深海養(yǎng)殖大黃魚(yú)魚(yú)肉玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化調(diào)控技術(shù)

楊巨鵬，張登科，洪夢(mèng)蓉，張慧恩，呂春霞，楊華*

1(浙江萬(wàn)里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院,浙江 寧波，315100) 2(寧波海關(guān)技術(shù)中心，浙江 寧波，315020)

大黃魚(yú)(Pseudosciaenacrocea)，屬硬骨魚(yú)綱，鱸形目，為傳統(tǒng)“四大海產(chǎn)”之一，是我國(guó)近海主要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)[1]。自20世紀(jì)70年代以來(lái)，由于酷漁濫捕，導(dǎo)致海洋中大黃魚(yú)自然資源衰退，已形不成漁汛；20世紀(jì)80年代，大黃魚(yú)人工繁育技術(shù)突破后，近海大黃魚(yú)網(wǎng)箱養(yǎng)殖迅速發(fā)展，大黃魚(yú)已成為我國(guó)規(guī)模最大的海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)[2]。海灣傳統(tǒng)小網(wǎng)箱高密度養(yǎng)殖條件下，大黃魚(yú)表現(xiàn)出肥滿(mǎn)度升高、體色異常、體脂含量增加、肉質(zhì)松散、風(fēng)味退化等品質(zhì)下降現(xiàn)象，不能滿(mǎn)足部分消費(fèi)者對(duì)大黃魚(yú)產(chǎn)品品質(zhì)的需求[3]，所以野生大黃魚(yú)市場(chǎng)價(jià)格非常高[4]。目前，為滿(mǎn)足消費(fèi)者對(duì)高品質(zhì)大黃魚(yú)的需求，通過(guò)養(yǎng)殖技術(shù)和養(yǎng)殖模式的改進(jìn)，養(yǎng)殖大黃魚(yú)的品質(zhì)、外觀(guān)已接近野生大黃魚(yú)[5]，但其市場(chǎng)價(jià)格也遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)養(yǎng)殖大黃魚(yú)。

深海養(yǎng)殖大黃魚(yú)通常作為生鮮商品流通，客戶(hù)對(duì)其鮮度和色澤等要求很高，其保質(zhì)期很短，所以在物流過(guò)程中需要良好的保障措施來(lái)保證產(chǎn)品品質(zhì)。目前國(guó)內(nèi)仍主要采用低溫保鮮技術(shù)(即冰溫保鮮)，但低溫保鮮時(shí)間短，而且在保鮮過(guò)程中水產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)流失大，存在口感降低、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值損失等問(wèn)題[6]。因此需要研究新的保鮮技術(shù)替代原有的保鮮技術(shù)，從而對(duì)產(chǎn)品實(shí)現(xiàn)更好的品質(zhì)控制。玻璃態(tài)凍藏技術(shù)為食品貯藏開(kāi)辟了一條嶄新的、富有巨大潛力的道路[7]。食品處于玻璃態(tài)，一切受擴(kuò)散控制的松弛過(guò)程都將被抑制，反應(yīng)速率極其緩慢甚至不會(huì)發(fā)生[8]，所以玻璃化保存可以最大限度地保持食品的品質(zhì)，玻璃態(tài)食品也常被認(rèn)為是穩(wěn)定的[9]。近幾年，食品玻璃化轉(zhuǎn)變?cè)诠遊10-11]、淀粉類(lèi)食品[12]、乳制品[13]、冷凍禽畜肉類(lèi)[14]、糖果類(lèi)[15]及水產(chǎn)品[16]等食品貯藏方面均有研究報(bào)道。

