.1.2 儀器

主要儀器：PEN 3.5電子鼻，德國(guó)AIRSENSE公司；AsrreeⅡ/LS16電子舌，法國(guó)Alpha MOS公司；Milli-Q Advantage A10超純水儀，美國(guó)密理博公司；立式壓力滅菌鍋，上海一恒科技有限公司；超凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀制造有限公司；DELTA 320pH計(jì)，上海展儀儀器有限公司；恒溫水浴鍋，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；BSA124S-CW分析天平，廣州市深華生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 褐色酸奶發(fā)酵的工藝流程

原料乳→凈化與標(biāo)準(zhǔn)化→預(yù)熱→化料→均質(zhì)→殺菌→降溫→接菌→發(fā)酵→終止發(fā)酵→冷卻→后熟

購(gòu)買(mǎi)新鮮的原料乳，將其標(biāo)準(zhǔn)化后符合GB19301-2010《生乳食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)定，將原料乳放入60℃的水浴鍋中加熱，在其溫度達(dá)到60℃時(shí)加入0.3%的瓊脂、7%的蔗糖充分溶解15 min，將溶解完成的樣品放入121℃的滅菌鍋中，反應(yīng)25 min后降溫至42℃后加入發(fā)酵劑，于42℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵，當(dāng)發(fā)酵乳pH≤4.6時(shí)終止發(fā)酵，冷卻至20℃后放至4℃冰箱后熟20 h后完成制作。

1.2.2 褐色酸奶中菌種添加量的確定

在蔗糖添加量為7%，葡萄糖添加量為5%，褐變時(shí)間為25 min，褐變溫度為121℃確定的條件下，試驗(yàn)選取菌種接種量為 0.03%、0.07%、0.11%、0.15%、0.19%接種，42℃發(fā)酵至凝乳，當(dāng)酸奶發(fā)酵達(dá)到酸奶發(fā)酵終點(diǎn)p H≤4.6時(shí)，記錄凝乳時(shí)間后放置4℃冰箱后熟20 h。對(duì)后熟結(jié)束的酸奶進(jìn)行電子舌、電子鼻分析，并測(cè)定酸奶的滴定酸度、乳酸菌總數(shù)，以確定最佳的接種量。

1.2.3 葡萄糖添加量與褐變時(shí)間和溫度的關(guān)系的確定

影響美拉德反應(yīng)的主要因素有p H、溫度、糖的種類(lèi)和濃度以及金屬離子。褐色酸奶的獨(dú)特風(fēng)味和色澤取決于美拉德反應(yīng)的程度，而反應(yīng)的程度與產(chǎn)品的顏色直接相關(guān)，即顏色越深美拉德反應(yīng)程度越高，風(fēng)味越濃郁。在白砂糖添加量為7%，菌種添加量在試驗(yàn)設(shè)計(jì)1.2.2中確定量的添加條件下，該試驗(yàn)考察葡萄糖添加量、褐變溫度、褐變時(shí)間的關(guān)系，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，通過(guò)色差儀分析、感官評(píng)價(jià)來(lái)確定最優(yōu)水平。葡萄糖添加量與褐變時(shí)間和溫度因素水平表如表1所示。

表1 葡萄糖添加量、褐變溫度、褐變時(shí)間正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.4 低聚糖添加量的確定

低聚糖褐色酸奶中低聚果糖、低聚木糖、低聚異麥芽糖的添加量水平均參考各低聚糖的日有效攝入量[6]設(shè)計(jì)，其他原料及工藝按上述條件完成。

（1）低聚異麥芽糖添加量的確定。

除蔗糖外，其他組分按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)1.2.2與1.2.3中確定的條件完成。將低聚果糖替代部分蔗糖添加到褐色酸奶中，本試驗(yàn)所用低聚果糖的甜度是蔗糖的0.42倍，蔗糖替代量分別為4.0%，4.5%，5.0%，5.5%，6.0%，即低聚果糖添加量為9.5%、10.7%、11.9%、13.1%、14.3%，以感官評(píng)價(jià)作為試驗(yàn)指標(biāo)來(lái)確定最優(yōu)添加量。

