溫光誘導(dǎo)下甜菜抽薹和開花相關(guān)基因的AFLP研究

梁乃國，程大友，崔 杰，代翠紅，羅成飛

(1.淮陰工學(xué)院，江蘇 淮安 223002；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，哈爾濱 150001)

0 前言

糖甜菜屬于長日照(long-day，LD，16 h/8 h)二年生作物，第一年為營養(yǎng)生長，形成肥大的塊根，第二年為生殖生長，抽薹、開花和結(jié)籽。但在糖甜菜生產(chǎn)實踐中，常常出現(xiàn)當年抽薹開花的現(xiàn)象，即：早抽薹。早抽薹對甜菜塊根的質(zhì)量和產(chǎn)量均有不同程度的影響。研究發(fā)現(xiàn)早抽薹糖甜菜根的重量，含糖量，清汁純度和可回收的糖含量均顯著降低，阻礙蔗糖結(jié)晶的有害成分如K+、Na+和α-N則明顯增加。并且早抽薹糖甜菜根部解剖結(jié)構(gòu)分析顯示維管束環(huán)數(shù)較正常植株顯著減少、根的木質(zhì)化程度嚴重、纖維化明顯，所以早抽薹糖甜菜在制糖工業(yè)生產(chǎn)上加工價值極低。本課題研究的目的是明確甜菜在春化和光周期條件下抽薹、開花過程中差異基因表達，為進一步明確溫度和光周期誘導(dǎo)甜菜抽薹、開花的分子機制提供前期基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 生物材料

甜菜品系DY14-O來源于哈爾濱工業(yè)大學(xué)甜菜課題組。

2.2 方法

2.2.1 生物材料

生物材料2014年5月播種DY5-O甜菜種子，于2014年10月初收獲母根，選取100株生長健康根重大約700-850 g的甜菜母根100株沿著生長點平均切瓣，共200瓣，100瓣春化(4-5℃)處理16周(16 W)，100瓣非春化處理16周(16 W)，隨后移栽到試驗田中，100瓣春化甜菜中的50瓣長日照(VLD)(光照16 h/黑暗8 h)條件下生長，另50瓣短日照(VSD)(光照8 h/黑暗16 h)條件下生長。100瓣非春化甜菜中的50瓣長日照(NVLD)(光照16 h/黑暗8 h)條件下生長，另50瓣短日照(NVSD)(光照8 h/黑暗16 h)條件下生長。間隔5天采集一次葉片，直至開花時停止采集葉片。

2.2.2 甜菜總RNA提取

使用全式金TransZolTMPlant RNA試劑盒提取RNA.使用1.0%的瓊脂糖凝膠和Bio Drop Lite PC超微量可見紫外光分光光度計檢測RNA質(zhì)量和濃度，合格的RNA樣品使用Trans Script One-step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒發(fā)轉(zhuǎn)錄成cDNA。

2.2.4 雙鏈cDNA的純化

(1)向終止反應(yīng)的離心管中，移入180 μL的苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，旋渦振蕩5-10秒混勻。室溫下15 000 rpm離心1 min，轉(zhuǎn)移水層到新的離心管中。

(2)加入180 μL的氯仿/異戊醇(24∶1)，旋渦振蕩5-10秒混勻。室溫下15 000 rpm離心1 min，轉(zhuǎn)移水層到新的離心管中。

(3)加入10 mol的乙酸銨60 μL。加入2.5倍體積的乙醇(600 μL)混勻，室溫放置10 min。

(4)4℃下15 000 rpm離心15 min，棄掉上清液，注意不要吸取沉淀。加入70%的乙醇4℃下15 000 rpm離心5 min。

(5)去除上清液，干燥沉淀。用TE buffer溶解沉淀，儲存在-20℃冰箱中。

2.2.5 cDNA的雙酶切

選擇EcoR I和Mse I作為雙酶切體系的酶，先用EcoR I酶切雙鏈cDNA，再用Mse I進行酶切，酶切體系如表1所示。

表1 cDNA酶切體系

酶切程序如表2所示。

表2 酶切程序

取5 μL酶切產(chǎn)物1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.2.6 寡聚核苷酸接頭的連接

