β-胡蘿卜素-薏苡仁油復合脂質體的制備及氧化穩(wěn)定性研究

鄭景霞 白春清 熊 華*

（1 南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室 南昌 330047

2 江西科技師范大學 生命科學學院 國家大宗淡水魚加工技術研發(fā)分中心 南昌 330013）

β-胡蘿卜素（β-carotene）是具有多種功能的天然色素，其特殊的富電子共軛體系，可通過猝滅單線態(tài)氧和清除自由基發(fā)揮較好的抗氧化活性[1]，且其對心血管疾病[2]、結腸癌[3]等慢性疾病有顯著的治療效果。然而，β-胡蘿卜素易受光、熱、氧等的影響而發(fā)生降解，通過運載體系將其制備成制劑能夠有效提高其應用價值。脂質體作為一種新型的功能成分載體制劑受到廣泛的關注，將活性成分包埋于脂質體內(nèi)可提高其穩(wěn)定性，降低光、氧等對活性成分的破壞，同時，脂質體還具有較好的緩釋作用、靶向性、細胞親和性、無毒性與組織相容性[4-6]。目前含有單一β-胡蘿卜素功能性成分的脂質體制劑已有研究報道[7-9]，而其與其它功能性成分復合的制劑還鮮有報道。薏苡仁油 （Coix seed oil）是從藥食兩用性材料薏苡仁中提取的油脂，研究表明其富含不飽和脂肪酸，具有消炎、鎮(zhèn)痛，抗癌等生理功能[10]。利用脂質體將β-胡蘿卜素與薏苡仁油同時包埋，制備包含兩種功能性成分的復合脂質體制劑，一方面能夠給β-胡蘿卜素提供保護屏障，有效減緩其降解速度；另一方面能利用薏苡仁油對β-胡蘿卜素的溶解作用使整個體系分散更加均勻，進一步提高體系的穩(wěn)定性，形成具有多種功效且氧化穩(wěn)定性良好的復合制劑。

本研究采用乙醇注入法制備β-胡蘿卜素-薏苡仁油復合脂質體，以β-胡蘿卜素包封率及粒徑分布為考察指標，在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken響應面法優(yōu)化復合脂質體的制備工藝條件[11]，并對樣品的形態(tài)分布及氧化穩(wěn)定性進行考察，為復合脂質體制劑開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-胡蘿卜素，購于美國Sigma公司；薏苡仁油，廣州合誠三先生物科技有限公司；蛋黃卵磷脂，北京solarbio科技有限公司；膽固醇，上海藍季科技發(fā)展有限公司；DPPH，購于美國Sigma公司；二氯甲烷、乙醇、正己烷均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 設備與儀器

85-2恒溫磁力攪拌器，常州國華電器有限公司；SHZ-DⅢ循環(huán)水真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；722N可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；Zetasizer Nano粒度電位儀，馬爾文儀器公司（中國）；H-600透射電子顯微鏡，日本Hitachi集團。

1.3 方法

1.3.1 β-胡蘿卜素-薏苡仁油復合脂質體的制備

采用乙醇注入法制備復合脂質體[12]。將處方量的蛋黃卵磷脂、膽固醇、薏苡仁油及新配制的β-胡蘿卜素-二氯甲烷溶液（1 mg/mL）溶于10 mL乙醇，待充分溶解后，將其緩慢滴加到一定體積的PBS緩沖液（0.02 mol/L）中，滴加完成后繼續(xù)恒溫攪拌20 min，再于振蕩器中振蕩水化20 min，得粗脂質體。將粗脂質體在42℃真空條件下旋轉蒸發(fā)除去乙醇及二氯甲烷后，加蒸餾水定容至起始體積后，超聲處理30 min，充入氮氣、密封后于4℃儲存。同法制備空白脂質體、β-胡蘿卜素脂質體及薏苡仁油脂質體作對照。

1.3.2 β-胡蘿卜素包封率的測定

1.3.2.1 β-胡蘿卜素標準曲線的建立 準確稱取10 mg β-胡蘿卜素溶于10 mL二氯甲烷，配置成1 mg/mL的β-胡蘿卜素溶液，取1 mL該溶液用正己烷定容至10 mL，配置成0.1 mg/mL的β-胡蘿卜素母液，分別取 0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35，0.4 mL β-胡蘿卜素母液于 10 mL 容量瓶，用正己烷定容至10 mL，以正己烷為空白對照，分別稀釋成 0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4 μg/mL濃度梯度的β-胡蘿卜素溶液，于450 nm處測吸光度，得到標準曲線：Y=0.208C+0.002，R2=0.998。