（2）低聚異麥芽糖添加量的確定。

除蔗糖外，其他組分按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)1.2.2與1.2.3中確定的條件完成。本試驗(yàn)所用低聚異麥芽糖的甜度是蔗糖的0.42倍，將低聚異麥芽糖替代部分蔗糖添加到褐色酸奶中，蔗糖替代量分別為2.5%，3.0%，3.5%，4.0%，4.5%，即低聚異麥芽糖的添加量為6.0%、7.1%、8.3%、9.5%、11%，以感官評(píng)價(jià)作為試驗(yàn)指標(biāo)來(lái)確定最優(yōu)添加量。

（3）低聚木糖添加量的確定。

除蔗糖外，其他組分按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)1.2.2與1.2.3中確定的條件完成。本試驗(yàn)所用低聚木糖的甜度是蔗糖的0.42倍，將低聚木糖替代部分蔗糖添加到褐色酸奶中，蔗糖替代量分別為0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%，即低聚木糖的添加量為0.95%、1.43%、1.9%、2.4%、2.9%，以感官評(píng)價(jià)作為試驗(yàn)指標(biāo)來(lái)確定最優(yōu)添加量。

（4）復(fù)合低聚糖的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

研究表明，復(fù)配時(shí)因素之間存在的協(xié)同交互作用可以使酸奶穩(wěn)定效果更佳[7]，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇3因素最優(yōu)添加量的10%，20%，30%分別作為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的1，2，3水平，以電子舌、電子鼻分析，感官評(píng)價(jià)為評(píng)定指標(biāo)，通過(guò)極差分析進(jìn)行復(fù)合低聚糖的優(yōu)化。復(fù)合低聚糖因素水平表如表2所示。

1.3 試驗(yàn)主要指標(biāo)測(cè)定方法

1.3.1 美拉德反應(yīng)程度的測(cè)定

表2 復(fù)合低聚糖正交試驗(yàn)因素水平表

美拉德反應(yīng)又稱(chēng)非酶褐變反應(yīng)，產(chǎn)物呈黃褐色，是食品香味的主要來(lái)源。本文使用色差儀來(lái)測(cè)量樣品的B值，即黃藍(lán)色值。樣品B值越高，褐色越深，代表美拉德反應(yīng)越充分，香味越濃郁。

1.3.2 酸奶滴定酸度的測(cè)量[8]

酸堿滴定法（參照GB5413.34）。

1.3.3 乳酸菌數(shù)的測(cè)定[9]

平板計(jì)數(shù)法（參照GB4789.2）。

1.3.4 產(chǎn)品的感官評(píng)價(jià)

從實(shí)驗(yàn)室教師和同學(xué)中選出對(duì)風(fēng)味具有較強(qiáng)分辨力和較高靈敏度的10人組成評(píng)分小組，對(duì)樣品進(jìn)行評(píng)定前先漱口，且從滋味氣味、口感、組織狀態(tài)、色澤4個(gè)方面逐個(gè)進(jìn)行感官評(píng)定。感官評(píng)價(jià)表如表3所示。

表3 褐色酸奶感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.5 電子鼻對(duì)低聚糖褐色酸奶的測(cè)定

取發(fā)酵完成的低聚糖褐色酸奶樣品各1 mL于電子鼻檢測(cè)專(zhuān)用玻璃瓶中，密封后在室溫下靜置30 min后進(jìn)行電子鼻的檢測(cè)。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)定。載氣為空氣，速度為300 mL/min。頂空獲取時(shí)間為60 s，延滯180 s，選取48 s～52 s較平穩(wěn)的階段進(jìn)行信息采集，用儀器自帶軟件進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