單鏈接頭需要進行變性和復(fù)性形成雙鏈接頭，接頭序列見表3。變性和復(fù)性過程為將水浴鍋加熱至95℃進行變性，加入接頭溶液MseI溶液(各25 μL)和EcoRI溶液(各10 μL，加水稀釋至50 μL)，水浴15 min，取出室溫緩慢冷卻至25℃，置于4℃冰箱中保存。

表3 接頭序列

2.2.7 cDNA的預(yù)擴增和選擇性擴增

將連接產(chǎn)物稀釋10倍，用于PCR預(yù)擴增，再將PCR預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋100倍，作為選擇性PCR擴增的模板。選擇性PCR擴增的引物序列見表4。

表4 AFLP選擇性擴增引物

選擇性擴增采用Touchdown PCR程序，程序設(shè)定如表5所示。

2.2.8 聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染

聚丙烯酰胺變性凝膠的配制方法、電泳方法和銀染方法，以及后續(xù)的目的條帶回收和感受態(tài)細胞的制備等參照本實驗室孟祥雯的方法[30]。

2.2.9 測序結(jié)果比對分析

將測序的結(jié)果在NCBI (National Center for Biotechnology Information)美國國立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站進行比對和分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 抽薹和開花統(tǒng)計分析

春化作用誘導(dǎo)甜菜抽薹，沒有經(jīng)過春化處理的甜菜不抽薹保持營養(yǎng)生長狀態(tài)；甜菜抽薹后在長日照光周期條件下出現(xiàn)開花性狀，而在短日照光周期條件下只抽薹不開花；非春化處理的甜菜無論在長日照還是短日照光周期條件下，均處于營養(yǎng)生長狀態(tài)，如表6所示。

表6 甜菜抽薹和開花統(tǒng)計分析

3.2 樣品預(yù)擴增結(jié)果

從春化長日照和短日照甜菜16 W、19 W、20 W時期和非春化長日照和短日照甜菜16 W、19 W、20 W時期甜菜葉片中提取甜菜總RNA，然后將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，再用EcoR I和Mse I內(nèi)切酶對cDNA進行雙酶切，將酶切產(chǎn)物進行寡聚核苷酸接頭連接，再將連接產(chǎn)物稀釋10倍，PCR預(yù)擴增。

3.3 甜菜葉片中基因表達差異

應(yīng)用256對引物組合對春化長日照、春化短日照、非春化長日照和非春化短日照甜菜三個發(fā)育時期葉片中的cDNA進行AFLP分析，發(fā)掘差異表達基因，共檢測到372個差異基因片段，擴增片段長度在65-700 bp之間。對差異表達的基因片段進行3次重復(fù)實驗驗證，

發(fā)現(xiàn)49條為假陽性片段，對323條表達較強的差異片段進行回收、克隆并測序，菌液PCR擴增結(jié)果如圖1所示。成功測序的有286條，經(jīng)驗證發(fā)現(xiàn)20條為假陽性片段，剩余的266條序列在甜菜數(shù)據(jù)庫中比對分析，所得結(jié)果按照NCBI數(shù)據(jù)庫中的功能和參與的生物途徑分類。

M：DL2000，A：春化長日照16 W，B：春化短日照16 W，C：非春化長日照16 W，D：非春化短日照16 W，E：春化長日照19 W，F(xiàn)：春化短日照19 W，G：非春化長日照19 W，H：非春化短日照19 W，I：春化長日照20 W，J：春化短日照20 W，K：非春化長日照20 W，L：非春化短日照20 W。圖1 甜菜葉片cDNA目的條帶菌液PCR電泳圖

