范夢蝶 王天澤 杜文斌 譚 佳 梁晶晶 謝建春

（食品營養(yǎng)與人類健康北京高精尖創(chuàng)新中心 食品質(zhì)量與安全北京實驗室 北京工商大學(xué) 北京 100048）

山西老陳醋是我國傳統(tǒng)名醋之一，是以高粱、大麥、豌豆等為主要原料，采用傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵法釀制，包括“蒸、酵、熏、淋、陳”5 道主要工序[1]。陳放為一個“冬撈冰、夏伏曬”的晾曬過程，陳放期一般至少1年。晾曬過程中，醋中一些物質(zhì)沉淀，水分通過蒸發(fā)或結(jié)冰析出，某些物質(zhì)又可充分地發(fā)生化學(xué)反應(yīng)如美拉德反應(yīng)等，使得釀制出的醋除具有一般醋的酸醇、味長等特點外，還兼具香、綿、不沉淀的特點[2-3]。

本文采用同時蒸餾萃取法制備樣品，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)、稀釋法氣相色譜-嗅聞（gas chromatography and olfactometry，GC-O）分析晾曬前、后山西老陳醋的關(guān)鍵香氣活性成分及其變化，以期對山西老陳醋生產(chǎn)過程的控制和晾曬過程的科學(xué)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山西老陳醋樣品（晾曬前、后），山西老陳醋集團(tuán)有限公司；C5-C25正構(gòu)烷烴，北京化學(xué)試劑有限公司，色譜純。

溶劑二氯甲烷、無水Na2SO4（試劑均為分析純），國藥集團(tuán)北京化學(xué)試劑有限公司；香料標(biāo)準(zhǔn)品：二甲基二硫醚（＞95%）、2-甲基-3-呋喃硫醇（＞95%）、3-甲硫基丙醛 （＞97%）、3-甲硫基丙醇（98%）、二甲基三硫醚（98%）、乙酸-3-甲硫基丙酯 （95%）、甲基吡嗪 （95%）、2，6-二甲基吡嗪（95%）、2-乙基-6-甲基吡嗪（95%）、三甲基吡嗪（95%）、3-乙基-2，5-二甲基吡嗪（＞95%）、四甲基吡嗪（95%）、2，5-二甲基吡嗪（95%）、2-乙基-3-甲氧基吡嗪 （＞95%）、糠醛 （98%）、5-甲基糠醛（95%）、乙酸糠酯（＞95%）、2-甲基丁醛（95%）、苯甲醛（＞98%）、苯乙醛（＞98%）、香蘭素（＞98%）、異丁烯醛（＞95%）、己醛（95%）、2，3-丁二酮（95%）、乙偶姻 （＞98%）、苯乙酮 （95%）、3-甲基丁醇（95%）、苯甲醇（＞98%）、苯乙醇（95%）、α-乙基苯甲醇（＞95%）、1-辛烯-3-醇（＞98%）、乙酸（95%）、丙酸（95%）、丁酸（95%）、戊酸（95%）、3-甲基-丁酸（＞95%）、乙酸乙酯（＞98%）、γ-壬內(nèi)酯（＞95%）、琥珀酸二乙酯（95%）、苯酚（95%）、愈創(chuàng)木酚（＞98%）、4-甲基愈創(chuàng)木酚（＞95%）、茴香腦（98%），美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、7890A氣相色譜儀，美國Agilent公司；氣味測量儀（GC-O），美國DATU Inc公司；DF-101S 恒溫加熱磁力攪拌水浴鍋，河南省予華儀器科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 同時蒸餾萃取 200 mL醋樣品放于500 mL圓底燒瓶中置于SDE裝置的一端，120℃油浴加熱，磁力攪拌。50 mL二氯甲烷置于100 mL圓底燒瓶中，置于SDE裝置的另一端，45℃水浴加熱，磁力攪拌。連續(xù)提取3 h。

萃取液加入無水硫酸鈉干燥，Vigrex柱濃縮至2 mL，氮吹濃縮至0.5 mL。按如上進(jìn)行3次平行試驗。

1.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜分析 采用HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）和 DB-Wax（30 m×0.25 mm×0.25 μm）兩根毛細(xì)管色譜柱進(jìn)行分析。起始柱溫35℃，保持2 min；以3℃/min升到170℃；再以5℃/min升到250℃，保持2 min；載氣為氦氣，流速1.0 mL/min；進(jìn)樣 1 μL，分流比 10∶1。

