鄭孝賢

(福建省微生物研究所，福州 350007)

噴司他汀(pentostatin)是一種由抗生素鏈霉菌產(chǎn)生的高效、不可逆的腺苷脫氨酶(adenosine deaminase, ADA)抑制劑，具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)活性[1-2]。1974年P(guān)eter和Henry等[3-4]首次報(bào)道從抗生素鏈霉菌(Streptomycesantiboticus)的發(fā)酵液中分離到噴司他汀。1991年11月美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)正式批準(zhǔn)注射用噴司他汀注射劑上市[5]，商品名為Nipent，主要用于干細(xì)胞白血病(hairy cell leukemia, HCL)以及慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic lymphocytic leukemia, CLL)和蕈樣霉菌病(Mycosis fungoides)的治療。

目前噴司他汀的合成方法主要有化學(xué)合成和微生物發(fā)酵兩種方法，其中噴司他汀化學(xué)合成路線長，收率低，成本較高[6]；而微生物發(fā)酵研究報(bào)道較少，發(fā)酵產(chǎn)量低，目前報(bào)道的噴司他汀產(chǎn)量最高為100mg/L[7-10]。本研究通過考察抗生素鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)噴司他汀的關(guān)鍵原料，提供一種新的發(fā)酵培養(yǎng)基配方以及相應(yīng)的5000L發(fā)酵罐生產(chǎn)工藝，顯著提高噴司他汀的發(fā)酵單位，適用于噴司他汀的規(guī)模化生產(chǎn)。

1 儀器與材料

液相色譜儀(日本島津公司Shimdzu 10 AVP型)；噴司他汀對照品(美國Hospir公司提供，99.59%)；振蕩培養(yǎng)箱(上海知楚儀器有限公司)、離心機(jī)(貝克曼庫爾特公司Allegra X 15-R)、5000L發(fā)酵罐(福建微生物研究所自建發(fā)酵罐)；大豆油(山東魯花集團(tuán)有限公司)；花生油(山東魯花集團(tuán)有限公司)；菜籽油(山東魯花集團(tuán)有限公司)；橄欖油(益海嘉里食品營銷有限公司)；芝麻油(山東魯花集團(tuán)有限公司)；玉米淀粉(長春大成實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)；葡萄糖(上海展云化工有限公司)；黃豆粉(自加工產(chǎn)品)；酪蛋白(北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠)；酵母粉(廣東江門生物技術(shù)開發(fā)中心有限公司)；碳酸鈣(永安智勝化工有限公司)。

2 菌株

Streptomyces antibioticusFim0426，由福建省微生物研究所保藏。

3 方法

3.1 搖瓶培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖1.0%，酪蛋白0.3%，酵母粉0.3%，瓊脂1.5%，pH自然，28℃培養(yǎng)7～10d。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖1.0%，酪蛋白0.3%，玉米淀粉1.0%，酵母粉0.3%，pH自然，裝量80/500mL，28℃培養(yǎng)48h。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖3.0%，黃豆粉3.5%，玉米淀粉1.0%，酵母粉0.25%，碳酸鈣0.35%，蛋白胨0.3%，豆油1.5%，pH自然，裝量80/500mL，28℃培養(yǎng)168h。

3.2 發(fā)酵罐工藝

搖瓶種子按“3.1”項(xiàng)方法培養(yǎng)，以0.5%接種量接入一級種子罐，裝量120L/200L。28℃培養(yǎng)72h后以5%接種量接入二級種子罐，裝量250L/500L。28℃培養(yǎng)30h后以5%接種量轉(zhuǎn)入5000L發(fā)酵罐，裝量3000L/5000L，28℃發(fā)酵140h時(shí)發(fā)酵終止。

5000L發(fā)酵罐培養(yǎng)條件：發(fā)酵溫度28℃，罐壓0.04MPa，通氣1：0.8vvm，轉(zhuǎn)速200r/min。

3.3 噴司他汀效價(jià)測定

試樣制備：發(fā)酵液以5000r/min離心10min，取上清液檢測。

HPLC檢測：色譜柱：Phenomenon Luna C8(250mm×4.6mm, 5μm)；流動(dòng)相：2.5g/L乙酸銨溶液-甲醇-乙腈(960:20:20)；柱溫：20℃；流速：1.0mL/min；檢測波長282nm。