3.4 葉片中差異基因的同源性比對分析

3.4.1 不同處理條件下16 W時期葉片中差異基因分析

春化長日照、春化短日照、非春化長日照和非春化短日照16 W時期葉片中共篩選出63個差異片段，其中春化長日照23個、春化短日照14個、非春化長日照11個、非春化短日照15個。在NCBI數(shù)據(jù)庫中通過Nucleotide BLAST比對分析進行功能分類發(fā)現(xiàn)8個基因與催化作用相關(guān)、5個基因與光合作用相關(guān)、3個基因與運輸作用相關(guān)、3個基因與激活位點相關(guān)(圖2)。通過NCBI數(shù)據(jù)庫對16 W時期的差異基因進行生物途徑分析，發(fā)現(xiàn)3個基因參與氧化磷酸化和代謝途徑、2個基因參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的加工、2個基因參與光合天線蛋白質(zhì)途徑、2個基因參與核糖體途徑、4個基因參與光合作用代謝途徑、2個基因參與光合生物中碳固定和碳代謝途徑、1個基因參與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑見圖3所示。

注：a：功能未知b：激活位點c：ATP相關(guān)d：催化作用e：光合作用f：運輸因子g：核糖體h：F-box相關(guān)i：DNA和RNA 螺旋酶超家族II j：DNA結(jié)合k：鐵氧還蛋白l：疏水腔m：AP2/ERF家族n：生長素流入通透酶o：組蛋白家族p：漿膜。圖2 不同處理條件下甜菜16W時期的差異基因的功能分類

注：A：氧化磷酸化代謝途徑B：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的加工途徑C：光合作用天線蛋白途徑D：核糖體途徑E：氨基糖和核苷酸糖代謝途徑F：組氨酸的生物合成途徑G：光合作用途徑H：植物病原體相互作用途徑I：光合生物體中的碳固定和碳代謝途徑J：胞吞作用K：MAPK 信號途徑 L：植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑M：未表征的途徑。 圖3 不同處理條件下甜菜16 W時期差異基因的生物途徑分析

3.4.2 不同處理條件下19 W時期葉片中差異基因分析

春化長日照、春化短日照、非春化長日照和非春化短日照19 W時期共得到86個差異片段，其中春化長日照28個、春化短日照17個、非春化長日照19個、非春化短日照22個。基因功能分類發(fā)現(xiàn)4個基因與組蛋白相關(guān)、7個基因與運輸作用相關(guān)、4個基因與DNA結(jié)合作用相關(guān)、1個基因與赤霉素調(diào)節(jié)相關(guān)?；虻纳锿緩椒治霭l(fā)現(xiàn)5個基因參與苯丙素生物合成和代謝途徑、3個基因參與異喹啉生物堿生物合成和代謝途徑、4個基因參與生物鐘途徑(圖4)。

注：A：脫落酸生物合成和代謝途徑B：氧化磷酸化和代謝途徑C：氨酰-tRNA生物合成途徑D：核糖體途徑E：苯丙素生物合成和代謝途徑F：氨基酸的生物合成途徑G：光合作用和代謝途徑H：光合作用天線蛋白途徑I：谷胱甘肽代謝途徑J：異喹啉生物堿的生物合成和代謝途徑K：核黃素代謝途徑L：淀粉和蔗糖代謝途徑M：泛素介導(dǎo)的蛋白水解途徑N：RNA運輸途徑O：晝夜節(jié)律P：未表征的途徑。圖4 不同處理條件下甜菜19 W時期差異基因的生物途徑分析

3.4.3 不同處理條件下20W時期葉片中差異基因分析

春化長日照，春化短日照，非春化長日照和非春化短日照20 W時期的差異片段共117個，其中春化長日照現(xiàn)20 W時期32個、春化短日照42個、非春化長日照22個、非春化短日照21個?；蚬δ芊诸惏l(fā)現(xiàn)3個基因與跨膜作用相關(guān)、3個基因與催化作用相關(guān)、5個基因與運輸作用相關(guān)、3個基因與磷酸合成酶相關(guān)、3個基因光合作用相關(guān)、6個基因與伸長因子相關(guān)。基因的生物途徑分析發(fā)現(xiàn)3個基因參與淀粉和蔗糖代謝途徑、3個基因參與鞘氨醇生物合成和鞘脂代謝途徑、6個基因參與光合天線蛋白途徑、3個基因參與谷胱甘肽代謝途徑、5個基因參與氨基酸的生物合成途徑、5個基因參與RNA運輸途徑、4個基因參與植物病原體相互作用途徑見圖5。

