崔國(guó)良，馮小可，魏睦新

1.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科，江蘇 南京 210000；2.南京醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所

H.pylori是一種微需氧的螺旋狀的革蘭陰性細(xì)菌，全球約50%的人攜帶，且大多數(shù)患者被H.pylori持續(xù)定植[1]，可誘發(fā)慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴瘤, 甚至胃癌等多種疾病，其致病過(guò)程有多種毒力因子參與, 如CagA、VacA和HtrA等[2]。細(xì)胞間連接是由緊密連接(tight junction, TJ)、黏附連接(adherence junction, AJ)、縫隙連接(gap junction, GJ)和橋粒(desmosome)等組成。上皮細(xì)胞間緊密連接、黏附連接和橋粒是建立和維持胃上皮屏障功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)成分，能夠防止微生物群感染、病原體侵入及各種損傷如強(qiáng)酸性胃液、胃蛋白酶等[3]。緊密連接是決定上皮屏障功能的重要因素，除了發(fā)揮選擇性通透屏障及參與生理功能, 還參與炎癥調(diào)節(jié)過(guò)程[4]，緊密連接蛋白主要由咬合蛋白(occludin)、閉合蛋白(claudin)、連接黏附分子(junctional adhesion molecule, JAM)和閉合小環(huán)蛋白(zonula occludens, ZOs)組成。黏附連接緊鄰著緊密連接,介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附并機(jī)械地將上皮細(xì)胞整合到組織中，其蛋白組分主要包括跨膜蛋白和細(xì)胞質(zhì)斑塊蛋白。上皮細(xì)胞間連接一旦受到破壞，細(xì)菌和內(nèi)毒素等就能通過(guò)上皮屏障使機(jī)體產(chǎn)生炎癥和免疫反應(yīng)，導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生。

1 空泡細(xì)胞毒素A(Vacuolating cytotoxin A，VacA)

VacA是一種88 kD的蛋白質(zhì)，含有兩個(gè)p33和p55亞基。最早發(fā)現(xiàn)H.pylori分泌的VacA能導(dǎo)致感染的上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡化,故命名為空泡細(xì)胞毒素。VacA作為可溶性蛋白通過(guò)Ⅴ型分泌系統(tǒng)釋放到細(xì)胞外區(qū)域，并且通過(guò)胞吞形式進(jìn)入宿主細(xì)胞，能誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡和壞死或抑制免疫細(xì)胞增殖、增加上皮細(xì)胞的通透性、干擾抗原的呈遞等過(guò)程，引起細(xì)胞間緊密連接的功能失調(diào)[5-6]。VacA改變細(xì)胞間通透性最早由PAPINI等發(fā)現(xiàn)，通過(guò)酸激活的VacA可誘導(dǎo)各種極化細(xì)胞系選擇性透過(guò)提供營(yíng)養(yǎng)的低分子量分子和離子，并且減少跨上皮電阻(TER)，這均利于H.pylori在體內(nèi)生長(zhǎng)。連接蛋白(Cxs)是縫隙連接中細(xì)胞內(nèi)通訊及細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中重要組成，VacA通過(guò)Rac1/ERK依賴性途徑增加自噬囊泡中連接蛋白43(Cx43)來(lái)誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡[7]，此外也可通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)來(lái)激活自噬誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡[8]。VacA基因的突變型與野生型表現(xiàn)相似，都能在感染期內(nèi)降低上皮電阻，并能選擇性增加細(xì)胞間連接對(duì)小分子和小離子的通透性來(lái)改變胃上皮細(xì)胞的完整性。

