10 種植物提取物對(duì)葡萄根腐病菌的生物活性測(cè)定

安 麗，谷曉杰，何曉婷，郝曉娟，楊 春，曹 揮

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

葡萄（Vitis vinifera L.）富含糖、維生素和微量元素等有益物質(zhì)[1]，深受大眾喜愛(ài)，加之葡萄籽油類產(chǎn)品在美容界逐漸被人們所青睞[2]，因此，對(duì)葡萄的需求量日益增多。2017 年，世界葡萄總種植面積約為760 萬(wàn)hm2，其中，我國(guó)種植面積為84.7 萬(wàn)hm2，居世界第2 位[3]。近年來(lái)，葡萄病害頻繁發(fā)生，嚴(yán)重影響葡萄產(chǎn)量和品質(zhì)。

葡萄根腐?。‵usarium oxysporum），是由尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、彎角鐮刀菌等多種鐮孢霉真菌侵染引起的[4]。葡萄植株染病后會(huì)引起爛根，甚至死亡，其是葡萄種植中最主要的病害之一。葡萄根腐病菌從須根或者傷口侵入后，會(huì)在維管束出現(xiàn)紅褐色圓斑，后期病斑擴(kuò)大甚至變黑，根部腐爛至死。受害植株葉片尖端或邊緣枯焦，葉脈中間仍保持綠色，病葉不會(huì)很快脫落[5-7]。目前，對(duì)于葡萄根腐病的防治主要以土壤消毒、使用脫毒苗以及化學(xué)藥劑為主[8-11]，但收效甚微。

利用植物提取物防治病蟲(chóng)害已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[12]。國(guó)內(nèi)針對(duì)根腐病已進(jìn)行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)植物提取物對(duì)根腐病菌有良好的抑制效果。如黃柏、馬齒莧等8 種提取物對(duì)辣椒根腐病菌有較強(qiáng)的抑制作用[13]；馬偉等[14]研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子提取物對(duì)黃芪根腐病菌具有顯著的抑制效果。但大多數(shù)研究集中在防治草本類根腐病上，而關(guān)于植物提取物防治木本類根腐病的研究相對(duì)較少。

本研究以葡萄根腐病菌為供試菌株，測(cè)定丁香、八角等10 種植物提取物對(duì)該菌的室內(nèi)離體抑制活性，旨在篩選出具有較高活性的抑菌物質(zhì)，為葡萄根腐病的綠色防控提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試病株為葡萄根腐病病原菌，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供；供試培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基；供試植物為8 個(gè)科的10 個(gè)種（表1）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物提取物的制備 所用10 種植物提取物均采用超聲波提取法提取[15-17]。將采集的新鮮植物樣品進(jìn)行陰干處理，用粉碎機(jī)粉碎將供試部分進(jìn)行粉碎，用提取劑浸提，通過(guò)超聲波振蕩提取，抽濾，將上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，備用。

表1 供試植物信息

1.2.2 含藥平板的制備 取適量制備好的植物提取物，將其配制成最終質(zhì)量濃度為2 mg/mL 的含藥平板，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照（CK）。每組重復(fù)3 次。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

抑菌活性采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定[18-19]。計(jì)算10 種植物提取物在質(zhì)量濃度為2 mg/mL 時(shí)不同時(shí)間（48，72，96 h）對(duì)葡萄根腐病菌的抑制率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

篩選出抑菌率在80%以上的植物提取物進(jìn)行毒力分析，采用二倍稀釋法依次將其稀釋為最終濃度2.0，1.0，0.5，0.25，0.125，0.062 5，0 mg/mL 的含藥平板，每組重復(fù)3 次，并計(jì)算其抑菌率；將篩選出的丁香、八角、厚樸3 種植物提取物的抑菌率轉(zhuǎn)換為概率值，藥劑濃度轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)值，利用SPSS 軟件處理數(shù)據(jù)，對(duì)丁香、八角、厚樸提取物的濃度對(duì)數(shù)值（x）及其抑制率概率值（y）作回歸分析，通過(guò)計(jì)算求出毒力回歸方程（y＝a＋bx）、抑制中濃度EC50以及相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同藥劑的抑菌活性分析

表2 不同植物提取物對(duì)葡萄根腐病菌的抑制作用

由表2 可知，質(zhì)量濃度為2 mg/mL 時(shí)，除芫花提取物外，其他提取物在48 h 對(duì)葡萄根腐病菌的抑制率均與CK 之間存在顯著差異（P＜0.05），其中，丁香、八角、博落回提取物的抑制率達(dá)100%；不同植物提取物在72 h 對(duì)葡萄根腐病菌抑制率與CK 之間均存在顯著差異（P＜0.05），丁香、八角與其他提取物之間差異也達(dá)顯著水平（P＜0.05）；不同植物提取物在96 h 對(duì)葡萄根腐病菌抑制率與CK 之間均存在顯著差異（P＜0.05），其中，丁香、八角提取物的抑制率達(dá)100%。