1.3.2.2 β-胡蘿卜素包封率的計算 （EE） β-胡蘿卜素包封率的測定采用有機溶劑萃取法[13]。取適量脂質體至于10 mL刻度離心管中，加入4 mL正己烷，渦旋混合1 min后，5 000 r/min離心10 min，取上層正己烷液，重復提取2次后，合并正己烷液，并用正己烷定容至10 mL，以正己烷為空白，測定樣品在450 nm處吸光度A0，通過標準曲線計算游離β-胡蘿卜素含量。向上述萃取后的脂質體中加入定量乙醇，渦旋混合10 s后，超聲破乳10 min，加入4 mL正己烷，5 000 r/min離心10 min，取上層正己烷液，重復提取2次至脂質體呈乳白色，合并正己烷液，繼續(xù)用正己烷定容至10 mL，測定吸光度A1。將A0和A1分別代入β-胡蘿卜素標準曲線方程計算游離β-胡蘿卜素含量C0和被包埋β-胡蘿卜素含量C1。通過以下公式計算EE：

1.3.3 單因素考察 基本工藝條件：卵磷脂與膽固醇質量比（5∶1，w/w）、薏苡仁油 6 mg、β-胡蘿卜素-二氯甲烷溶液（1 mg/mL）0.6 mL溶于10 mL乙醇，PBS緩沖液 pH為 6.8、體積為 25 mL，攪拌溫度45℃。試驗過程中固定其它條件不變而只改變某一單一條件，分別考察薏苡仁油添加量、卵磷脂與膽固醇質量比 （w/w）、β-胡蘿卜素添加量、PBS緩沖液用量、攪拌溫度及PBS緩沖液pH值等6個因素對β-胡蘿卜素的包封率和脂質體粒徑分布的影響，根據(jù)試驗結果確定影響較大的因素。

1.3.4 Box-Behnken響應面法優(yōu)化β-胡蘿卜素-薏苡仁油復合脂質體制備工藝 通過單因素考察，選取對β-胡蘿卜素包封率和脂質體粒徑分布影響較大的3個因素：脂質體制備溫度（A）、卵磷脂與膽固醇的質量比（B）、PBS緩沖液用量（C），以β-胡蘿卜素的包封率EE（Y）為響應值，采用Box-Behnken響應面優(yōu)化制備工藝。

1.3.5 β-胡蘿卜素-薏苡仁油復合脂質體的形態(tài)表征

1.3.5.1 粒徑分布及Zeta電位 取β-胡蘿卜素-薏苡仁油復合脂質體1 mL，用蒸餾水稀釋至10 mL以防止微粒聚集影響測定結果，隨后裝入特定的比色皿中進行測定，采用馬爾文Zetaszier Nano-ZS粒徑分析儀測定脂質體的粒徑分布、多分散性系數(shù)及Zeta電位。

1.3.5.2 透射電子顯微鏡觀察（TEM） 采用磷鎢酸負染法[14]對β-胡蘿卜素-薏苡仁油復合脂質體進行前處理，取適量樣品滴于銅網(wǎng)上，用濾紙吸干邊緣多余的樣品后，將銅網(wǎng)浸泡于0.01 g/mL的磷鎢酸鈉溶液中染色2 min，取出后用濾紙吸干邊緣多余溶液后自然晾干，用透射電鏡觀察脂質體的形態(tài)結構。

1.3.6 DPPH自由基清除能力 分別取2 mL脂質體，加入2 mL DPPH乙醇溶液（0.4 mmol/L），混合后避光放置1 h，3 000 r/min離心10 min，取上清液在517 nm測吸光度，對照以乙醇代替DPPH溶液，測得At；以蒸餾水代替樣品與DPPH溶液反應，同樣以蒸餾水和乙醇混合液為對照，測得Ac，計算公式為：

2 結果與分析

2.1 單因素考察

2.1.1 薏苡仁油添加量的影響 固定其它條件不變，只改變薏苡仁油的添加量（0，2，4，6，8，10，12 mg），制備復合脂質體，考察薏苡仁油添加量對復合脂質體粒徑分布及包封率的影響。結果如圖1所示，加入薏苡仁油后，β-胡蘿卜素-薏苡仁油復合脂質體的粒徑有所增大，且β-胡蘿卜素的包封率有所降低，可能是薏苡仁油占據(jù)了一部分脂質體囊結構，使游離的β-胡蘿卜素數(shù)量增多，從而降低包封率，但是，隨著薏苡仁油含量的增高，β-胡蘿卜素的包封率及粒徑分布變化不明顯，可能是體系中被包埋的β-胡蘿卜素及薏苡仁油達到相對平衡。