1.3.6 電子舌對(duì)低聚糖褐色酸奶的測(cè)定

分別取發(fā)酵完成的低聚糖褐色酸奶樣品1 mL，加入99 mL超純水稀釋?zhuān)尤敫蓛舻碾娮由鄬?zhuān)用燒杯中待測(cè)。電子舌托盤(pán)上分別放有10個(gè)專(zhuān)用燒杯，其中1、3、5、7、9號(hào)燒杯放超純水，2、4、6、8、10號(hào)燒杯放稀釋后的樣品。檢測(cè)時(shí)，每個(gè)樣品測(cè)定7次，從中選取較為穩(wěn)定的4次數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。用儀器自帶軟件進(jìn)行判別因子分析（discriminant function analysis，DFA）。

表4 電子鼻傳感器性能描述

1.4 數(shù)據(jù)處理

對(duì)10人的感官評(píng)分結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果取平均值。本試驗(yàn)采用excel2013進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種添加量對(duì)褐色酸奶的影響

表5 酸奶發(fā)酵過(guò)程指標(biāo)監(jiān)測(cè)結(jié)果

從表5中結(jié)果可以看出：菌種添加量在0.03%與0.07%的情況下，酸奶的凝乳時(shí)間太長(zhǎng)且后熟結(jié)束酸奶的滴定酸度與乳酸菌數(shù)達(dá)不到《GB 19302-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》的要求，而菌種添加量在0.11%、0.15%、0.19%的情況下，酸奶的凝乳時(shí)間，后熟結(jié)束后的滴定酸度，乳酸菌總數(shù)相差不大。

圖1 菌種添加量電子鼻測(cè)定結(jié)果

由圖1可知，橫坐標(biāo)為第一主成分貢獻(xiàn)率90.30%，縱坐標(biāo)為第二主成分貢獻(xiàn)率8.93%，兩個(gè)主成分貢獻(xiàn)率的和為99.23%，大于90%，所以這個(gè)主成分已經(jīng)基本代表了樣品的主要信息特征。圖中的圓形是由一種樣品的三個(gè)平行樣形成。圓形越大，代表平行樣品之間的差異就越大。圓形之間的覆蓋部分越多，代表樣品之間的差異越小。從圖中可以看出樣品A與B、C、D、E之間無(wú)重疊部分，說(shuō)明其A與其他樣品之間對(duì)酸奶的氣味影響差異顯著（P＜0.05），樣品D、E之間完全重疊，說(shuō)明兩者之間無(wú)顯著性差異。結(jié)果表明，菌種添加量的不同，酸奶氣味存在著一定程度上的差異，且菌種添加量差異越大，酸奶氣味差異性越大。

圖2 菌種添加量電子舌測(cè)定結(jié)果

由圖2可知，第一主成分貢獻(xiàn)率為79.909%，第二主成分貢獻(xiàn)率為18.022%，兩個(gè)主成分貢獻(xiàn)率的和為97.931%，大于90%，所以這個(gè)主成分已經(jīng)基本代表了樣品的主要信息特征[10]。圖中每一個(gè)圖形代表一種樣品，其中4個(gè)點(diǎn)代表4個(gè)平行樣品，圖形較小說(shuō)明樣品的平行性較好。由圖中可以看出樣品的圖形大小不一，但整體顯示樣品平行性良好。圖中5個(gè)樣品相互分離，說(shuō)明兩兩之間存在差異，兩者之間距離越大，說(shuō)明差異性越大。從圖中可以看出，B與C、D之間差異性較小，說(shuō)明他們滋味相近；與A、E之間差異性較大，說(shuō)明他們之間滋味相差較遠(yuǎn)。

GB19302中規(guī)定，后熟結(jié)束的酸奶，酸奶的滴定酸度達(dá)到72°T以上，乳酸菌菌落數(shù)達(dá)到106以上，根據(jù)電子鼻、電子舌的測(cè)定結(jié)果、酸奶發(fā)酵過(guò)程監(jiān)測(cè)指標(biāo)及經(jīng)濟(jì)效益的情況下，確定酸奶的菌種最優(yōu)添加量為0.11%。