“三新”企業(yè)具有典型的高科技、信息化特征，用工人數(shù)較少，發(fā)展規(guī)模相對較小，且大多數(shù)處于起步狀態(tài)，受到行業(yè)變化、政策和競爭等影響，行業(yè)變化速度也非?？欤瑐鹘y(tǒng)的統(tǒng)計報表和統(tǒng)計方法已經(jīng)不能適用于“三新”企業(yè)統(tǒng)計日常管理工作。

電子轟擊電離源，能量70 eV；四極桿溫度150℃；離子源溫度230℃；全掃描模式，掃描范圍33～450 amu。

1.3.3 氣相色譜-嗅聞分析 由Agilent7890A氣相色譜 （配有FID檢測器）及嗅聞裝置組成。HP-5 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），起始柱溫40℃，以5℃/min升到250℃。進(jìn)樣口溫度250℃；載氣為氮氣，流速1.0 mL/min；不分流。

樣品用二氯甲烷按 1∶2、1∶4、1∶8、1∶16……進(jìn)行逐級稀釋，直到嗅聞口檢測不到氣味時停止，每種香味化合物的最高稀釋倍數(shù)為其 FD值。共3名評價員完成，通過操作軟件記錄嗅聞的氣味特征。

1.4 化合物定性定量方法

氣-質(zhì)聯(lián)機(jī)分析，根據(jù)NIST 14譜庫、保留指數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)品，鑒定化合物；面積歸一化法定量。氣相色譜-嗅聞分析，根據(jù)嗅聞的氣味特征、保留指數(shù)、與氣-質(zhì)聯(lián)機(jī)鑒定結(jié)果關(guān)聯(lián)、標(biāo)準(zhǔn)品，鑒定化合物。

2 結(jié)果與分析

2.1 晾曬前后GC-MS分析結(jié)果比較

采用氣-質(zhì)聯(lián)機(jī)從晾曬前后的山西老陳醋樣品中鑒定出的化合物及含量見表1。

由表1可知，通過SDE/GC-MS分析，兩種醋樣中共鑒定出183種揮發(fā)性化合物，鑒定出的化合物種類包括含硫化合物 （4種）、含氮雜環(huán)（30種）、含氧雜環(huán)（24種）、醛類 （13種 ）、酮類（17種）、醇類（22種）、酸類（17種）、酯類（31種）、酚類（19種）、醚類（3種）、其它類（3種）。

由圖1可知，相比之下，曬后醋中鑒定出的化合物種類數(shù)稍多，為140種，而曬前為133種，但有90種為兩者共有。晾曬前，檢測出酯類（25種）、含氧雜環(huán)（20種）、含氮雜環(huán)（18種）、醇類（18種）、酸類（16種）、醛類（9種）、酮類（8種）、酚類（13種）、含硫化合物（3種）、醚類（1種），其中酮類含量（30.08%）最高，其次為酸類（29.20%）、含氧雜環(huán)（15.10%）。曬后，檢測出含氮雜環(huán)（28種）、酮類（17種）、酚類（17種）、含氧雜環(huán)（16種）、酸類（15種）、酯類（14種）、醇類（13種）、醛類（11種）、含硫化合物（4種）、醚類（2種），酸類含量（26.51%）最高。另外，酮類（23.5%）、含氧雜環(huán)（17.26%）、含氮雜環(huán)的含量（15.73%）也很高。

表1 山西老陳醋晾曬前后的SDE/GC-MS分析結(jié)果Table1 Results of SDE/GC-MS analysis of Shanxi aged vinegar before and after aging

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

圖1 晾曬前后氣-質(zhì)檢測出的化合物種類數(shù)和含量比較Fig.1 Comparison of number and amounts of the volatile compounds identified from the vinegars before and after aging by GC-MS

醋曬前檢測出的主要化合物（含量＞1%，按兩柱平均值，下同）為乙酸（26.20%）、乙偶姻（20.23%）、糠醛（13.34%）、2，3-丁二酮（7.74%）、2-羥基丙酸乙酯（4.67%）、乙酸乙酯（2.99%）、四甲基吡嗪（2.92%）、2-甲基丁醇（1.34%）、苯乙醇（1.33%）、苯基乙二醇（1.21%）、2-乙酰氧基-3-丁酮（1.16%）、2-甲基丙醇（1.08%）等12種。而醋曬后檢測出的主要化合物 （含量＞1%，按兩柱平均值，下同）為乙酸（21.57%）、乙偶姻（16.26%）、糠醛（14.03%）、四甲基吡嗪 （6.57%）、2，3-丁二酮（4.65%）、乙酸乙酯（3.79%）、丙酸（1.79%）、三甲基吡嗪（1.51%）、2，3-二甲基吡嗪（1.51%）、α-乙基苯甲醇（1.33%）、苯基乙二醇（1.08%）、5-甲基糠醛（1.07%）等12種?？梢姡罆窈蠛s環(huán)，醛類，酮類，酚類等化合物的種類數(shù)明顯增加，而酯類化合物的種類數(shù)明顯減小。