2 細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白

細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白CagA是由高毒力H.pylori菌株中的細(xì)胞毒素相關(guān)基因致病島(cagPAI)編碼，并通過(guò)Ⅳ型分泌系統(tǒng)進(jìn)入宿主細(xì)胞。CagA可易位到極化的緊密上皮，從而破壞頂端連接復(fù)合物(AJC)來(lái)改變上皮細(xì)胞的完整性，破壞胃上皮屏障功能并誘導(dǎo)上皮細(xì)胞異常的形態(tài)，另一方面，CagA介導(dǎo)細(xì)胞骨架蛋白ZO-1和緊密連接蛋白JAM聚集在宿主細(xì)胞膜上的細(xì)菌附著位點(diǎn)，改變了上皮細(xì)胞頂端連接復(fù)合物的組成和功能，導(dǎo)致緊密連接和黏附連接的裝配和功能被破壞[9]。CagA的表達(dá)不僅破壞頂端連接復(fù)合物，而且會(huì)干擾上皮細(xì)胞的分化，含易位的CagA細(xì)胞在多個(gè)EPIYA基序被酪氨酸磷酸化后，會(huì)調(diào)節(jié)細(xì)胞極性并誘導(dǎo)上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)，延長(zhǎng)遷移性偽足，降解基底膜，變成侵襲性細(xì)胞表型[10]。CagA在Src家族激酶和Abl激酶的作用下其EPIYA基序被酪氨酸磷酸化，磷酸化CagA后特異性結(jié)合后激活SHP-2磷酸酶, 從而持續(xù)激活細(xì)胞內(nèi)ERK1/2、銜接蛋白Crk及Src激酶C末端(csk)，導(dǎo)致細(xì)胞骨架重建和細(xì)胞伸長(zhǎng)[11]。磷酸化的CagA結(jié)合銜接蛋白Crk會(huì)誘導(dǎo)E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和黏附連接中的連環(huán)蛋白(catenin)破壞，而非磷酸化CagA靶向作用于細(xì)胞黏附蛋白中的E-鈣黏蛋白、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體c-Met及p120-連環(huán)蛋白，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生及細(xì)胞間連接的破壞, 使上皮細(xì)胞失去極性[12]。此外，有研究表明，CagA會(huì)特異性調(diào)控與不典型增生和癌癥多個(gè)階段中高度表達(dá)的特異性轉(zhuǎn)錄因子Cdx2，Cdx2在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平都會(huì)上調(diào)緊密連接中閉合蛋白-2的表達(dá)，且在靶向破壞緊密連接蛋白后會(huì)增強(qiáng)胃癌細(xì)胞AGS的侵襲性，這可能是H.pylori誘導(dǎo)胃癌變的早期事件[13]。細(xì)胞內(nèi)CagA可導(dǎo)致E-鈣黏蛋白復(fù)合體失穩(wěn)以及表達(dá)下調(diào)，并且誘導(dǎo)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體c-Met和E-鈣黏蛋白在細(xì)胞外脫落，這兩種分子均參與上皮腫瘤的發(fā)生[14]。E-鈣黏蛋白的下調(diào)與啟動(dòng)子的甲基化相關(guān)[15]，這是胃癌發(fā)生的重要過(guò)程之一，根除抗H.pylori可逆轉(zhuǎn)高甲基化，這可能會(huì)阻止癌癥的發(fā)生[16]。

3 尿素酶

H.pylori通過(guò)質(zhì)子門(mén)控通道(Urel)攝取尿素, 將其分解成氨和二氧化碳, 在H.pylori表面形成中性微環(huán)境, 避免胃酸的侵蝕。尿素酶(UreB)分解尿素所產(chǎn)生的氨(NH3/NH4+)不僅會(huì)破壞上皮細(xì)胞緊密連接蛋白，并能夠引起感染期一系列胃黏膜損傷。WROBLEWSKI等[17]研究證明，H.pylori通過(guò)Rho激酶(ROCK)和MLC激酶(MLCK)對(duì)肌球蛋白調(diào)節(jié)性輕鏈(MLC)的磷酸化后破壞緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能，從而導(dǎo)致上皮細(xì)胞通透性增高和上皮屏障功能進(jìn)行性喪失，屏障功能的減弱會(huì)因尿素酶的滅活而重新恢復(fù)，與CagA、CagE和VacA等無(wú)關(guān)，而且跨上皮電阻的降低也取決于功能性脲素酶的活性。H.pylori通過(guò)誘導(dǎo)IL-1受體Ⅰ型(IL-1RⅠ)磷酸化，介導(dǎo)Rho激酶破壞緊密連接中的閉合蛋白-4，這與CagA和VacA無(wú)關(guān)且不改變閉合蛋白-4轉(zhuǎn)錄[18]。尿素酶不僅可以中和酸性pH，也可以引起多種炎癥反應(yīng)，是H.pylori毒力的重要決定因素[19-20]。