3.4 生物量測定

取發(fā)酵液10mL以5000r/min離心10min，取菌絲體用蒸餾水洗滌，再次離心，于55℃干燥至恒重。依下列計(jì)算生物量：生物量=菌體重量×100(g/L)[11]。

3.5 葡萄糖和總糖測定

發(fā)酵液離心取上清液，采用斐林試劑法測定葡萄糖和總糖[12]。

3.6 氨基氮測定

發(fā)酵液離心取上清液，采用甲醛法測定氨基氮[13]文中搖瓶發(fā)酵單位和生物量的數(shù)據(jù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。

4 結(jié)果與討論

4.1 抗生素鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)噴司他汀發(fā)酵培養(yǎng)基關(guān)鍵原料考察

以“3.1”項(xiàng)下配方為基礎(chǔ)，對抗生素鏈霉菌搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)噴司他汀的培養(yǎng)基濃度進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整，同時(shí)考察對發(fā)酵工藝有顯著影響的關(guān)鍵原料。分析7種原料分別對發(fā)酵單位的影響，采用SPSS軟件的單因素方差分析各個(gè)水平組間均數(shù)差別有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。選定噴司他汀發(fā)酵培養(yǎng)基各組分的5個(gè)濃度水平，每個(gè)水平重復(fù)試驗(yàn)3次。結(jié)果如圖1所示，經(jīng)過對培養(yǎng)基中各種成分詳細(xì)分析及評估，確定培養(yǎng)基成分葡萄糖3%，黃豆粉3%，玉米淀粉1.5%，豆油1.5%，酵母粉0.25%，碳酸鈣0.35%，蛋白胨0.3%。將其中豆油定為關(guān)鍵原料。評估依據(jù)如表1所示。豆油的概率P值為0.017，小于顯著性水平0.05，對發(fā)酵單位影響達(dá)到顯著水平。不同豆油濃度下噴司他汀產(chǎn)量最低142mg/L，最高達(dá)181mg/L。表明植物油對噴司他汀合成影響顯著，發(fā)酵培養(yǎng)基中植物油可能影響發(fā)酵過程中的溶氧、pH和其他發(fā)酵環(huán)境。葡萄糖和黃豆粉的概率P值都小于0.05，對發(fā)酵單位也有顯著影響。但這兩個(gè)因素的發(fā)酵單位都不高，最高效價(jià)均低于150mg/L，對提高噴司他汀的發(fā)酵單位未有積極影響，關(guān)鍵性評估為中級。玉米淀粉、酵母粉、碳酸鈣和蛋白胨的概率P值均大于0.05，對發(fā)酵單位影響未達(dá)到顯著水平，關(guān)鍵性評估為低級。

4.2 植物油對抗生素鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)噴司他汀的影響

圖1 發(fā)酵培養(yǎng)基主要成分對噴司他汀合成的影響Fig.1 Pentostatin yield comparison among main materials for fermentation medium

表1 關(guān)鍵原料的分析及評估Tab.1 Analysis and evaluation of critical materials

植物油作為培養(yǎng)基的重要成分，對抗生素鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)噴司他汀發(fā)揮重要作用。本文在噴司他汀發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度大豆油、花生油、棉籽油、菜籽油、橄欖油和芝麻油，培養(yǎng)7d后測其噴司他汀含量和生物量，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，菌體量的增長與噴司他汀發(fā)酵單位的增長有一定的相關(guān)性，總體趨勢是一致的。隨著培養(yǎng)基中植物油濃度增大，菌絲量和發(fā)酵單位隨之增高。但到一定濃度時(shí)，由于培養(yǎng)基植物油濃度偏高，菌體生長受到抑制，發(fā)酵單位也隨著降低。其中棉籽油和大豆油對抗生素鏈霉菌合成噴司他汀有顯著促進(jìn)作用。添加0.5%的棉籽油發(fā)酵單位最高達(dá)210mg/L；添加1.5%大豆油發(fā)酵單位為181mg/L。花生油、菜籽油、橄欖油和芝麻油這4種植物油對提高噴司他汀的產(chǎn)量影響有限。適量的棉籽油和大豆油有利于菌體大量合成，也提高了噴司他汀的發(fā)酵單位。但大豆油發(fā)酵后發(fā)酵液呈褐色油狀，菌絲體較為分散，給后續(xù)的分離純化帶來困難。而利用棉籽油作為培養(yǎng)基的發(fā)酵液清亮，質(zhì)地輕薄，容易過濾和分離。故采用棉籽油進(jìn)行下一步研究。