發(fā)生玻璃化轉(zhuǎn)變時(shí)的溫度稱(chēng)為玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(glass transition temperature,Tg)，它是控制食品質(zhì)量和穩(wěn)定性的關(guān)鍵[17]。根據(jù)玻璃化轉(zhuǎn)變理論，冷凍食品最適宜的貯藏溫度T≤Tg，而當(dāng)T>Tg時(shí)，體系處于橡膠態(tài)，分子流動(dòng)性增加，各種分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)控制的化學(xué)反應(yīng)加快[18]。而水產(chǎn)品中水分含量較高，其Tg太低，對(duì)其進(jìn)行玻璃態(tài)保藏成本較高，水產(chǎn)品中組分較多，其玻璃化轉(zhuǎn)變也十分復(fù)雜。一般來(lái)說(shuō)，Tg受食品中糖類(lèi)相對(duì)分子質(zhì)量大小影響,對(duì)純物質(zhì)而言，相對(duì)分子質(zhì)量越大，Tg就越高；相對(duì)分子質(zhì)量低時(shí)，隨著相對(duì)分子質(zhì)量的增加，玻璃化轉(zhuǎn)變溫度急劇升高[18],目前國(guó)內(nèi)外也逐漸開(kāi)展此方面的研究[19]。本文通過(guò)研究不同食品添加物對(duì)深海養(yǎng)殖大黃魚(yú)Tg的影響，篩選最適的復(fù)合配方，提高其Tg，降低其玻璃態(tài)保藏成本，為水產(chǎn)品的玻璃化保存技術(shù)的研究與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

深海養(yǎng)殖大黃魚(yú),寧波市水產(chǎn)市場(chǎng)，體重(500±25)g，體長(zhǎng)(30±3)cm，用冰盒運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后進(jìn)行樣品處理；麥芽糊精、低聚異麥芽糖、羧甲基纖維素(CMC)、海藻糖、海藻酸鈉、乳酸鈉、檸檬酸鈉均為BR級(jí),源葉生物有限公司。

PL2002電子分析天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；131EVO差示掃描微量熱儀,法國(guó)塞塔拉姆；ALPHA2-4冷凍干燥儀，上海實(shí)維實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司；S-3400N掃描電鏡，日本株式會(huì)社日立制作所。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

深海養(yǎng)殖大黃魚(yú)去鱗、去皮，取背部魚(yú)肉，放置高速組織搗碎機(jī)中制為魚(yú)糜。每50 g魚(yú)肉為1組，每組3個(gè)平行；稱(chēng)取不同組別的大分子添加劑，按參考文獻(xiàn)[20]選取麥芽糊精、低聚異麥芽糖、羧甲基纖維素(CMC)、海藻糖、海藻酸鈉、乳酸鈉、檸檬酸鈉作為添加劑。

麥芽糊精：質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%，6%；低聚異麥芽糖：質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%，6%；羧甲基纖維素(CMC)：質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%，6%；海藻糖：質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%，6%；海藻酸鈉：質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%，1%；乳酸鈉：質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%，1%；檸檬酸鈉：質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%，1%。

魚(yú)糜與添加物混合均勻后真空包裝，放置4℃冰箱中平衡滲透3 h。

1.2.2 感官評(píng)定方法

將樣品放置蒸鍋中蒸制20 min，進(jìn)行感官評(píng)定，評(píng)價(jià)員根據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 16291.1—2012[21]和GB/T 16860—1997[22]進(jìn)行培訓(xùn)，評(píng)定的參考標(biāo)準(zhǔn)[23]見(jiàn)表1。為了避免評(píng)價(jià)小組成員因各自不同嗜好等因素造成對(duì)產(chǎn)品的偏見(jiàn)，感官評(píng)定時(shí)需對(duì)樣品進(jìn)行盲標(biāo)。樣品送呈評(píng)價(jià)員之前置于20 ℃條件下進(jìn)行評(píng)定測(cè)試。每次評(píng)價(jià)由每位評(píng)價(jià)員單獨(dú)進(jìn)行，不互相交流，且在每個(gè)樣品評(píng)價(jià)之間用清水漱口，排除上1個(gè)樣品對(duì)下1個(gè)樣品的影響；并且設(shè)置6位評(píng)價(jià)員，3男3女；以指標(biāo)得分總和的平均值為感官評(píng)分。

1.2.3 凍結(jié)點(diǎn)的測(cè)定方法

采用差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry,DSC)測(cè)定樣品凍結(jié)點(diǎn)[24]，稱(chēng)取試樣5 mg，放入鋁制坩堝并壓封，放置儀器樣品盤(pán)，蓋好內(nèi)蓋，裝上冷卻罐，冷卻液為液氮。開(kāi)始溫度-130 ℃，平衡時(shí)間3 min，停止溫度0 ℃，升溫速率10 ℃/min，載氣(N2)流速50 mL/min，每個(gè)樣品重復(fù)3次。參照熱分析領(lǐng)域確定熱效應(yīng)起點(diǎn)和終點(diǎn)的通常做法，DSC熱流曲線(xiàn)由熔融峰上升側(cè)面的拐點(diǎn)處作切線(xiàn)與基線(xiàn)的交點(diǎn)，定為試樣的凍結(jié)點(diǎn)。