4 細(xì)胞蛋白酶

多種細(xì)胞蛋白酶可在細(xì)胞表面裂解E-鈣黏蛋白，其中包括基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP)、去整合素和金屬蛋白酶(ADAM)、纖溶酶(plasmin)和激肽釋放酶(kallikrein)。H.pylori通過(guò)上調(diào)MMP來(lái)增加胞外域的脫落，且引起的E-鈣黏蛋白失調(diào)會(huì)導(dǎo)致黏附連接的黏附性喪失，從而增加腫瘤細(xì)胞的遷移能力[21]。WEYDIG等[22]發(fā)現(xiàn)，H.pylori的可溶性因子足以破壞黏附連接蛋白，這種被稱為HtrA的可溶性因子最終被確定為分泌型絲氨酸蛋白酶，可以直接或選擇性地破壞體外和體內(nèi)胃上皮細(xì)胞的E-鈣黏蛋白。除此之外，TEGTMEYER等[23]還發(fā)現(xiàn)，HtrA能夠靶向切割緊密連接蛋白中的咬合蛋白和閉合蛋白-8，從而破壞上皮細(xì)胞的屏障功能。HtrA過(guò)度表達(dá)會(huì)增強(qiáng)其蛋白水解的活性、加快E-鈣黏蛋白降解、促使細(xì)菌遷移和CagA向極化的上皮細(xì)胞遞呈等[24]。HtrA在不同的H.pylori菌株中高度保守，這可能與它能阻止人類免疫系統(tǒng)識(shí)別和消滅有關(guān)[25]。HtrA介導(dǎo)E-鈣黏蛋白和緊密連接蛋白的切割導(dǎo)致細(xì)胞間連接的破壞，并允許H.pylori接近極化的上皮細(xì)胞的基底外側(cè)膜，激活Ⅳ型分泌系統(tǒng)(T4SS)形成針狀菌毛，并以整聯(lián)蛋白依賴性方式向宿主細(xì)胞注入CagA[23]，這是H.pylori感染中起關(guān)鍵作用的環(huán)節(jié)。

5 其他

H.pylori除了產(chǎn)生毒力因子破壞連接蛋白外，還可以調(diào)節(jié)連接蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯等過(guò)程，從而導(dǎo)致連接蛋白的表達(dá)和功能失調(diào)。通過(guò)檢測(cè)感染H.pylori的細(xì)胞內(nèi)囊泡，發(fā)現(xiàn)E-鈣黏蛋白、β-連環(huán)蛋白、α-連環(huán)蛋白和p120-連環(huán)蛋白與細(xì)胞黏附不穩(wěn)定相關(guān)，且在人胃上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)E-鈣黏蛋白和連環(huán)蛋白的錯(cuò)位定位[26]。酪蛋白激酶2(casein kinase 2)通過(guò)α-/β-連環(huán)蛋白復(fù)合物的解離導(dǎo)致細(xì)胞膜中α-連環(huán)蛋白的消耗，并誘導(dǎo)β-連環(huán)蛋白核轉(zhuǎn)位以及增加MMP7的表達(dá)，這些改變均增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲性和運(yùn)動(dòng)性[27]。長(zhǎng)期H.pylori感染導(dǎo)致鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail持續(xù)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，鋅指轉(zhuǎn)錄因子與E-鈣黏蛋白近端啟動(dòng)子相結(jié)合導(dǎo)致了E-鈣黏蛋白表達(dá)的抑制[28]。MKN28細(xì)胞和H.pylori共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)β-連環(huán)蛋白和鋅指轉(zhuǎn)錄因子的上調(diào)會(huì)抑制緊密連接蛋白中的閉合蛋白-7的表達(dá)，并且改變了閉合蛋白-7在胃腸組織中的定位[29]。這些研究均表明，H.pylori感染不僅影響?zhàn)じ竭B接中E-鈣黏蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，其在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上也受到影響，導(dǎo)致E-鈣黏蛋白的表達(dá)降低和連接蛋白功能的喪失，這與胃腫瘤細(xì)胞的侵襲性密切相關(guān)。

6 小結(jié)與展望

H.pylori感染會(huì)導(dǎo)致胃黏膜上皮屏障受損，上皮通透性增加，并允許H.pylori注射相關(guān)毒力因子，導(dǎo)致相關(guān)疾病發(fā)生[30-31]。H.pylori對(duì)胃上皮細(xì)胞間連接的攻擊只是復(fù)雜發(fā)病機(jī)制中的一部分，其他相關(guān)機(jī)制還需進(jìn)一步研究，例如緊密連接和黏附連接中的其他組件ZO-2、ZO-3等以及橋粒和間隙連接等重要的細(xì)胞連接成分。相關(guān)分子機(jī)制為臨床診斷和治療提供新的思路和方法，如H.pylori調(diào)節(jié)的蛋白酶可作為預(yù)測(cè)性生物標(biāo)記物和胃癌治療干預(yù)的有效靶標(biāo)[32]，其中抑制HtrA蛋白酶活性能有效殺死H.pylori，這被認(rèn)為是新的抗菌療法[33]。由于H.pylori致病是一個(gè)多階段的過(guò)程，目前已明確的致病因子及其相關(guān)研究不足完全闡述H.pylori的致病機(jī)制，例如VacA的選擇性透化作用尚未完全明確。所以仍需深入研究H.pylori致病因子與細(xì)胞間連接相關(guān)的分子機(jī)制，還有待對(duì)H.pylori致病因子功能的深入研究，并結(jié)合其他致病因子的綜合分析和探索。