2.1.2 卵磷脂與膽固醇質量比的影響 固定其它條件不變，只改變卵磷脂與膽固醇質量比（1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，6∶1，7∶1），固定膽固醇的添加量為20 mg/10 mL乙醇，制備復合脂質體，考察卵磷脂與膽固醇質量比對復合脂質體粒徑分布及包封率的影響。結果如圖2所示，隨著卵磷脂與膽固醇質量比的增大，β-胡蘿卜素的包封率先增大后趨于穩(wěn)定，粒徑先減小后趨于穩(wěn)定，膽固醇作為類脂膜的重要組分，比例過大時，組成脂質體的卵磷脂量太少，脂質體膜不易形成，而且膽固醇可能會降低脂溶性物質對脂質雙分子層的插入[15]，過低的卵磷脂與膽固醇質量比使得磷脂雙分子層排列不夠緊密，且形成的脂質體數(shù)量有限不足以包埋所添加的β-胡蘿卜素及薏苡仁油[16]。而當卵磷脂與膽固醇質量比增大到5∶1時，脂質體數(shù)量達到要求，且磷脂雙分子層膜的流動性降低，致密性和剛性有所增加[17]，從而提高藥物的包封率。

圖1 薏苡仁油添加量的影響Fig.1 Effect of concentration of coix seed oil on EE of β-carotene and particle size distribution

2.1.3 β-胡蘿卜素添加量的影響 固定其它條件不變，只改變β-胡蘿卜素的添加量（0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mg），制備復合脂質體，考察 β-胡蘿卜素添加量對復合脂質體粒徑分布及包封率的影響。結果如圖3所示，當β-胡蘿卜素的添加量高于0.2 mg時，其包封率有緩慢增加的趨勢，脂質體粒徑相對也有緩慢降低的趨勢，在卵磷脂和膽固醇形成的脂質體的包埋能力范圍內(nèi)，適當添加β-胡蘿卜素有利于提高其包封率，也有利于磷脂分子有序排列從而形成分散情況更好的體系。

圖2 卵磷脂與膽固醇質量比的影響Fig.2 Effect of mass ratio of lecithin to cholesterol on EE of β-carotene and particle size distribution

2.1.4 PBS緩沖液用量的影響 固定其它條件不變，只改變 PBS 緩沖液用量（10，15，20，25，30，35，40 mL），制備復合脂質體，考察PBS緩沖液用量對復合脂質體粒徑分布及包封率的影響。結果如圖4所示，隨著緩沖液用量的增加，β-胡蘿卜素的包封率先上升后趨于平穩(wěn)，脂質體的粒徑先下降后趨于平穩(wěn)，緩沖液用量增加，脂質體濃度降低，分子聚集情況減少，更有利于雙分子層的有序排列。

圖3 β-胡蘿卜素添加量的影響Fig.3 Effect of concentration of β-carotene on EE of β-carotene and particle size distribution

圖4 PBS緩沖液用量的影響Fig.4 Effect of volume of PBS buffer on EE of β-carotene and particle size distribution

2.1.5 攪拌溫度的影響 固定其它條件不變，只改變攪拌溫度（25，35，45，55，65，75，85℃）制備復合脂質體，考察攪拌溫度對復合脂質體粒徑分布及包封率的影響。結果如圖5所示，隨著攪拌溫度的升高，β-胡蘿卜素的包封率先輕微波動后迅速下降，脂質體的粒徑相對也先輕微波動后持續(xù)增大。攪拌溫度為45℃時，β-胡蘿卜素的包封率最高，脂質體粒徑也較小，制備溫度高于磷脂的相變溫度才能提高脂質體膜的通透性使藥物插入[18]，但是，過高的溫度又會使磷脂膜的流動性增大，導致藥物泄漏，粒徑增大。

2.1.6 PBS緩沖液pH值的影響 固定其它條件不變，只改變 PBS 緩沖液 pH （5.8，6.0，6.4，6.8，7.0，7.4，7.8），制備復合脂質體，考察 pH 對復合脂質體粒徑分布及包封率的影響。結果如圖6所示，緩沖液的pH值低于6.4時，β-胡蘿卜素的包封率較低，脂質體的粒徑也較大。低pH值可能會使脂質體中的脂肪酸發(fā)生質子化而形成六角晶體，使脂質體膜的流動性增大，從而降低脂質體的穩(wěn)定性，導致藥物流失。

圖5 攪拌溫度的影響Fig.5 Effect of temperature on EE of β-carotene and particle size distribution

圖6 PBS緩沖液pH值的影響Fig.6 Effect of pH value of PBS buffer on EE of β-carotene and particle size distribution