1.2.4Tg的測(cè)定方法

采用多次掃描法[25]測(cè)定樣品Tg，稱(chēng)取試樣5 mg，放入鋁制坩堝并壓封，放置儀器樣品盤(pán)，蓋好內(nèi)蓋，裝上冷卻罐，冷卻液為液氮。降溫至-130 ℃，平衡20 min。然后從-130 ℃升溫到20 ℃，升溫速率10 ℃/min，載氣(N2)流速50 mL/min，重復(fù)3次。采用DSC軟件分析熱流密度曲線(xiàn)，得到初始(Tgi)、中點(diǎn)(Tgm)和終點(diǎn)(Tge)的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，樣品玻璃化轉(zhuǎn)變溫度取其中點(diǎn)值Tgm。

1.2.5 掃描電鏡樣品處理

將樣品切成3 mm×3 mm×1 mm的薄片，放入3%的戊二酸溶液在4 ℃溫度下固定24 h，倒掉固定液，用0.1 mol/L的磷酸緩沖液漂洗樣品3次，每次15 min；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鋨酸溶液固定樣品1 h，倒掉固定液，用0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗樣品3次，每次15 min，依次用體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、80%、90%乙醇溶液對(duì)樣品進(jìn)行脫水處理[26]，每個(gè)濃度處理15 min，再用無(wú)水乙醇處理2次，每次10 min，再依次用V(無(wú)水乙醇)∶V(叔丁醇)混合液(3∶1、1∶1、1∶3)處理10 min，再用叔丁醇處理樣品10 min，加適量叔丁醇，放入-70 ℃冰箱2 h，然后放入冷凍干燥機(jī)干燥48 h，樣品黏貼，真空離子濺射鍵白金膜，處理好的樣品進(jìn)行電子顯微鏡觀(guān)察，拍攝樣品橫切面的500倍掃描圖像。

1.2.6 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行4因素3水平的Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)。選取Tg作為響應(yīng)值，優(yōu)化添加劑配方。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)設(shè) 3～5個(gè)平行，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS Statistics 17軟件進(jìn)行差異性顯著分析，其中P<0.05差異顯著，P>0.05 差異不顯著，使用Office excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及繪圖；采用DSC軟件分析熱流密度曲線(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

2.1.1 不同添加劑對(duì)深海養(yǎng)殖大黃魚(yú)肉感官的影響

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[20]并參考《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》(GB 2760—2014)[27]，選取麥芽糊精、低聚異麥芽糖、羧甲基纖維素(CMC)、海藻糖、海藻酸鈉、乳酸鈉、檸檬酸鈉作為添加劑，以感官評(píng)價(jià)作為測(cè)定指標(biāo)，初步篩選出合適的添加劑。

由圖1可得，空白組感官評(píng)分最佳(32.25±0.96)且差異性顯著，說(shuō)明添加物本身會(huì)影響?hù)~(yú)糜的口感；部分實(shí)驗(yàn)組略低于空白組，如3%海藻糖組(30.75±1.25)和3%麥芽糊精組(29.50±1.29)，這2組和空白組相比，感官評(píng)定差別不大，僅帶有略微的甜度；6%海藻糖組(29.25±0.96)、0.5%乳酸鈉組(28.75±1.71)、1%乳酸鈉組(28.50±0.58)、6%麥芽糊精(28.00±0.82)、0.5%檸檬酸鈉(24.75±0.96)組感官評(píng)分都有所下降，不過(guò)都尚可接受。其余實(shí)驗(yàn)組存在感官評(píng)定某項(xiàng)評(píng)分過(guò)低的問(wèn)題，如低聚異麥芽糖組存在蛋白變性嚴(yán)重，口感粗糙的問(wèn)題；CMC組口感難以接受，海藻酸鈉組無(wú)肉質(zhì)感，且出現(xiàn)糊化現(xiàn)象，均不適合作為深海養(yǎng)殖大黃魚(yú)肉的添加劑。為了進(jìn)一步篩選出復(fù)合添加劑配方，故選取海藻糖、乳酸鈉、麥芽糊精、檸檬酸鈉進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.1.2 不同濃度添加劑對(duì)深海養(yǎng)殖大黃魚(yú)魚(yú)肉凍結(jié)點(diǎn)和Tg的影響