從相對含量上看，晾曬后，也是含氮雜環(huán)、含氧雜環(huán)、醛類化合物顯著增加，而酸類，酮類、醇類、酯類化合物減少。其中曬后含量增加幅度較大的為四甲基吡嗪、三甲基吡嗪等含氮雜環(huán)化合物，含量降低幅度較大的為乙酸、乙偶姻、2，3-丁二酮、2-甲基丁醇等化合物。尤其在曬后醋中新檢測到3-甲硫基丙醛、吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪等化合物。總之，曬后醋中，含氮雜環(huán)種類和含量增加最為顯著，酯類化合物種類減少最顯著，酮類化合物含量減少幅度最大，酯類含量減少幅度其次。其中，四甲基吡嗪、乙酸、乙偶姻等化合物含量增加幅度最大。

2.2 晾曬前后GC-O分析結(jié)果比較

晾曬前后的醋樣SDE處理，AEDA/GC-O法分析香氣活性成分，所得結(jié)果見表2。

表2 老陳醋曬前曬后的GC-O分析結(jié)果比較Table2 Comparison of the results in GC-O analysis of the Shanxi aged vinegars before and after aging

（續(xù)表2）

由表2可知，兩種醋中共檢測出53種氣味活性區(qū)，鑒定出50種氣味活性化合物，包括含硫化合物（7種）、含氮雜環(huán)（7種）、含氧雜環(huán)（7種）、醛類（6種），酮類（4種）、醇類（1種）、酸類（3種）、酯類（8種）、酚類（5種）、醚類（2種）。另還有 3種氣味活性區(qū)未能鑒定出。

由表2、圖2可知，曬前醋中鑒定出34種氣味活性化合物，包括含硫化合物5種、含氮雜環(huán)3種、含氧雜環(huán)5種、醛類4種、酮類2種、醇類1種、酸類1種、酯類7種、酚類4種、醚類2種，曬后醋中檢測出39種氣味活性化合物，包括含硫化合物7種、含氮雜環(huán)7種、含氧雜環(huán)5種、醛類4種、酮類4種、醇類1種、酸類3種、酯類3種、酚類4種、醚類1種。

比較曬前曬后GC-O分析結(jié)果，3-甲硫基丙醇、四甲基吡嗪、糠醛、苯乙醛、乙偶姻、乙酸、愈創(chuàng)木酚等23種化合物為兩種醋共有，但乙酸異戊酯、乳酸乙酯、苯酚等11種化合物僅在曬前醋中檢測到，而甲基吡嗪、3-乙基-2，5-二甲基吡嗪、胡椒醛、己酸等16種化合物僅在曬后醋中檢測到。尤其吡嗪類化合物，曬后種類數(shù)增加，但酯類化合物種類數(shù)卻下降，這與比較氣-質(zhì)聯(lián)機(jī)分析的結(jié)果相一致。

圖2 晾曬前后稀釋因子較高（log2FD≥5）化合物比較Fig.2 Comparison of the aroma compounds with high FD values （log2FD≥5） in the vinegars before and after aging

稀釋因子越大，對總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)越大。由表2，曬前醋中稀釋因子較高（log2FD≥5）的化合物包括乙酸、乙偶姻、2，3-丁二酮、乳酸乙酯、愈創(chuàng)木酚等10種，而曬后醋中稀釋因子較高（log2FD≥5）的化合物包括3-甲硫基丙醇、糠醛、苯乙醛、愈創(chuàng)木酚等20種。曬后醋中稀釋因子高的化合物種類數(shù)增多，將造成其總體香氣強(qiáng)度增大。在稀釋因子較高的化合物中，乙酸、3-甲硫基丙醛、乙偶姻、琥珀酸二乙酯、愈創(chuàng)木酚等為曬前曬后醋的共有物質(zhì)，表明它們對曬前、曬后醋的總體香氣均有重要貢獻(xiàn)。

相比之下，曬后醋中稀釋因子高的酯類、酸類、酮類化合物種類數(shù)減少，從而在總體香氣中相對貢獻(xiàn)下降，而含硫化合物、含氮雜環(huán)化合物的化合物種類數(shù)增加，從而在總體香氣中的相對貢獻(xiàn)增加。尤其曬后醋中，乙酸異戊酯、乳酸乙酯、γ-己內(nèi)酯等均未檢測到，而新出現(xiàn)甲基吡嗪，2-乙基-2，5-二甲基吡嗪等化合物。