4.3 不同供應(yīng)商的棉籽油對抗生素鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)噴司他汀的影響

棉籽油為植物提取物，其含量因產(chǎn)地、采收季節(jié)的不同而呈現(xiàn)出大的波動(dòng)。當(dāng)棉籽油所含成分變動(dòng)較大時(shí)，有可能引起發(fā)酵過程中噴司他汀產(chǎn)量較大波動(dòng)。另外棉籽油含有某些對人體有害物質(zhì)如棉酚，如不加以控制，這些有害物質(zhì)可能帶入原料藥并可能因此引起療效和安全性方面的問題。因此，在進(jìn)行噴司他汀發(fā)酵生產(chǎn)前，有必要對發(fā)酵中的關(guān)鍵原料棉籽油有充分的認(rèn)識，并據(jù)此選用適宜的原料供應(yīng)商。

本文對市場上不同來源的棉籽油進(jìn)行初步考察。根據(jù)不同產(chǎn)地多個(gè)廠家產(chǎn)品的分析結(jié)果，評估不同供應(yīng)商的棉籽油對抗生素鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)噴司他汀的影響。按照“4.1”項(xiàng)和“4.2”項(xiàng)的研究結(jié)果確定的培養(yǎng)基配方，采用4種不同供應(yīng)商的棉籽油對抗生素鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)噴司他汀進(jìn)行比較研究。結(jié)果如圖3所示，不同來源的棉籽油對噴司他汀的合成有顯著影響。使用上海B公司的棉籽油作為發(fā)酵培養(yǎng)基，濃度為0.5%時(shí)噴司他汀發(fā)酵單位達(dá)232mL/L，結(jié)果較原始工藝181mg/L提高了28%。發(fā)酵液黝黑透亮，油花極少，有利于后續(xù)分離純化，提高收率。使用北京A公司的棉籽油最高發(fā)酵單位為210mL/L。使用湖南C公司和廣西D公司的棉籽油最高單位分別為206和190mL/L，其中廣西D公司需提高棉籽油濃度達(dá)0.75%才能獲得較高單位，植物油未被菌絲完全吸收，給后續(xù)分離純化帶來困難，影響產(chǎn)品收率。故采用0.5%濃度上海B公司的棉籽油進(jìn)行下一步研究。

圖2 植物油對噴司他汀合成和生物量的影響Fig.2 Pentostatin productivity and cell growth comparison among fermentations run with different plant oil

圖3 不同廠家棉籽油對噴司他汀合成的影響Fig.3 Yield comparison of fermentation carried out with cottonseed oil from different suppliers

4.4 5000L發(fā)酵罐工藝驗(yàn)證

在5000L發(fā)酵罐上驗(yàn)證“4.3”項(xiàng)下所篩選的棉籽油對噴司他汀合成的影響。按“3.3發(fā)酵罐工藝”方法，每隔24h取罐內(nèi)樣品測定發(fā)酵效價(jià)、菌絲濃度、總糖、還原糖和氨基氮等指標(biāo)，進(jìn)一步了解發(fā)酵罐生產(chǎn)的發(fā)酵代謝特征，變化趨勢見圖4。由圖4可知，菌絲量和噴司他汀發(fā)酵單位一直平穩(wěn)增長，到發(fā)酵后期約144h，菌體開始自溶生物量下降，發(fā)酵單位也隨之下降。菌絲量與噴司他汀產(chǎn)量發(fā)酵曲線具有相同趨勢的特征。由發(fā)酵過程中糖氮代謝曲線可以看出，總糖和還原糖代謝曲線較為同步，發(fā)酵前期兩者迅速下降，到72h總糖降至0.72%、還原糖降至0.48%時(shí)，開始緩慢而平穩(wěn)的下降，120h后總糖保持在0.4%左右，還原糖幾乎降為0。氨基氮一直穩(wěn)步下降，至144h降至最低，此時(shí)發(fā)酵單位最高，168h氨基氮回升，可能是由于菌體自溶釋放出游離氨基氮。

圖4 5000L罐中噴司他汀、生物量和糖氮代謝曲線Fig.4 Pentostatin yield, cell growth profiles, total sugar, reducing sugar and amino nitrogen consumption comparison plots at 5000L fermentor