2.2 葡萄糖添加量、褐變時(shí)間、褐變溫度的關(guān)系

由表6可知，對(duì)于B值而言，影響因素重要性大小依次排序是褐變溫度＞褐變時(shí)間＞葡萄糖添加量，樣品的黃藍(lán)值（B值）代表了美拉德反應(yīng)的程度，B值越大，代表美拉德反應(yīng)越充分，結(jié)果顯示，最優(yōu)組合是A3B3C2。但是B值太大代表褐色太深，會(huì)影響產(chǎn)品的感官效果。對(duì)于感官評(píng)價(jià)，影響因素重要性大小依次是褐變溫度＞葡萄糖添加量＞褐變時(shí)間，根據(jù)感官評(píng)價(jià)得分，其最優(yōu)組合是A2B3C1。所以，結(jié)合感官評(píng)價(jià)，考慮到生產(chǎn)成本和市場(chǎng)效益的情況下，確定最優(yōu)組合為A2B3C1，即葡萄糖添加量為5%、褐變溫度121℃、褐變時(shí)間25 min。

2.3 低聚糖添加量的確定

2.3.1 低聚果糖添加量的確定

由表7可知，隨著低聚果糖的添加量不斷增加，產(chǎn)品的感官評(píng)分值也在不斷增加，當(dāng)其添加量為11.9%時(shí)，該產(chǎn)品的滋味氣味、色澤、口感及組織狀態(tài)均達(dá)到最佳水平；當(dāng)其添加量大于11.9%并繼續(xù)增加時(shí)，該產(chǎn)品的感官評(píng)價(jià)值開(kāi)始下降，且有沉淀產(chǎn)生，口感變差。因此，根據(jù)感官評(píng)價(jià)結(jié)果確定低聚果糖的最優(yōu)添加量為11.9%，在此添加量的情況下發(fā)酵完成的褐色酸奶口感最佳，最適宜享用。

表6 葡萄糖添加量、褐變時(shí)間、褐變溫度正交試驗(yàn)分析結(jié)果

表7 低聚果糖添加量的感官結(jié)果

2.3.2 低聚木糖的添加量

表8低聚木糖添加量的感官結(jié)果

由表8可知，產(chǎn)品的感官評(píng)價(jià)得分隨著低聚木糖添加量的增加先上升后下降，在添加量為1.43%時(shí)，產(chǎn)品感官品質(zhì)達(dá)到最佳，此時(shí)的產(chǎn)品發(fā)酵乳香味濃郁，黏稠度適宜，均勻細(xì)膩，有光澤；當(dāng)?shù)途勰咎翘砑恿看笥?.43%并繼續(xù)升高時(shí)，產(chǎn)品感官品質(zhì)開(kāi)始開(kāi)始下降，而且添加量越大，出現(xiàn)沉淀的情況越嚴(yán)重。因此，根據(jù)感官評(píng)定結(jié)果確定低聚木糖的最優(yōu)添加量為1.43%，在此添加量的情況下發(fā)酵完成的褐色酸奶口感最佳，最適宜享用。

2.3.3 低聚異麥芽糖的添加量

表9 低聚異麥芽糖添加量的感官結(jié)果

由表9可知，隨著低聚異麥芽糖添加量增加到9.5%時(shí)，產(chǎn)品感官評(píng)價(jià)得分不斷上升，產(chǎn)品的發(fā)酵乳香、黏稠度、口感、色澤逐漸變好直至達(dá)到最優(yōu)狀態(tài)；但當(dāng)?shù)途郛慃溠刻翘砑恿看笥?.5%時(shí)，感官評(píng)價(jià)得分出現(xiàn)下降，產(chǎn)品出現(xiàn)塊狀物質(zhì)。低聚異麥芽糖本身有特殊的味道，口感沒(méi)有蔗糖純正，所以感官評(píng)價(jià)還要避免顯出低聚異麥芽糖本身的味道。因此，根據(jù)感官評(píng)價(jià)結(jié)果確定低聚異麥芽糖的最優(yōu)添加量為9.5%，在此添加量的情況下發(fā)酵完成的褐色酸奶口感最佳，最適宜享用。