由表2 還可知，質(zhì)量濃度為2 mg/mL 時(shí)，丁香、八角提取物在48，72，96 h 后對(duì)葡萄根腐病菌的抑制效果均最好，抑制率均達(dá)100%。其他植物提取物對(duì)葡萄根腐病菌的抑制作用隨著時(shí)間的推移逐漸降低。厚樸提取物在96 h 后對(duì)葡萄根腐病菌的抑制作用僅次于丁香和八角提取物，抑菌率達(dá)84.79%；博落回提取物在96 h 的抑菌效果較好，抑菌率達(dá)78.37%；而甘草、苦楝子、細(xì)辛提取物的抑菌效果一般，抑菌率分別為57.93%，46.93%，34.69%；狼毒、百里香提取物對(duì)葡萄根腐病菌幾乎沒(méi)有抑制作用，抑制率僅達(dá)15.91%，9.38%；而芫花提取物對(duì)葡萄根腐病菌的生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用。說(shuō)明丁香、八角、厚樸這3 種植物提取物具有較好的抑菌活性，因此，選取這3 種提取物進(jìn)一步求出其對(duì)葡萄根腐病菌的毒力回歸方程以及抑制中濃度（EC50）。不同植物提取物在96 h 作用于葡萄根腐病病原菌菌絲的生長(zhǎng)情況如圖1 所示。

2.2 3 種植物提取物對(duì)葡萄根腐病菌的毒力作用

由表3 可知，48 h 時(shí)丁香提取物對(duì)葡萄根腐病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性最好，其EC50值為0.143 5 mg/mL，八角提取物次之，其EC50值為0.171 9 mg/mL，而厚樸提取物較差，其EC50值為0.361 2 mg/mL；72 h時(shí)，EC50值從小到大為丁香提取物＜八角提取物＜厚樸提取物；96 h 時(shí)丁香提取物對(duì)葡萄根腐病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性最好，其EC50值僅為0.247 3 mg/mL，八角提取物對(duì)葡萄根腐病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用較好，其EC50值為0.268 2 mg/mL，而厚樸提取物相對(duì)較弱，其EC50值高達(dá)0.487 9 mg/mL。

表3 丁香、八角、厚樸提取物對(duì)葡萄根腐病菌菌絲的毒力作用

3 結(jié)論與討論

本研究測(cè)定了丁香、八角、厚樸等10 種植物提取物對(duì)葡萄根腐病菌的抑制效果結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除芫花提取物外的9 種提取物均對(duì)葡萄根腐病菌有一定的抑制作用。其中，以丁香、八角、厚樸3 種植物提取物的抑菌作用最強(qiáng)，其96 h 的EC50值分別為0.247 3，0.268 2，0.487 9 mg/mL。

已有研究表明，丁香、八角、厚樸提取物對(duì)多種植物病原菌具有較高的抑菌活性。丁香中活性成分丁香酚[20]具有廣譜抗菌性[21]，對(duì)黃瓜炭疽病菌[22]、香蕉枯萎病菌[23]、番茄灰霉病菌[24]、番茄疫霉根腐病菌[25]及山核桃干腐病菌[26]等植物病原菌均具有較強(qiáng)的抑制作用。八角中的主要成分反式茴香腦[27]對(duì)棉花枯萎病菌[28]、番茄灰霉病菌[29]、水稻紋枯病菌[30]、番茄黑斑病菌[31]等病原菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。厚樸提取物對(duì)鐮刀菌[32]、輪枝菌[33]、立枯絲核菌等植物病原菌具有良好的抑制作用。

植物中的活性成分來(lái)源于植物的次生代謝產(chǎn)物，而次生代謝是植物抗逆的過(guò)程，是在長(zhǎng)期進(jìn)化中對(duì)生態(tài)環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果[34]，因此，其對(duì)植物的影響是多方面的，除對(duì)病原物的抑菌活性外，還對(duì)施用植物有很多其他作用，如丁香酚可以誘導(dǎo)煙草抗病性的產(chǎn)生，同時(shí)刺激煙草的生長(zhǎng)[35]。本研究中，丁香、八角、厚樸這3 種植物提取物對(duì)葡萄根腐病菌具有很好的抑菌效果，但對(duì)葡萄抗病性的產(chǎn)生及生長(zhǎng)是否有作用還需要進(jìn)一步研究。

植物源農(nóng)藥以其環(huán)境相容性好、無(wú)污染而受到人們的青睞，但研究者只關(guān)注到了其農(nóng)藥活性，而其對(duì)作物的影響是全面的。因此，對(duì)植物源農(nóng)藥的評(píng)價(jià)應(yīng)該綜合考慮多個(gè)方面，充分發(fā)揮其綜合作用，為有害生物的綠色防控提供新的思路。