2.2 Box-Behnken響應面法優(yōu)化β-胡蘿卜素-薏苡仁油復合脂質體制備工藝

2.2.1 Box-Behnken試驗設計及結果 采用Design-Expert 8.0.5.0對表1中的數(shù)據(jù)進行分析，以Y為響應值對自變量A、B、C進行模型擬合，得到二次多項式回歸方程：

Y=77.34-5.65A+18.02B+13.47C-2.51AB-2.44AC-5.79BC-19.54A2-11.53B2-9.21C2（R2=0.9654，P=0.003，F(xiàn)=21.67，失擬度檢驗 P=0.1702＞0.05，F(xiàn)=2.83）

為檢驗方程的可信度，利用軟件對其進一步分析，其分析結果如表2，該模型的F值21.67＞4，P值0.0003＜0.01，說明該模型是高度顯著的，失擬相的F值為2.83，P值0.1702＞0.05，說明模型的失擬項不顯著，可用于預測。方程的決定系數(shù)R2=0.9654＞0.95，表明實際值與預測值非常接近，該方程能夠準確預測實際情況。方程的校正決定系數(shù)Radj2=0.9208表明該模型中響應值的變化92.08%由所選的自變量決定，進一步說明該模型能夠準確預測出響應值與各個自變量之間的關系，且誤差極小。綜上所述，該模型擬合程度良好，可以用該模型對脂質體的制備工藝進行優(yōu)化。

各個因素的F值可以反映出每個因素對胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的重要性，F(xiàn)值越大，說明對β-胡蘿卜素的包封率的影響越顯著[20]，由表2可知，各因素對復合脂質體中β-胡蘿卜素包封率的影響程度順序為：卵磷脂與膽固醇的質量比＞緩沖液的用量＞制備溫度，其中卵磷脂與膽固醇的質量比、緩沖液的用量的影響極顯著。

表1 Box-Behnken響應面試驗設計及結果Table1 Design and results of Box-Behnken response surface analysis

表2 響應面二次模型方差分析Table2 Variance analysis of response surface quadratic mode

2.2.2 響應面交互作用分析 采用Design-Expert 8.0.5.0對方程進行方差性和顯著性檢驗后，根據(jù)二次多項回歸方程擬合的結果，固定某一個因素，繪制Y與其它兩個因素的三維響應曲面圖和等高線圖，響應面圖形是響應值對各試驗因子所構成的三維空間的曲面圖，從響應面分析圖上可形象地看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用[21]。如果等高線為橢圓，則表明兩個因素之間的交互作用顯著，如果為圓形則表明交互作用不顯著[22]。

當固定PBS緩沖液體積不變時，隨著卵磷脂與膽固醇的質量比的增加和制備溫度的升高，復合脂質體內(nèi)β-胡蘿卜素的包封率先增大后減小，但變化范圍較小，且等高線偏橢圓形，表明卵磷脂與膽固醇的質量比和制備溫度兩個因素的交互作用相對顯著（圖7a）。

當固定卵磷脂與膽固醇的質量比不變時，隨著PBS緩沖液體積的增加和制備溫度的升高，復合脂質體內(nèi)β-胡蘿卜素的包封率先增大后減小，但變化范圍很小，等高線偏圓形，表明PBS緩沖液體積和制備溫度兩個因素的交互作用相對較弱（圖7b）。

當固定制備溫度不變時，隨著卵磷脂與膽固醇的質量比和PBS緩沖液體積的增加，復合脂質體內(nèi)β-胡蘿卜素的包封率先增大后減小，且變化范圍較大，等高線呈橢圓形，表明卵磷脂與膽固醇的質量比和PBS緩沖液體積兩個因素的交互作用顯著（圖7c）。

圖7 各因素交互作用對β-胡蘿卜素包封率的影響Fig.7 Response surface and corresponding contour plots showing the effect of interaction of various factors on the EE of β-carotene

2.2.3 模型驗證 根據(jù)Design-Expert 8.0.5.0綜合分析，脂質體的最佳制備工藝為：制備溫度42.78℃，卵磷脂與膽固醇質量比6.96∶1，PBS緩沖液的體積為24.76 mL/10 mL乙醇，理論的β-胡蘿卜素的包封率為84.39%，為了檢驗響應面優(yōu)化結果的可靠性，采用上述最佳工藝制備脂質體，考慮實際情況，設定制備溫度為43℃，卵磷脂與膽固醇質量比為7∶1，PBS緩沖液的體積為25 mL/10 mL乙醇，得到的復合脂質體中β-胡蘿卜素的包封率為81.22%，與理論值的相對誤差為3.76%，試驗值和理論值比較接近，說明該模型的預測性良好。

