羅義輝　陳佳　徐金娥

摘要：為建立蔬菜中殺螟松殘留快速檢測(cè)方法，首先測(cè)定前期通過核糖體展示篩選所獲得的抗殺螟松單鏈抗體的親和力以及該抗體與其他有機(jī)磷農(nóng)藥的交叉反應(yīng)率，然后建立基于該抗體的酶聯(lián)免疫分析（ELISA）測(cè)定實(shí)際蔬菜樣品中殺螟松殘留的方法。研究表明：?jiǎn)捂溈贵wScFv-AF132與殺螟松的解離平衡常數(shù)為2.66×10-10 mol/L，與其他有機(jī)磷農(nóng)藥的交叉反應(yīng)率≤0.17%。測(cè)得3種重慶市市售蔬菜的殺螟松殘留，分別為0.532、0.004 21、0.235 mg/kg。樣本添加回收率試驗(yàn)顯示，平均回收率介于90.3%～112.8%，RSD（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差）≤2.26%，說明本方法可靠，能在實(shí)際蔬菜樣品殺螟松殘留的快速檢測(cè)中得到應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：殺螟松;有機(jī)磷檢測(cè);單鏈抗體;ELISA;交叉反應(yīng)率;回收率;殘留;回收率

中圖分類號(hào)： O657.71文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）19-0200-03

收稿日期：2018-07-18

基金項(xiàng)目：國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（編號(hào)：2012104003）。

作者簡(jiǎn)介：羅義輝（1966—），男，四川武勝人，博士，講師，主要從事有害化學(xué)品快速檢測(cè)研究。E-mail：383620115@qq.com。

通信作者：徐金娥，碩士，講師，主要從事圖書出版與生物信息學(xué)研究。E-mail：915847121@qq.com。

殺螟松又名殺螟硫磷，化學(xué)名稱為O，O-二甲基-O-（3-甲基-4-硝基苯基）硫代磷酸酯，是常用的有機(jī)磷殺蟲劑之一，毒性中等。有機(jī)磷殺蟲劑廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，因?yàn)樗哂懈呋钚?、易降解等?yōu)點(diǎn)。同時(shí)，農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)磷殺蟲劑等農(nóng)藥殘留對(duì)人們健康的影響也引人關(guān)注[1-2]。目前，對(duì)有機(jī)磷殺蟲劑的檢測(cè)一般采用色譜法，如氣相色譜、薄層色譜、高效液相色譜等，這些方法的明顯不足是樣品準(zhǔn)備程序復(fù)雜、勞動(dòng)強(qiáng)度大、成本較高等，尤其不太適用于對(duì)蔬菜等需要保鮮的農(nóng)產(chǎn)品的檢測(cè)[3]。而以酶聯(lián)免疫分析（ELISA）為代表的免疫檢測(cè)技術(shù)由于具有高靈敏度、簡(jiǎn)單快速和廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，近年來已成重要的農(nóng)殘檢測(cè)手段。

單鏈抗體（ScFv）是一種重組抗體，通過基因重組與表達(dá)獲得[4-5]。與多克隆抗體相比，單鏈抗體具有與抗原更強(qiáng)的結(jié)合力;而與單克隆抗體相比，單鏈抗體具有生產(chǎn)成本低的優(yōu)點(diǎn)，單鏈抗體因此在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[6-7]。而將單鏈抗體用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)的研究較少[8-10]。本研究基于前期研究[9]通過基因重組、篩選及表達(dá)等技術(shù)所得到的單鏈抗體與ELISA相結(jié)合，首次建立了基于單鏈抗體的ELISA檢測(cè)蔬菜中農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)方法，為快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

儀器與試劑：殺螟松等有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心;Model 550酶標(biāo)儀，購(gòu)自Bio-Rad公司;卵清白蛋白（OVA）HisLinkTM蛋白純化系統(tǒng)，購(gòu)自Promega公司;HEPES緩沖溶液、BIAcore X系統(tǒng)、CM5芯片，購(gòu)自通用電氣（GE）公司。