3 討論與結(jié)論

本文氣-質(zhì)譜檢測到的含硫化合物為二甲基二硫醚、二甲基三硫醚、3-甲硫基丙醛和乙酸3-甲硫基丙酯，GC-O檢測的含硫氣味活性化合物為2-甲基-3-呋喃硫醇、3-甲硫基丙醛和乙酸3-甲硫基丙酯。3-甲硫基丙醛、二甲基二硫醚等主要貢獻(xiàn)土豆香氣和肉香氣，可來源于微生物代謝發(fā)酵過程[11]，張媛媛[12]，喬敏莎[13]，江津津等[14]曾在白酒、醬油等發(fā)酵食品中檢測到3-甲硫基丙醛、二甲基二硫醚的存在。但二甲基二硫醚、二甲基三硫醚曬后含量增加，很可能由于美拉德反應(yīng)造成，因美拉德反應(yīng)中甲硫氨酸Strecker降解可產(chǎn)生甲硫醇，甲硫醇氧化聚合即生成二甲基二硫醚、二甲基三硫醚[15]。

氣-質(zhì)譜檢測到的含氮雜環(huán)化合物，無論種類數(shù)還是含量，均是曬后比曬前顯著增多，這主要是由于陳化晾曬過程發(fā)生美拉德反應(yīng)造成。含量顯著升高的為四甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2，3-二甲基吡嗪和三甲基噁唑等，其中四甲基吡嗪GC-O檢測稀釋因子也顯著升高。四甲基吡嗪（即川芎嗪）可由發(fā)酵體系中的乙偶姻和主要由氨基酸轉(zhuǎn)化而來的氨經(jīng)美拉德反應(yīng)生成[16]，是一種活性生物堿，是中藥川穹嗪中的主要功效成分。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，川芎嗪對于擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集、防止血栓形成、改善腦缺血等具有很好的作用[17-18]。三甲基噁唑可由丙氨酸與2-氨基丁酸體系反應(yīng)產(chǎn)生[19]，是醋中另一種重要的雜環(huán)化合物，且在曬后醋中含量有顯著增加。苗志偉等[3]用HS-SPME萃取山西老陳醋就曾鑒定出較多的三甲基噁唑。此外，余鳴春[20]，李慧[21]等曾在鎮(zhèn)江香醋、保寧醋等四大名醋中發(fā)現(xiàn)含量較高的三甲基噁唑。

氣-質(zhì)譜檢測曬前曬后的醋中主要含氧雜環(huán)均為糠醛、5-甲基糠醛，它們GC-O檢測時也具有較高的氣味活性。酸性條件下戊糖或己糖發(fā)生脫水環(huán)化反應(yīng)，可形成糠醛或5-甲基糠醛[22]。由于釀醋的原料是高粱，大麥和豌豆等含有淀粉的植物性原料，淀粉水解后產(chǎn)生糖類，因而醋釀造過程可形成大量的糠醛、5-甲基糠醛。此外，晾曬過程中，醋液中的糖和氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)，仍可產(chǎn)生糠醛、5-甲基糠醛，因而晾曬后糠醛、5-甲基糠醛含量略有上升。

氣-質(zhì)譜檢測曬前曬后的醋中主要醛類為苯甲醛、2-甲基丁醛、苯乙醛、α-亞乙基苯乙醛，其中苯甲醛、苯乙醛GC-O檢測具有較高氣味活性。Xiao等[23]通過頂空固相微萃取與氣-質(zhì)聯(lián)機(jī)分析山西苦蕎麥醋的揮發(fā)性成分，也發(fā)現(xiàn)苯甲醛的含量較高。檢測到的這些醛類物質(zhì)可在發(fā)酵過程通過微生物代謝產(chǎn)生，也可通過美拉德反應(yīng)產(chǎn)生。與曬前醋相比，苯甲醛和2-甲基丁醛在曬后醋中的含量有所降低，可能是由于較長時間的敞口晾曬過程中，因這些醛類物質(zhì)沸點較低，有所蒸發(fā)逸失造成。α-亞乙基苯乙醛可由苯乙醛與乙醛縮合反應(yīng)形成，苯乙醛可產(chǎn)生于美拉德反應(yīng)中苯丙氨酸的Strecker降解反應(yīng)，醋中含有大量的苯乙醛，因而在曬制后α-亞乙基苯乙醛含量有顯著增加。