注：A：胞吞作用B：氨基糖和核苷酸糖代謝途徑C：核糖體D：泛醌和其他萜類醌生物合成E：淀粉和蔗糖途徑F：碳代謝途徑G：鞘氨醇生物合成和鞘脂代謝途徑H：光合天線蛋白質(zhì)途徑I：氨基酸的生物合成和碳代謝途徑J：絲氨酸生物合成途徑K：RNA聚合酶途徑途徑L：光合作用和代謝途徑M：組氨酸生物合成途徑N：谷胱甘肽代謝途徑O：異喹啉生物堿生物合成途徑P：氨基酸的生物合成途徑Q：RNA運輸途徑R：植物病原體相互作用S：未表征的途徑。圖5 不同處理條件下甜菜芽期20W時期差異基因的生物途徑分析

3.4.4 16 W和19 W時期葉片中差異基因的比較分析

不同處理條件下甜菜16 W時期差異基因63個、19 W時期86個，對16 W和19 W時期葉片中差異基因的功能分類發(fā)現(xiàn)二酮古洛糖酸還原酶、激活作用、DNA和RNA解旋酶超家族II、鐵氧還蛋白、疏水腔、核酮糖二磷酸羧化酶、AP2/ERF家族、生長素流入通透酶、漿膜蛋白基因是16 W時期特有的；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的加工途徑、氨基糖和核苷酸糖代謝途徑、植物病原體相互作用途徑、光合生物的碳固定和碳代謝途徑、胞吞作用途徑、MAPK信號通路途徑、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是16 W時期特有的?？缒?、磷酸合成酶、光依賴性、茉莉酸誘導(dǎo)和赤霉素調(diào)節(jié)蛋白基因是19 W時期特有的；β-胡蘿卜素生物合成途徑、氨酰-tRNA的生物合成途徑、苯丙素生物合成途徑、谷胱甘肽代謝途徑、異喹啉生物堿生物合成途徑、核黃素代謝途徑、淀粉和蔗糖代謝途徑、泛素介導(dǎo)的蛋白水解途徑、RNA運輸途徑和生物鐘調(diào)節(jié)途徑是甜菜19 W時期特有的。

3.4.5 19 W和20 W時期葉片中差異基因的比較分析

不同處理條件下甜菜19 W和20 W時期差異基因比較分析，發(fā)現(xiàn)赤霉素調(diào)節(jié)蛋白基因是19 W時期特有的；脫落酸生物合成，β-胡蘿卜素生物合成途徑、氧化磷酸化和代謝途徑、氨酰-tRNA的生物合成途徑、苯丙素生物合成途徑、異喹啉生物堿生物合成途徑、核黃素代謝途徑、泛素介導(dǎo)的蛋白水解途徑、生物鐘調(diào)節(jié)途徑是甜菜19周時期特有的。伸長因子、跨膜氨基酸運輸?shù)鞍住⒃~綠素酸酯還原酶和脂肪酸羥化酶相關(guān)基因是甜菜20 W時期特有的；胞吞作用、氨基糖和核苷酸糖代謝途徑、泛醌和其它萜類醌生物合成和代謝途徑、碳代謝途徑、鞘氨醇生物合成和鞘脂代謝途徑、氨基酸的生物合成和碳代謝途徑、絲氨酸的生物合成途徑、RNA聚合酶途徑和植物病原體相互作用途徑是甜菜20 W時期特有的。

3.4.6 春化相關(guān)基因分析

春化長日照甜菜16 W時期與非春化長日照甜菜16 W時期的差異基因比對分析，刪除共有基因；春化短日照甜菜16 W時期與非春化短日照甜菜16 W時期的差異基因比對分析，刪除共有基因，剩余58個基因為春化相關(guān)基因。春化相關(guān)基因的功能分類發(fā)現(xiàn)3個基因與ATP相關(guān)、6個基因與催化作用相關(guān)、3個基因與運輸作用相關(guān)、4個基因與光合作用相關(guān)、3個基因與核酮糖二磷酸羧化酶蛋白質(zhì)相關(guān)、1個基因與生長素運輸作用相關(guān)，如圖6所示。對春化相關(guān)基因的生物途徑分類發(fā)現(xiàn)3個基因參與氧化磷酸化代謝途徑、2個基因參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的加工途徑、4個基因參與光合作用和代謝途徑、1個基因參與苯丙素生物合成和代謝途徑、1個基因參與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、34個基因的生物途徑未知。

