RECK基因在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中作用的研究進(jìn)展

李文文 宋少鵬 馬秀嵐

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院耳科(遼寧117004）

鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma)簡(jiǎn)稱鱗癌，又名表皮癌，起源于皮膚表皮及其附屬器(毛囊漏斗、皮脂腺導(dǎo)管、末端汗管)角質(zhì)形成細(xì)胞，多見于有鱗狀上皮覆蓋的部位，如皮膚、口腔、唇、食管、子宮頸、陰道等處。頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（Squamous cell carcinoma of the head and neck，SCCHN)是全球第六大惡性腫瘤[1]。盡管外科、放療、化療等多學(xué)科綜合治療方法在臨床應(yīng)用數(shù)十年，但SCCHN患者預(yù)后仍較差[2]。轉(zhuǎn)移是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(SCCHN)患者高死亡率的主要原因之一[3,4]，因此闡明其潛在機(jī)制可能有助于有效監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展，提高SCCHN患者的生存結(jié)局。近年來(lái)惡性腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究已進(jìn)入分子生物學(xué)的水平，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和血管基底膜的降解是惡性腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。組織和細(xì)胞的生長(zhǎng)離不開細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)所創(chuàng)造的細(xì)胞微環(huán)境，腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移牽涉到穿透ECM和血管壁層基膜、進(jìn)入細(xì)胞微環(huán)境等諸多過(guò)程。病理過(guò)程涉及腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)瘤體，浸潤(rùn)在周圍間質(zhì)中生長(zhǎng)，并通過(guò)脈管系統(tǒng)或腔道被轉(zhuǎn)運(yùn)到靶組織，最終形成轉(zhuǎn)移灶的過(guò)程。RECK基因是一種新型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑，可在轉(zhuǎn)錄后水平抑制多種MMPs的表達(dá)，進(jìn)而有效地抑制腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。

1 RECK的結(jié)構(gòu)和表達(dá)

RECK基因是1998年由日本學(xué)者Takahashi等在v-ki-ras轉(zhuǎn)染細(xì)胞株NIH3T3中發(fā)現(xiàn)的新型轉(zhuǎn)錄抑制基因。RECK基因定位于人類染色體9p12-13上，包含有21個(gè)外顯子，20個(gè)內(nèi)含子，整個(gè)基因長(zhǎng)度約87kb，其中9個(gè)位于內(nèi)含子區(qū)域（內(nèi)含子5,8,10,12,15,17），4個(gè)位于基因編碼區(qū)域（外顯子1,9,13,15），共13個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP），其轉(zhuǎn)錄子的堿基數(shù)為4.6kb。RECK是互補(bǔ)DNA編碼的膜錨定糖蛋白，其相對(duì)分子質(zhì)量為110000，由971個(gè)氨基酸共同組成。NH2端和COOH端有2個(gè)疏水區(qū)域。在NH2端有5個(gè)半胱氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)和5個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，COOH端由疏水的糖蛋白I(glycoprotein，GPI)錨定信號(hào)固定于細(xì)胞膜。含有3個(gè)中心的絲氨酸蛋白酶抑制劑（serine protease inhibitor,SPI)區(qū)域，完全符合kazal模體。一個(gè)典型的Kazal結(jié)構(gòu)域包含6個(gè)半胱氨酸殘基，形成3個(gè)二硫鍵，結(jié)構(gòu)為1-5/2-4/3-6，目前描述的大多數(shù)Kazal域都屬于這個(gè)類[5]。RECK可能在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平以及通過(guò)改變其在細(xì)胞表面的穩(wěn)定性來(lái)發(fā)揮作用。通過(guò)啟動(dòng)子甲基化可以觀察到RECK轉(zhuǎn)錄本和蛋白水平的下調(diào)[6]。RECK受致癌信號(hào)傳導(dǎo)的抑制。Ras通過(guò)Sp1的磷酸化蛋白和癌基因,與組蛋白脫乙酰酶(HDAC)結(jié)合導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的Sp1位點(diǎn)抑制RECK[7]。RECK可能從中釋放出來(lái)細(xì)胞膜溶蛋白裂解中釋放出來(lái)，這種機(jī)制受到TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)的保護(hù)。RECK在正常組織中廣泛表達(dá)，在組織發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、重塑、組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞遷移、細(xì)胞-細(xì)胞相互作用、軟骨發(fā)生、肌生成、血管生成等方面具有多種功能[8]。