2.3 β-胡蘿卜素-薏苡仁油復合脂質體的表征

2.3.1 粒徑分布及Zeta電位 測定結果顯示，β-胡蘿卜素-薏苡仁油復合脂質體的平均粒徑及多分散性指數(shù)受制備工藝的影響，在適當?shù)墓に嚄l件下，其平均粒徑（AD）為（187.9±7.5）nm，多分散系數(shù)（PDI）為 0.104±0.09，平均 Zeta 電位為（-29.33±4.77）mV，說明β-胡蘿卜素-薏苡仁油復合脂質體分散性良好，比較穩(wěn)定。

2.3.2 透射電子顯微鏡觀察 單一的β-胡蘿卜素脂質體及β-胡蘿卜素-薏苡仁油復合脂質體的透射電鏡結果如圖8 a1、a2、b1、b2所示，結果顯示，復合脂質體與單一的β-胡蘿卜素脂質體都呈現(xiàn)出圓整、規(guī)則的球形，且都可觀察到清晰的脂質體特有的紋理結構，未見顆粒聚集情況，但復合脂質體的分散效果明顯比單一的β-胡蘿卜素脂質體好，這可能是薏苡仁油的加入改善了β-胡蘿卜素在體系中的溶解性，使其更順利地包埋于脂質體體系中。

圖8 β-胡蘿卜素脂質體（a）與β-胡蘿卜素-薏苡仁油復合脂質體（b）的透射電鏡圖Fig.8 TEM images of β-carotene liposome（a） and β-carotene-coix seed oil complex liposome

2.4 DPPH自由基清除能力

為了研究β-胡蘿卜素-薏苡仁油復合脂質體的氧化穩(wěn)定性，以及薏苡仁油對體系的穩(wěn)定作用。本試驗首先制備了不同β-胡蘿卜素與薏苡仁油質量比（1∶1、1∶5、1∶10，m∶m）的復合脂質體，然后以空白脂質體：L（CG）、薏苡仁油脂質體：L（cso）、β-胡蘿卜素脂質體：L（β-c）為對照，對以上樣品在貯藏期間DPPH自由基清除能力進行了測定及分析。

各種脂質體DPPH自由基清除能力結果如圖9所示，結果表明，較空白脂質體而言，單一的β-胡蘿卜素脂質體和薏苡仁油脂質體都有更強的DPPH自由基清除能力，且薏苡仁油脂質體的抗氧化能力更強，β-胡蘿卜素憑其特有的共軛結構也能夠有效清除DPPH自由基，而薏苡仁油富含亞油酸、油酸等不飽和脂肪酸，其不飽和共價鍵能夠與DPPH自由基發(fā)生反應而消除自由基[23]，同時，復合脂質體的DPPH自由基清除能力比單一的脂質體都強，且隨著薏苡仁油含量的升高，DPPH自由基清除能力明顯增強，說明將β-胡蘿卜素與薏苡仁油復合能夠提高體系的抗氧化能力。

圖9 L（CG）、L（cso）、L（β-c）、L（β-c+cso）1∶1、L（β-c+cso）1∶5、L（β-c+cso）1∶10 的DPPH 自由基清除能力Fig.9 DPPH radical-scavening activity of L（CG），L（cso），L（β-c），L（β-c+cso）1∶1，L（β-c+cso）1∶5 and L（β-c+cso）1∶10

3 結論

本試驗通過Box-Behnken響應面法優(yōu)化出β-胡蘿卜素-薏苡仁油復合脂質體的最佳制備工藝條件為：制備溫度43℃，卵磷脂與膽固醇質量比7∶1，PBS緩沖液的體積為25 mL，該條件下β-胡蘿卜素的包封率的理論值為84.39%，與實際值81.22%基本一致，模型方程高度顯著，擬合性良好。表征結果顯示復合脂質體的平均粒徑為（187.9±7.5）nm，多分散系數(shù)為 0.104±0.09，平均Zeta電位為 （-29.33±4.77）mV其形態(tài)分布均勻，有脂質體特有的清晰的紋理結構，且較單一的β-胡蘿卜素脂質體而言，其分布狀況更好。DPPH試驗顯示復合脂質體清除DPPH自由基的能力隨著薏苡仁油含量的提高而明顯增強，說明將二者復合能夠有效提高體系的氧化穩(wěn)定性。

本研究將為新型的復合脂質體的制備奠定一定的理論基礎，同時將為類胡蘿卜素與植物油的共同利用提供依據(jù)。