注：a：功能未知b：ATP相關(guān)c：催化作用d：DNA結(jié)合e：運輸因子f：核糖體g：NADH-泛醌氧化還原酶h：磷酸乙酰葡糖胺變位酶i：光合作用j：激活位點k：F-box相關(guān)l：鐵氧還蛋白m：疏水腔n：核酮糖二磷酸羧化酶o：生長素轉(zhuǎn)運蛋白p：組蛋白家族q：漿膜蛋白。圖6 春化相關(guān)基因的功能分類

3.4.7 光周期相關(guān)基因分析

春化長日照與春化短日照16 W時期甜菜葉片中的差異基因比對分析，非春化長日照與非春化短日照16 W時期葉片中的差異基因比對分析，結(jié)果為Ⅰ；春化長日照與春化短日照19 W時期甜菜葉片中的差異基因比對分析，非春化長日照與非春化短日照19 W時期甜菜葉片中的差異基因比對分析，結(jié)果為Ⅱ；將分析結(jié)果Ⅰ與分析結(jié)果Ⅱ再次進行比對分析，選出共有的差異基因，結(jié)果為Ⅲ；非春化長日照與非春化短日照20 W時期甜菜葉片中的差異基因比對分析，將20 W時期的分析結(jié)果與分析結(jié)果Ⅱ比對分析，選出共有的差異基因，結(jié)果為Ⅳ；將Ⅲ和Ⅳ再進行比對分析，篩選出21個光周期相關(guān)基因。功能分類發(fā)現(xiàn)3個基因與運輸作用相關(guān)、2個基因與ATP相關(guān)。光周期相關(guān)基因的生物途徑分類發(fā)現(xiàn)1個基因參與光合作用和代謝途徑、1個基因參與脫落酸的生物合成和β-胡蘿卜素的生物合成途徑，如圖7所示。

注：A：組氨酸生物合成途徑B：絲氨酸的生物合成和碳代謝途徑C：光合作用代謝途徑D：脫落酸生物合成和β-胡蘿卜素代謝途徑E：氧化磷酸化和代謝途徑F：核糖體途徑G：未表征的途徑。圖7 光周期相關(guān)基因的生物途徑分析

3.4.8 抽薹相關(guān)基因分析

春化長日照甜菜19 W時期的差異基因與春化長日照16 W時期的差異基因比對分析，去除共有的基因；春化短日照甜菜19 W時期的差異基因與春化短日照16 W時期的差異基因比對分析；春化短日照甜菜19 W時期的差異基因與非春化短日照19 W時期的差異基因比對分析；將三組比對分析的結(jié)果匯總，去除春化長日照與短日照16 W時期的差異基因和非春化短日照19 W時期的差異基因，最后得到甜菜抽薹相關(guān)基因共40個。抽薹相關(guān)基因的功能分類發(fā)現(xiàn)5個基因與DNA結(jié)合作用相關(guān)。抽薹相關(guān)基因的生物途徑分類發(fā)現(xiàn)1個基因參與谷胱甘肽代謝途徑、4個基因參與苯丙素生物合成和代謝途徑、4個基因參與生物鐘調(diào)節(jié)途徑，如圖8所示。

注：A：光合作用天線蛋白途徑B：谷胱甘肽代謝途徑C：異喹啉生物堿的生物合成和代謝途徑D：核黃素代謝途徑E：淀粉和蔗糖代謝途徑F：RNA運輸途徑G：泛素介導(dǎo)的蛋白水解/Cul3-SPOP復(fù)合物H：苯丙素生物合成和代謝途徑I：晝夜節(jié)律J：未表征的途徑。圖8 抽薹相關(guān)基因的生物途徑分析

