王國艷，李燕平，孫樂天，王志宇，牛曉燕，任克良

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032；2.太原動物園，山西太原030009）

大腸桿菌廣泛存在于自然界中，是條件致病菌，通常情況下作為腸道常在菌被人們所知，但是在環(huán)境、飼料、水源、熱等應(yīng)激條件下，可引起畜禽腸道病變，誘發(fā)腹瀉[1-4]等疾病，給畜牧業(yè)帶來一定的損失。

2018 年11 月初，山西省太原市婁煩縣某驢養(yǎng)殖場暴發(fā)急性腹瀉，臨床上表現(xiàn)為臥地不起、精神萎靡、食欲不振、軟便[3-5]，發(fā)病1 d，無死亡。

本研究對山西省太原市婁煩縣某驢養(yǎng)殖場的26 頭腹瀉驢的糞樣進(jìn)行了細(xì)菌分離培養(yǎng)，共分離出26 株大腸桿菌，采用K-B 紙片法對分離菌株進(jìn)行敏感藥物篩選試驗，旨在為該驢場臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料來源 山西省太原市婁煩縣某驢養(yǎng)殖場26 頭腹瀉驢的肛拭子26 份，在無菌實驗室進(jìn)行微生物細(xì)菌的分離純化培養(yǎng)。

1.1.2 試驗試劑 生化試驗管：乳糖、麥芽糖等各類糖發(fā)酵管、尿素、V-P 試驗生化管、甘露醇、吲哚試驗生化管等，均購自杭州濱和微生物試劑有限公司；培養(yǎng)基：普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯以及鑒別培養(yǎng)基（麥康凱和伊紅美藍(lán)），均購自青島賓得生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片，購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.1.3 試驗設(shè)備 奧林巴斯顯微鏡、滅菌壓力鍋、恒溫培養(yǎng)箱、超凈操作臺、數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)菌的分離鑒定 在無菌環(huán)境中，將采集的棉拭子管中分別加入5 mL 的肉湯培養(yǎng)液，37 ℃溫箱過夜培養(yǎng)，觀察肉湯濁度；再劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，24 h 后，挑取單個菌落接種于麥康凱上，24 h 后，再挑取單個粉紅色菌落接種于伊紅美藍(lán)平板上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h；挑取伊紅美藍(lán)上的疑似單個菌落，接種在LB 肉湯中，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，備用；蘸取肉湯液，劃線接種于伊紅美藍(lán)上，恒溫37 ℃過夜培養(yǎng)，取單個菌落進(jìn)行染色鏡檢。

1.2.2 細(xì)菌生化試驗 用接種針分別蘸取肉湯菌液穿刺接種于甘露醇、葡萄糖、海藻糖、麥芽糖、阿拉伯糖、鼠李糖、尿素、V-P 試驗、吲哚試驗等生化管中，恒溫37 ℃培養(yǎng)18～36 h。

1.2.3 耐藥性試驗 采用K-B 紙片擴(kuò)散法對青霉素、鏈霉素，頭孢類藥物頭孢克羅、頭孢曲松、頭孢哌酮，阿米卡星、諾氟沙星、多黏菌素B、痢特靈、卡那霉素、氧氟沙星、慶大霉素、阿莫西林等13 種藥物進(jìn)行藥敏試驗，37 ℃培養(yǎng)18～24 h 后量取抑菌圈直徑，計算耐藥率。

2 結(jié)果與分析

2.1 疑似病原菌的分離鑒定結(jié)果

肉湯管中呈渾濁且有沉淀；在普通瓊脂平板生長的單個菌落以乳白色光滑菌落生長；麥康凱平板上有單個菌落呈粉紅色或磚紅色不透明的光滑的圓形菌落生長；伊紅美藍(lán)平板上有單個菌落呈深紫黑色生長。革蘭氏染色鏡檢可見兩端鈍圓、較細(xì)的、單個排列的桿狀菌，符合大腸桿菌的培養(yǎng)特性，初步共分離出疑似大腸桿菌菌株26 株。