2.3.4 復(fù)合低聚糖的添加量

圖3 復(fù)合低聚糖電子鼻測(cè)定結(jié)果

由圖3可知，橫坐標(biāo)第一主成分貢獻(xiàn)率為75.35%，縱坐標(biāo)第二主成分貢獻(xiàn)率為14.77%，兩個(gè)主成分貢獻(xiàn)率的和為90.12%，大于90%，所以這個(gè)主成分已經(jīng)基本代表了樣品的主要信息特征。圖中的圓形是由一種樣品的3個(gè)平行樣形成。圓形越大，代表平行樣品之間的差異就越大。圓形之間的覆蓋部分越多，代表樣品之間的差異越小。從圖中可以看出樣品3與4、5與6之間無(wú)顯著性差異，說(shuō)明其兩者添加量之間對(duì)酸奶的氣味影響不顯著，其余樣品兩兩之間存在一定差異。說(shuō)明不同的復(fù)合低聚糖添加量對(duì)酸奶的氣味影響是存在差異的。

由圖4可知，第一主成分貢獻(xiàn)率為87.142%，第二主成分貢獻(xiàn)率為10.777%，兩個(gè)主成分貢獻(xiàn)率的和為97.919%，大于90%，所以這個(gè)主成分已經(jīng)基本代表了樣品的主要信息特征。圖中每一個(gè)圖形代表一種樣品，其中4個(gè)點(diǎn)代表4個(gè)平行樣品，圖形較小說(shuō)明樣品的平行性較好。由圖中可以看出樣品的圖形大小不一，但整體顯示樣品平行性良好。圖中9個(gè)樣品相互分離，說(shuō)明兩兩之間存在差異，兩者之間距離越大，說(shuō)明差異性越大。樣品6、7、8分別于樣品1、2、3、4、5、9之間距離較大，說(shuō)明他們之間滋味差異較大；樣品6、7，樣品1、4，樣品2、3、5、9他們分別處于同一個(gè)區(qū)域，說(shuō)明他們滋味相近。

圖4 復(fù)合低聚糖電子舌測(cè)定結(jié)果

表10 復(fù)合低聚糖正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)表10極差分析可知，3種低聚糖對(duì)褐色酸奶品質(zhì)的影響順序?yàn)锳＞B＞C，即低聚果糖＞低聚木糖＞低聚異麥芽糖。低聚果糖與低聚木糖R值相近，對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)影響顯著，而低聚異麥芽糖的R值較小，對(duì)產(chǎn)品的品質(zhì)有一定影響。通過(guò)K值大小，結(jié)合電子鼻、電子舌的分析確定復(fù)合低聚糖的最優(yōu)水平組合是A2B2C3，即低聚果糖的添加量為2.38%、低聚木糖添加量為0.286%、低聚異麥芽糖的添加量為2.85%時(shí)制得的低聚糖褐色酸奶發(fā)酵乳香味濃郁、酸甜適中、黏稠度適宜、產(chǎn)品細(xì)膩無(wú)異味，且具有均勻一致的褐色、有光澤、口感好。

3 結(jié)論

通過(guò)感官評(píng)價(jià)、電子鼻、電子舌、色差儀的測(cè)定分析，試驗(yàn)對(duì)低聚糖褐色酸奶的基礎(chǔ)配方及工藝條件做了優(yōu)化，確定低聚糖褐色酸奶的配方及工藝條件，即菌種添加量為0.11%，葡萄糖添加量為5%，低聚果糖添加量為2.380%，低聚木糖添加量為0.286%，低聚異麥芽糖添加量為2.850%，蔗糖添加量為1.484%，褐變時(shí)間為25 min，褐變溫度為121℃。該酸奶的功能特性還有待進(jìn)一步分析測(cè)試。