3.4.9 開花相關(guān)基因分析

春化長日照和短日照甜菜生長到19 W時期均出現(xiàn)抽薹性狀，當春化長日照甜菜生長到20 W時出現(xiàn)開花表現(xiàn)型，而春化短日照甜菜在20 W時期只抽薹不開花，將春化長日照甜菜20 W時期的差異基因與春化短日照20 W時期差異基因比對分析，去除共有基因，再去除春化短日照20 W時期的差異基因，最后得到開花相關(guān)基因共30個，如表7所示。開花相關(guān)基因的功能分類發(fā)現(xiàn)6個基因與DNA結(jié)合作用相關(guān)。開花相關(guān)基因的生物途徑分類發(fā)現(xiàn)2個基因參與淀粉和蔗糖代謝途徑、3個基因參與鞘氨醇生物合成和鞘脂代謝途徑，如圖9所示。

表7 開花相關(guān)的差異條帶編號，功能注釋和染色體定位

續(xù)表7

注：A：氨基糖和核苷酸糖代謝途徑B：核糖體途徑C：泛醌和其他萜類醌生物合成途徑D：淀粉和蔗糖代謝途徑E：碳代謝途徑F：鞘氨醇生物合成和鞘脂代謝途徑G：光合作用天線蛋白途徑H：未表征的途徑。圖9 開花相關(guān)基因的生物途徑分析

4 結(jié)論

本文采用AFLP分子標記技術(shù)對春化長日照，春化短日照，非春化長日照和非春化短日照甜菜16 W、19 W和20 W三個發(fā)育時期葉片中的cDNA進行分子差異分析，獲得如下結(jié)論：

(1)春化相關(guān)基因共58個。其中3個基因與ATP相關(guān)、6個基因與催化作用、3個基因與運輸作用相關(guān)、4個基因與光合作用相關(guān)、3個基因與核酮糖二磷酸羧化酶蛋白質(zhì)相關(guān)；生物途徑分析發(fā)現(xiàn)3個基因參與氧化磷酸化和代謝途徑、2個基因參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的加工途徑、2個基因參與光合天線蛋白途徑、2個基因參與核糖體途徑、4個基因參與光合作用途徑、2個基因參與光合生物的碳固定和碳代謝途徑、1個基因參與苯丙素生物合成和代謝途徑、1個基因參與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

(2)光周期相關(guān)基因共21個。3個基因與運輸作用相關(guān)、2個基因與ATP相關(guān)；生物途徑分析發(fā)現(xiàn)1個基因參與組氨酸生物合成和代謝途徑、1個基因參與絲氨酸生物合成和碳代謝途徑、1個基因參與光合作用和代謝途徑、1個基因參與脫落酸的生物合成和β-胡蘿卜素生物合成途徑、1個基因參與氧化磷酸化和代謝途徑、1個基因參與核糖體途徑。

(4)抽薹相關(guān)基因共40個。5個基因與DNA結(jié)合相關(guān)、2個基因與運輸作用相關(guān)、2個基因與組蛋白相關(guān)、2個基因與跨膜蛋白相關(guān)；抽薹相關(guān)基因的生物途徑分析發(fā)現(xiàn)1個基因參與谷胱甘肽代謝途徑、2個基因參與異喹啉生物堿生物合成和代謝途徑、2個基因參與核黃素代謝途徑、1個基因參與淀粉和蔗糖代謝途徑、4個基因參與苯丙素的生物合成和代謝途徑、4個基因參與生物鐘調(diào)節(jié)途徑。

(5)開花相關(guān)基因共30個。2個基因與催化作用相關(guān)、2個基因與運輸作用相關(guān)、6個基因與DNA結(jié)合作用相關(guān)；開花相關(guān)基因的生物途徑分析發(fā)現(xiàn)2個基因參與氨基糖和核苷酸糖代謝途徑、2個基因參與泛醌和其它萜類醌類生物合成途徑、2個基因參與淀粉和蔗糖代謝途徑、2個基因參與碳代謝途徑、3個基因參與鞘氨醇生物合成和鞘脂代謝途徑。

致謝：

感謝“國家科技技術(shù)基礎(chǔ)平臺-國家地球系統(tǒng)科學(xué)數(shù)據(jù)共享平臺-東北黑土科學(xué)數(shù)據(jù)中心(http://northeast.geodata.cn)”提供數(shù)據(jù)支撐。