2.2 細(xì)菌的生化試驗結(jié)果

26 株分離株均發(fā)酵甘露醇、乳糖、麥芽糖等糖類，且均產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解尿素，V-P 試驗均為陰性，吲哚試驗均為陽性，鑒定均為大腸桿菌，符合《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》中報道的大腸桿菌生化特性。

2.3 藥物敏感試驗結(jié)果

表1 26 株驢腹瀉源大腸桿菌對13 種藥物的耐藥情況

依據(jù)美國NCCLS 制定的標(biāo)準(zhǔn)判斷，即抑菌圈直徑（mm）≥20 mm為高度敏感，16 mm＜直徑＜20 mm為中度敏感，直徑≤16 mm 為耐藥。敏感藥物篩選結(jié)果顯示，分離的26 株驢腹瀉源大腸桿菌對青霉素和多黏菌素B 的耐藥率高達(dá)95%以上，對青霉素更是達(dá)到了完全絕對耐藥；對痢特靈和頭孢克羅的耐藥率分別為38.46%和23.08%；對卡那霉素的耐藥率較低，為3.85%；對氧氟沙星、諾氟沙星、頭孢曲松絕對高敏（表1）。

3 結(jié)論與討論

本研究初步認(rèn)定，試驗分離出26 株驢腹瀉源大腸桿菌，分離率為100%，而大腸桿菌被認(rèn)為是引起畜禽腹瀉的主要病原菌之一，推測其是引起該驢場腹瀉的優(yōu)勢菌株。

本研究表明，分離出的26 株大腸桿菌除了對多黏菌素B 的耐藥率高達(dá)96.51%，這與孫瑩慧等[6]報道的2017 年分離得到的不明地區(qū)的驢內(nèi)臟型大腸桿菌僅對多黏菌素B 敏感和李雙雙等[7]在2013 年報道的兔源大腸桿菌對多黏菌素B 的高敏相反，這可能因菌株出現(xiàn)的年代、區(qū)域不同，而存在差異，也可能與菌株分離得到的部位有關(guān)，內(nèi)臟型[8]大腸桿菌與腸道型大腸桿菌的差異性有待研究；對青霉素的絕對耐藥，與張莉莉等[9]報道的2016 年甘肅部分地區(qū)奶牛乳房炎源大腸桿菌對青霉素的耐藥率在99%以上相近，與王禮偉等[10]對新疆石河子地區(qū)的奶牛乳房炎源大腸桿菌耐藥研究中對青霉素完全耐藥相同，這可能與青霉素在養(yǎng)殖業(yè)中長期不規(guī)范使用有關(guān)，與地域、菌株分離部位無關(guān)；對卡那霉素的耐藥率較低，為3.85%，這與王國艷等[11]2018 年報道的山西省兔腹瀉源大腸桿菌對卡那霉素的耐藥率幾乎相同，這表明2018 年山西地區(qū)驢和兔的腹瀉源大腸桿菌對卡那霉素的耐藥性幾乎相同，說明同一地區(qū)、同一年度、同一飼養(yǎng)規(guī)模程度的不同物種，腹瀉源大腸桿菌對卡那霉素的耐藥性相同。兔和驢都屬于特種養(yǎng)殖，在山西地區(qū)屬于養(yǎng)殖起步階段；驢腹瀉源大腸桿菌對阿米卡星的耐藥率為0，這與王志宇等[12]報道的山西省雞源內(nèi)臟型大腸桿菌對阿米卡星的高耐藥率不同，這表明在不同養(yǎng)殖規(guī)模、不同養(yǎng)殖發(fā)展程度的養(yǎng)殖過程中，不同來源的大腸桿菌對同一藥物的耐藥性不同。

大腸桿菌的致病機(jī)制和耐藥機(jī)制比較復(fù)雜[13-15]，因地域、時間、來源的不同而存在一定的差異，本研究結(jié)果僅對該驢場此次疫病臨床用藥有指導(dǎo)意義，不具有廣泛代表性。