食品凍結(jié)點(diǎn)是對(duì)食品物料進(jìn)行凍藏、運(yùn)輸、加工、銷(xiāo)售中需要了解和控制的參數(shù)之一，物料在凍結(jié)過(guò)程中，存在“最大冰晶生成帶”，由于生成大量冰晶，組織受損嚴(yán)重，造成食品品質(zhì)下降[28]，但如果冷卻速度足夠快或難以形核，以至于液體來(lái)不及成核和長(zhǎng)大，即使到了熔點(diǎn)以下也仍然保持高溫時(shí)的狀態(tài)，即液體凝固通過(guò)另一條途徑進(jìn)入過(guò)冷狀態(tài)，即可生成玻璃體[29]，因此凍結(jié)時(shí)通過(guò)“最大冰晶體生成帶”的時(shí)間短，則品質(zhì)會(huì)更好。

由圖2～圖5可知，添加海藻糖、乳酸鈉、麥芽糊精、檸檬酸鈉均會(huì)降低樣品的凍結(jié)點(diǎn)，且隨著添加量的增加，凍結(jié)點(diǎn)降低的越多，與空白對(duì)照相比，1%乳酸鈉降低了2.64 ℃，5%海藻糖降低了3.81 ℃，0.5%檸檬酸鈉降低了2.82 ℃，5%麥芽糊精降低了5.04 ℃，可能是因?yàn)闃悠坊|(zhì)濃度變大，凍結(jié)點(diǎn)降低，這與康彥[30]的研究結(jié)果一致。添加海藻糖、乳酸鈉、麥芽糊精、檸檬酸鈉均能提高樣品Tg值，且隨著添加量的增加，Tg值提高的越多；其中添加海藻糖和麥芽糊精對(duì)提高樣品Tg有較好的作用，5%海藻糖組Tg值提升至(-90.12±0.27)℃。

5%麥芽糊精組提升至(-95.52±0.29)℃，1%乳酸鈉提升至(-102.21±0.24)℃，0.5%檸檬酸鈉提升至(-100.19±0.43)℃。可能是添加物與水之間或者相鄰大分子之間存在相互作用，從而使得分子擴(kuò)散變?nèi)鹾蜏p慢，改變物質(zhì)體系的性狀，提高體系的Tg。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化添加劑配方

為研究添加物與Tg值之間的關(guān)系，優(yōu)化獲得最佳添加物復(fù)合配方，根據(jù)Box-Benhnken模型的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行4因素的響應(yīng)面試驗(yàn)，響應(yīng)面因素編碼及水平見(jiàn)表2，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

利用方差分析可以得到各個(gè)數(shù)據(jù)之間的顯著差異。運(yùn)用Design-Expert 8.0程序?qū)Ω髟囼?yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行最小二乘法擬合回歸，得到二次多元回歸方程模型為：Tg=-80.35+2.56×A+9.67×B+11.08×C+1.66×D-1.35×A×B+0.74×A×C-4.64×A×D+5.69×B×C+4.97×B×D-4.03×C×D+3.77×A2-6.57×B2-2.52×C2+1.34×D2

對(duì)模型進(jìn)行方差分析，所得結(jié)果見(jiàn)表4。

注：模型R2=0.976 3，Radj=0.9526，*P<0.05，**P<0.01

由表4可以看出F模型=41.226 1>F0.01(14,14)=3.698，P模型<0.000 1，表明回歸模型極顯著性，預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果的誤差很小，所得二次回歸方程高度顯著。此外，由模型R2=0.976 3，Radj=0.952 6可知，模型可以解釋97.63%的響應(yīng)值的變化，模型擬合度高，能較好地描述各影響因素對(duì)Tg的影響，從一定意義上證實(shí)本試驗(yàn)方法的可靠性。由表4得海藻糖和麥芽糊精(BC)交互作用最為顯著(P<0.01)，這與胡慶蘭[20]的研究結(jié)論相同；其余因素間也存在交互作用，其中乳酸鈉和檸檬酸鈉(AD)、海藻糖和檸檬酸鈉(BD)、麥芽糊精和檸檬酸鈉(CD)交互作用均為非常顯著(P<0.01)，但乳酸鈉和海藻糖(AB)、乳酸鈉和麥芽糊精(AC)交互作用均不顯著(P>0.05)，各因素間交互作用見(jiàn)圖6。