表2為5批5000L發(fā)酵罐的測定結(jié)果。結(jié)果顯示，5批發(fā)酵液平均發(fā)酵單位為203mg/L；平均每批發(fā)酵罐產(chǎn)噴司他汀5.73kg。采用新工藝的5000L發(fā)酵罐發(fā)酵單位最高達(dá)210mg/L，較原始工藝121mg/L提高了74%。新工藝增加了噴司他汀的產(chǎn)量，降低了植物油的用量，發(fā)酵過程穩(wěn)定，容易控制，搖瓶工藝更容易在發(fā)酵罐生產(chǎn)重現(xiàn)，搖瓶的發(fā)酵單位與發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵單位接近。發(fā)酵液中油殘留量較低，改善發(fā)酵液質(zhì)地黏稠的性狀，使發(fā)酵液易于過濾、提取和純化，產(chǎn)品收率也大大提高。

4.5 討論

植物油對抗生素鏈霉菌合成噴司他汀作用較為顯著，分析其原因可能有3個(gè)。第一是植物油可能為噴司他汀的合成提供前提物質(zhì)?？股劓溍咕蓪⒅参镉头纸馍芍舅幔舅嵩谖⑸镒饔孟驴山?jīng)乙醛酸循環(huán)和糖異生作用生成糖，包括合成噴司他汀所需的戊糖結(jié)構(gòu)[6,14-16]，具體的影響機(jī)制需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。第二是植物油可能影響噴司他汀發(fā)酵環(huán)境。噴司他汀發(fā)酵培養(yǎng)基中含有大量的有機(jī)氮源成分，如0.25%酵母粉，0.3%蛋白胨和3%黃豆粉，這樣的配方在發(fā)酵過程中很容易起泡，影響鏈霉菌的呼吸，從而影響噴司他汀的產(chǎn)量。適量的植物油可以控制泡沫的產(chǎn)生，保障發(fā)酵生產(chǎn)噴司他汀正常進(jìn)行。第三是過量的植物油影響提取收率。過量的植物油使發(fā)酵后期培養(yǎng)基會出現(xiàn)油花或油層，影響菌體的生長和對底物的吸收，并給后續(xù)提取工藝帶來困難，降低產(chǎn)品收率。因此植物油對噴司他汀發(fā)酵的影響是多方面的，控制植物油的來源和用量對生物合成噴司他汀顯得尤為重要。

表2 5批5000L發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)果測定Tab.2 5 batches pentostatin yield at 5000L fermentor

本文通過對發(fā)酵培養(yǎng)基中主要成分的研究，提出控制關(guān)鍵原料增加噴司他汀產(chǎn)量的方法。通過考察和評估抗生素鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)噴司他汀培養(yǎng)基的關(guān)鍵原料，確定發(fā)酵工藝中的關(guān)鍵原料棉籽油的供應(yīng)商，對棉籽油來源、質(zhì)量和用量進(jìn)行有效控制，提高了噴司他汀的搖瓶和發(fā)酵罐發(fā)酵單位，改善噴司他汀發(fā)酵液質(zhì)地，有利于后期分離純化工作。原始工藝采用1.5%豆油作為培養(yǎng)基，搖瓶單位120mg/L，發(fā)酵罐單位181mg/L；大量的豆油可能不利于菌體對氧化底物的吸收，影響噴司他汀的合成，同時(shí)發(fā)酵液中殘留的豆油給提取純化工藝帶來困難。新工藝采用0.5%上海B公司提供的棉籽油作為培養(yǎng)基，搖瓶單位232mg/L，發(fā)酵罐單位210mg/L；不僅提高了搖瓶發(fā)酵單位，對發(fā)酵罐生產(chǎn)噴司他汀的產(chǎn)量增長影響尤其顯著。發(fā)酵罐生產(chǎn)條件下優(yōu)質(zhì)棉籽油更有利于菌體對植物油的利用，提高發(fā)酵單位，使發(fā)酵罐的單位體積產(chǎn)量接近搖瓶發(fā)酵水平。

本文提供一個(gè)高產(chǎn)噴司他汀的發(fā)酵方法，通過控制關(guān)鍵物料，大幅提高噴司他汀的產(chǎn)量，為實(shí)現(xiàn)噴司他汀的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供一種新思路，研究結(jié)果也可供其他利用植物油發(fā)酵的品種工業(yè)化研究參考。

致謝：感謝邱光榮、林永勉、徐蘭和林斌等同志在研究中給予的幫助和支持。