氣-質(zhì)譜檢測曬前曬后的醋中主要酮類物質(zhì)為乙偶姻、2，3-丁二酮，它們GC-O檢測也具有較高的氣味活性。乙偶姻是多種微生物糖代謝的中間產(chǎn)物，是四甲基吡嗪形成的前體物質(zhì)。表1中晾曬后乙偶姻的含量降低了3.97%（曬后平均值減去曬前平均值），四甲基吡嗪相應(yīng)增加，說明消耗乙偶姻從而產(chǎn)生功效成分四甲基吡嗪，因此開發(fā)篩選高產(chǎn)乙偶姻的醋酸菌菌株[24]，成為研究醋發(fā)酵的一個熱點。

氣-質(zhì)譜檢測曬前曬后的醋中主要酸類為乙酸，GC-O檢測乙酸也具有較高的氣味活性。乙酸主要是在酒精發(fā)酵階段酵母菌利用糖類物質(zhì)產(chǎn)生乙醇，而乙醇在醋酸發(fā)酵階段中被醋酸菌分泌乙醇脫氫酶氧化成乙醛，乙醛繼續(xù)氧化形成乙酸。試驗表明乙酸是醋中含量最高的化合物（26.2%），曬制過程中乙酸會揮發(fā)逸失，從而導(dǎo)致其含量有所降低。

氣-質(zhì)譜檢測曬前曬后的醋中主要酯類為乙酸乙酯、乳酸乙酯、琥珀酸二乙酯，GC-O檢測它們也具有較高的氣味活性。但是酯類化合物易水解，王東新等[25]研究白酒發(fā)現(xiàn)，隨著放置時間的延長，酯類化合物水解導(dǎo)致總酯含量下降。另外，由于曬制過程敞口進(jìn)行且放置時間長，酯類物質(zhì)也會逸失，因此曬后表現(xiàn)出含量下降，對總體香氣的貢獻(xiàn)程度降低。

氣-質(zhì)譜檢測曬前曬后的醋中主要酚類為4-甲基愈創(chuàng)木酚、苯酚等，GC-O檢測到對香氣貢獻(xiàn)程度較大的為愈創(chuàng)木酚，主要貢獻(xiàn)辛香、藥香。4-甲基愈創(chuàng)木酚主要與發(fā)酵過程植物性原料的釋放及熏制工序有關(guān)[26]。通過對比氣-質(zhì)結(jié)果可以看出，在曬制過程中可能伴隨著原料中酚類物質(zhì)的繼續(xù)釋放，因此4-甲基愈創(chuàng)木酚含量增大了8倍。

雖然氣-質(zhì)譜從曬前曬后的醋中檢測到較多醇類化合物，但這些化合物GC-O檢測卻未有較高氣味活性。另一方面，1-辛烯-3-醇在GC-O中檢測具有較高氣味活性，但氣-質(zhì)分析并未檢測到，這很可能由于1-辛烯-3-醇閾值較低造成。1-辛烯-3-醇在鎮(zhèn)江香醋GC-O中也曾被檢測到[27]。氣-質(zhì)檢測出曬前曬后的醋中還有少量醚類化合物，它們可能來源于原料，但GC-O檢測氣味活性較低。

總之，曬前醋，氣-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)檢測含量高（＞1%，按兩柱平均值，下同）的為乙酸、乙偶姻、糠醛、2，3-丁二酮、乙酸乙酯、四甲基吡嗪等12種揮發(fā)性化合物，而GC-O檢測稀釋因子高（log2FD≥5）的為乙酸、乙偶姻、2，3-丁二酮、乳酸乙酯、愈創(chuàng)木酚等10種氣味活性化合物。曬后醋，氣-質(zhì)聯(lián)機(jī)檢測含量高的為乙酸、乙偶姻、糠醛、四甲基吡嗪、2，3-丁二酮、乙酸乙酯、丙酸、三甲基吡嗪等12種揮發(fā)性化合物，而GC-O檢測稀釋因子高的為3-甲硫基丙醇、糠醛、苯乙醛、愈創(chuàng)木酚等20種氣味活性化合物。相比之下，氣-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)及GC-O檢測均為晾曬后一些含氮雜環(huán)化合物尤其吡嗪類化合物及含硫化合物的含量顯著增加，而酯類物質(zhì)顯著減少。前者主要是由于陳化晾曬階段，醋液中發(fā)生美拉德反應(yīng)造成，而后者主要由于在一年四季的敞口晾曬過程中，水解和逸失造成，從而使晾曬后前者對總體的香氣貢獻(xiàn)程度升高而后者降低。