蔬菜樣品：蔬菜樣品購(gòu)于重慶市陳家橋菜市場(chǎng)。

1.2 單鏈抗體親和力分析

將殺螟松-OVA（篩選抗原）與BIAcore專用CM5芯片偶聯(lián)后置于BIAcore X系統(tǒng)中，分別將前期研究通過3輪核糖體展示技術(shù)從小鼠的抗體基因文庫篩選所獲得3株ScFv抗體蛋白以及原始文庫（未經(jīng)篩選）隨機(jī)選取的抗體蛋白（小鼠血清）注入BIAcore X，流經(jīng)固定有篩選抗原的CM5芯片表面，記錄殺螟松-OVA與抗體蛋白結(jié)合過程。

1.3 單鏈抗體特異性分析

用競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析（IC-ELISA）測(cè)定3株抗體蛋白（ScFv-AF50 、ScFv-AF93和ScFv-AF132）與5種常用有機(jī)磷農(nóng)藥的交叉反應(yīng)率來說明抗體蛋白對(duì)殺螟松結(jié)合的特異性。

競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析按經(jīng)典步驟操作[11]（2步之間均棄上步溶液，并用含0.05% Tween 20的磷酸鹽緩沖液洗板3次）：（1）包被。用質(zhì)量濃度為20 μg/mL的單鏈抗體100 μL/孔，做3個(gè)平行，4 ℃過夜。（2）封閉。用1%明膠100 μL/孔，37 ℃ 放置2 h。（3）結(jié)合。用5種常用的有機(jī)磷農(nóng)藥（殺螟松、甲胺磷、甲拌磷、二溴磷、敵敵畏）梯度稀釋液，50 μL/孔，37 ℃放置1 h。（4）加篩選抗原殺螟松-OVA，質(zhì)量濃度為100 μg/mL，50 μL/孔，37 ℃放置1 h。（5）加二抗。用抗OVA抗體（辣根過氧化物酶標(biāo)記），100 μL/孔，37 ℃放置 2 h。（6）顯色。加底物100 μL/孔，暗處顯色5～15 min，用 2 mol/L 硫酸終止顯色，酶標(biāo)儀讀取D450 nm。

交叉反應(yīng)率的獲得：首先通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求不同有機(jī)磷農(nóng)藥的半抑制濃度IC50，標(biāo)準(zhǔn)曲線橫坐標(biāo)為有機(jī)磷濃度的常用對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)為結(jié)合率（B/B0，B為梯度濃度的有機(jī)磷的D450 nm，B0為不加有機(jī)磷的D450 nm）。然后利用下式計(jì)算抗體蛋白對(duì)不同有機(jī)磷農(nóng)藥的交叉反應(yīng)率[12]：

交叉反應(yīng)率（CR）=[SX（]殺螟松的IC50其他有機(jī)磷的IC50[SX）]×100%。

1.4 蔬菜中殺螟松殘留的測(cè)定

蔬菜樣品前處理：將從普通農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買的蔬菜樣品（甘藍(lán)、黃瓜、萵筍）搗碎，稱取10.00 g，用30 mL丙酮浸泡，室溫下振蕩30 min，離心分離，濾去殘?jiān)?，濾渣用25 mL丙酮洗滌3次，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去丙酮，用100 mL磷酸鹽緩沖液溶解待用。

蔬菜樣品殺螟松殘留的測(cè)定：利用競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析測(cè)定殺螟松，步驟與“1.3”節(jié)中交叉反應(yīng)率測(cè)定相同，只是在第3步結(jié)合時(shí)加入的是濃度梯度 （0、1、2、4、8、16 ng/mL） 殺螟松標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品處理所得溶液。用殺螟松標(biāo)準(zhǔn)溶液讀取的D450 nm值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，用內(nèi)插法先求得溶液中殺螟松濃度，再求算蔬菜中殺螟松含量。

1.5 樣本添加回收率試驗(yàn)