模型計(jì)算得到添加劑理論最優(yōu)組合設(shè)計(jì)為0.2%乳酸鈉、4%海藻糖、4.0%麥芽糊精、0.3%檸檬酸鈉；模型方程預(yù)測(cè)Tg值為-52.61 ℃。為驗(yàn)證響應(yīng)面法的可行性，采用此配方進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，采用3次平行試驗(yàn)的Tg實(shí)際值為-53.31 ℃，與回歸方程所得預(yù)測(cè)值相對(duì)偏差在正常偏差范圍內(nèi)，表明回歸方程能較好地反映各因素對(duì)深海養(yǎng)殖大黃魚(yú)魚(yú)肉的影響，回歸模型較為可靠。由此可知，最佳食品添加劑組合為：0.2%乳酸鈉、4.0%海藻糖、4.0%麥芽糊精、0.3%檸檬酸鈉。目前國(guó)內(nèi)外此類(lèi)研究也逐漸開(kāi)展，如SRITHAM等[31]研究表明加入NaCit可以提高低水分生物玻璃的穩(wěn)定性。康彥[30]研究表明凍藏羅非魚(yú)的Tg隨著抗凍劑添加量的增大而有所升高；SHI等[32]研究表明添加糖類(lèi)尤其是菊糖與海藻糖能顯著提高南美白對(duì)蝦肉的貯藏穩(wěn)定性，延長(zhǎng)其貨架期。

2.3 添加物質(zhì)對(duì)深海養(yǎng)殖大黃魚(yú)魚(yú)肉微觀(guān)結(jié)構(gòu)的影響

食品添加劑能改善魚(yú)糜制品的微觀(guān)結(jié)構(gòu)，原因可能是食品添加劑能與相鄰的分子緊密的包在一起，形成一種相互作用的結(jié)構(gòu)，使得分子擴(kuò)散受阻，分子變性和分子運(yùn)動(dòng)非常微弱，從而使得食品能夠維持原來(lái)良好的性狀。由圖7可得，添加最佳配方添加物的樣品掃描電鏡圖(圖7-b)與空白對(duì)照組掃描電鏡(圖7-a)相比，添加組內(nèi)部結(jié)構(gòu)緊密、均勻、表面平整，無(wú)明顯空洞，而空白組有較大的空洞，組織比較松散，說(shuō)明添加物可以與樣品蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)作用，使得凝膠更為致密，因此可以改善制品的凝膠強(qiáng)度。表明食品添加劑可能與魚(yú)肉制品中的生物大分子物質(zhì)(蛋白質(zhì)、糖、脂肪)等相互作用，提高了魚(yú)肉制品的Tg。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最佳食品添加劑組合為：0.2%乳酸鈉，4.0%海藻糖，4.0%麥芽糊精，0.3%檸檬酸鈉?？梢杂行岣邩悠返腡g，可為后來(lái)以超低溫冰箱代替?zhèn)鹘y(tǒng)液氮玻璃態(tài)儲(chǔ)藏提供理論支持，可以降低其玻璃態(tài)保藏的成本，提高普及化。食品是多相、多組分、非均質(zhì)，而水產(chǎn)品相較于果蔬等食品在物理化學(xué)性質(zhì)方面更不穩(wěn)定的，通過(guò)深入研究玻璃化轉(zhuǎn)變與食品貯藏加工中發(fā)生的一系列品質(zhì)變化機(jī)理關(guān)系，結(jié)合水動(dòng)力學(xué)和玻璃化動(dòng)力學(xué)形成一定的理論基礎(chǔ)。將玻璃化轉(zhuǎn)變溫度與水分含量和水分活度、黏度等重要的臨界參數(shù)和現(xiàn)有的技術(shù)手段相結(jié)合考慮，來(lái)實(shí)現(xiàn)真正的玻璃化保存，同時(shí)找到更好的抗凍劑及制冷劑來(lái)降低玻璃態(tài)保鮮的成本，方便其在食品保藏領(lǐng)域的推廣。