向蔬菜樣品（甘藍(lán)、黃瓜、萵筍）各加入梯度量的殺螟松（0.10、1.00、10.00 mg/kg），4 ℃放置過夜，然后以“1.4”節(jié)中同樣的方法對(duì)殺螟松殘留進(jìn)行提取、測(cè)定，計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 高親和力抗體

作為對(duì)比，筆者測(cè)定了從原始文庫中隨機(jī)挑取9個(gè)抗體蛋白和篩選后獲得的3個(gè)單鏈抗體蛋白與殺螟松-OVA結(jié)合，所得結(jié)果如圖1所示。圖1中橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為響應(yīng)值（RU），由于本試驗(yàn)所用的CM5芯片已經(jīng)耦合了篩選抗原殺螟松-OVA，RU升高即顯示有物質(zhì)與篩選抗原結(jié)合。

圖1-A中0～120 s是樣品流經(jīng)芯片的時(shí)間，RU無明顯變化，說明這9個(gè)單鏈抗體蛋白幾乎不與殺螟松-OVA結(jié)合。而經(jīng)核糖體展示篩選后的單鏈抗體部分與殺螟松-OVA有結(jié)合，其中有3株與殺螟松-OVA結(jié)合較強(qiáng)（圖1-B），圖1-B中0～120 s的RU升高了300～700，說明篩選所獲得的3個(gè)抗體蛋白與殺螟松-OVA有較強(qiáng)地結(jié)合，120 s之后RU降低，表示在進(jìn)樣結(jié)束后，緩沖液繼續(xù)流經(jīng)芯片將部分抗體蛋白洗脫下來。

為了測(cè)定抗體蛋白與殺螟松的親和力，將3株ScFv抗體蛋白進(jìn)行梯度稀釋（8、4、2、1 nmol/L），利用BIAcore測(cè)定梯度濃度的單鏈抗體蛋白與殺螟松-OVA的結(jié)合-解離過程，再利用BIAcore evaluation軟件對(duì)結(jié)合-解離曲線進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合以求算3株抗體蛋白的解離平衡常數(shù)，3株單鏈抗體（ScFv-AF50 、ScFv-AF93和ScFv-AF132）解離平衡常數(shù)分別為4.56×10-10、1.42×10-9、2.66×10-10 mol/L，解離平衡常數(shù)越小，說明抗體與抗原親和力越強(qiáng)。其中，解離速率最小的單鏈抗體ScFv-AF132被選為下一步的試驗(yàn)。

2.2 抗體的特異性

利用競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定了單鏈抗體ScFv-AF132的選擇性：分別以有機(jī)磷質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)lgC、結(jié)合率B/B0為橫坐標(biāo)、縱坐標(biāo)繪制結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖2是單鏈抗體ScFv-AF132對(duì)殺螟松的結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線。

通過該結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線可獲得殺螟松對(duì)單鏈抗體ScFv-AF132的半抑制濃度IC50為1.6 ng/mL，再通過不同有機(jī)磷農(nóng)藥的半抑制濃度IC50計(jì)算交叉反應(yīng)率（表2），作為對(duì)比，筆者也測(cè)定了小鼠血清（多克隆抗體）對(duì)有機(jī)磷的交叉反應(yīng)率。從表2可以看出，3株抗體蛋白與其他有機(jī)磷農(nóng)藥的交叉反應(yīng)率≤0.17%，而小鼠血清其他有機(jī)磷農(nóng)藥交叉反應(yīng)率≤7.6%，說明篩選提高了抗體對(duì)殺螟松的特異性。

2.3 蔬菜中殺螟松的測(cè)定

利用IC-ELISA來測(cè)定蔬菜中的殺螟松。先建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：橫坐標(biāo)為殺螟松濃度，縱坐標(biāo)為與之對(duì)應(yīng)的D450nm（加入不同濃度殺螟松與殺螟松濃度為0時(shí)的D450 nm之差），結(jié)果如圖3所示。

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)擬合可得到回歸方程：D450 nm=0.169C+0.012，先通過測(cè)定蔬菜提取液與空白液的D450 nm值，再利用回歸方程測(cè)定提取液中殺螟松濃度，最后得到3種蔬菜樣品中殺螟松殘留，結(jié)果如表3所示。

從表3可以看出，本次測(cè)定的3種樣品中均有一定的殺螟松殘留，黃瓜中殺螟松殘留最少，甘藍(lán)中的殘留量最高，而國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)上述3種蔬菜中殺螟松的殘留量均 ≤0.5 mg/kg（《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》GB 2763—2014）[13]，可見本次測(cè)定的甘藍(lán)樣品中殺螟松殘留超標(biāo)，黃瓜、萵筍中殺螟松殘留低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。但是，由于本試驗(yàn)屬于小樣本取樣，蔬菜樣品中農(nóng)藥殘留是否超標(biāo)還須進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

2.4 樣品添加回收率

分別向3種新鮮蔬菜中添加濃度梯度（0.10、1.0、10 mg/kg）的殺螟松，進(jìn)行樣品添加回收率試驗(yàn)以檢驗(yàn)本方法的精密度，測(cè)定結(jié)果如表4所示。

從表4可以看出，本試驗(yàn)的平均回收率介于90.3%～112.8%，RSD（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差）≤2.26%，說明本方法可靠，能在實(shí)際蔬菜樣品殺螟松殘留的快速檢測(cè)中得到應(yīng)用。

3 結(jié)論與討論

本研究初步建立了基于單鏈抗體的競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定實(shí)際蔬菜樣品中殺螟松的方法，利用該方法測(cè)得3種市售蔬菜（甘藍(lán)、黃瓜、萵筍）的殺螟松殘留量，分別為0.532 00、0.004 21、0.235 00 mg/kg。與農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比可知，甘藍(lán)樣品中殺螟松殘留超標(biāo)，黃瓜、萵筍中殺螟松殘留低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。樣本添加回收率試驗(yàn)顯示，平均回收率介于90.3%～112.8%，RSD≤2.26%，說明本方法可靠，能在實(shí)際蔬菜樣品中殺螟松殘留的快速檢中得到應(yīng)用。

由于競(jìng)爭(zhēng)ELISA具有低成本、無需大型設(shè)備且能批量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)的主要方法之一，已有較多關(guān)于ELISA用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)的報(bào)道，這些報(bào)道的ELISA往往基于多克隆抗體[14-18]或單克隆抗體[19-21]，多克隆抗體的缺點(diǎn)是特異性較差（本研究的交叉反應(yīng)率的對(duì)比試驗(yàn)也說明了這一點(diǎn)），且不同動(dòng)物、不同批次免疫所產(chǎn)生的多克隆抗體的質(zhì)量往往也差異明顯。而單克隆抗體則特異性好，缺點(diǎn)是造價(jià)高，這是單克隆抗體的制備方法所決定的。本研究所使用的重組抗體具有單克隆抗體高親和力、高特異性的優(yōu)點(diǎn)，若批量生產(chǎn)，則較單克隆抗體廉價(jià)。當(dāng)然，重組抗體的前期投入較高，如cDNA文庫的構(gòu)建、核糖體展示篩選單鏈抗體等。筆者所在的課題組也曾建立了基于單鏈抗體的BIAcore測(cè)定蔬菜中殺螟松殘留的方法[12]，2個(gè)方法所得的結(jié)果相似。不同之處在于：利用BIAcore無須用二抗，但BIAcore系統(tǒng)設(shè)備較大，不適應(yīng)田間、市場(chǎng)等現(xiàn)場(chǎng)操作;競(jìng)爭(zhēng)ELISA須標(biāo)記二抗，穩(wěn)定性不如BIAcore，但適用于現(xiàn)場(chǎng)操作。若能將二者結(jié)合，根據(jù)不同的條件選擇測(cè)定方案，才能使該方法走向?qū)嶋H應(yīng)用。

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