2 RECK抑制腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的機(jī)制

2.1 RECK與基質(zhì)金屬蛋白酶之間的關(guān)系

MMPs是鋅/鈣依賴的內(nèi)肽酶，在不同的生物過(guò)程中需要對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行修飾，包括血管生成、組織重塑、胚胎發(fā)育、細(xì)胞遷移和形態(tài)發(fā)生等。在正常生理?xiàng)l件下大多數(shù)基質(zhì)金屬蛋白酶發(fā)揮(如干細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞活性、ECM重塑、傷口愈合、血管生成、細(xì)胞凋亡)等核心作用，基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑之間的失衡是各種病理?xiàng)l件(腫瘤浸潤(rùn)、纖維化等)的基礎(chǔ)，主要是與組織破壞和異常的ECM成分有關(guān)[9]，MMPs是一個(gè)大的酶家族，負(fù)責(zé)大多數(shù)ECM組分的降解和代謝，能夠裂解纖維膠原。MMPs通過(guò)多種方式參與腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)行為：(1)直接切割基質(zhì)結(jié)締組織和基底膜成分，驅(qū)動(dòng)侵襲和轉(zhuǎn)移；(2)膜錨定生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子及其受體的分裂或脫落；(3)分裂促凋亡因子，通過(guò)增加細(xì)胞存活、抗凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)更具有侵襲性的表型；(4)腫瘤血管生成的雙重功能，通過(guò)調(diào)動(dòng)或激活促血管生成因子而促血管生成，或通過(guò)裂解大蛋白前體而產(chǎn)生血管生成抑制劑(血管抑素、內(nèi)皮抑素、腫瘤抑素)而反血管生成；(5)細(xì)胞粘附分子的脫落，如鈣粘蛋白、CD44等，導(dǎo)致emt細(xì)胞運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)[10-14]，這些方面也見于骨轉(zhuǎn)移性乳腺癌[15-16]。MMP在癌癥研究中非常重要，因?yàn)镸MP高表達(dá)和活性幾乎與每一種人類和嚙齒類癌癥有關(guān)。它們還與腫瘤晚期、侵襲轉(zhuǎn)移增加和生存時(shí)間縮短有關(guān)。RECK基因是基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑，具有獨(dú)特的抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)與活性的功能，轉(zhuǎn)錄后能抑制多種MMPS的表達(dá)如MMP2、MMP9、MT1-MMP等[17]，在RECK蛋白的中心有三個(gè)絲氨酸蛋白酶抑制劑樣(SPI)域這些SPIs被認(rèn)為通過(guò)物理誘捕或可逆的緊密結(jié)合來(lái)抑制蛋白酶活性。SPIs可能在抑制MMPs中發(fā)揮重要作用。在蛋白質(zhì)的中間區(qū)域也有兩個(gè)具有表皮生長(zhǎng)因子樣重復(fù)的區(qū)域。一個(gè)位點(diǎn)位于蛋白質(zhì)序列的前三分之一;這是由5個(gè)具有特殊功能價(jià)值的半胱氨酸重復(fù)序列所標(biāo)記的，以及在天門冬酰胺殘基上包含幾個(gè)糖基化位點(diǎn)。這些位點(diǎn)對(duì)于與RECK蛋白的核心功能MMP9和MMP2進(jìn)行適當(dāng)?shù)南嗷プ饔弥陵P(guān)重要[18]。

2.2 RECK與血管生成的關(guān)系

在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中，腫瘤需要具有誘導(dǎo)血管生成和侵襲性的能力。腫瘤血管生成是指隨著腫瘤的增大，腫瘤細(xì)胞為生存需要而補(bǔ)充血管。侵襲性的定義是腫瘤通過(guò)穿透基底膜和其他ECM結(jié)構(gòu)從原發(fā)部位逃逸。這意味著如果這些功能能夠被抑制，腫瘤的生長(zhǎng)將會(huì)停止。VEGF家族蛋白通常在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，由于其肝素結(jié)合特性，內(nèi)皮細(xì)胞可自由溶解或與細(xì)胞表面和ECM結(jié)合。它們是血管生成的主要誘導(dǎo)因子，參與骨形成、造血、傷口愈合和發(fā)育等機(jī)體功能。在一項(xiàng)非小細(xì)胞肺癌的研究中，也研究了RECK抑制VEGF誘導(dǎo)的腫瘤血管生成的可能性。

3 RECK與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌

3.1 RECK與口腔鱗狀細(xì)胞癌（Oral squamous cell carcinoma，OSCC）

Pramanik[19]等采用RT-PCR法檢測(cè)11個(gè)正常樣本、20個(gè)非侵襲性口腔鱗癌樣本和9個(gè)侵略性口腔鱗癌樣本中RECK mRNA的表達(dá)情況。與正常的RECK基因啟動(dòng)子樣本相比，非侵襲性口腔鱗癌和侵襲性口腔鱗癌組織樣本的高甲基化程度增加，年齡組＞40和＜70歲組RECK基因啟動(dòng)子甲基化呈上升趨勢(shì)，RECK基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)與鄰近組織中RECK蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。RECK mRNA表達(dá)與RECK基因高甲基化相關(guān)，且顯著負(fù)相關(guān)。Kato[20]等研究了綠茶中主要的多酚—（Epigallocatechin-3-gallate EGCG)對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中RECK基因甲基化狀態(tài)和腫瘤侵襲的影響。結(jié)果顯示，EGCG治療口腔癌細(xì)胞部分逆轉(zhuǎn)了RECK基因的高甲基化狀態(tài)，顯著提高了RECK mRNA的表達(dá)水平。EGCG處理后，細(xì)胞中MMP-2和MMP-9水平也受到抑制。EGCG通過(guò)減少三維膠原侵襲模型中侵襲灶數(shù)量和侵襲深度，顯著抑制了癌細(xì)胞的侵襲能力。提示EGCG可能是通過(guò)對(duì)RECK等MMP抑制劑的去甲基化作用從而抑制細(xì)胞侵襲。

趙文等[21]采用RT-PCR檢測(cè)34例口腔鱗癌及癌旁組織中RECK的mRNA的表達(dá)情況，34例口腔鱗癌病癥RECK mRNA表達(dá)量0.47±0.06，癌旁病灶RECK mRNA表達(dá)量為0.95±0.13，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這一結(jié)果提示RECK基因在口腔鱗癌中為低表達(dá)，且可能與口腔鱗癌的侵襲相關(guān)。Li[22]等采用免疫組化SP法檢測(cè)RECK基因和MMP-9蛋白在60例口腔鱗癌及10例正常口腔黏膜組織中的表達(dá)，并分析與臨床病理特征的關(guān)系。RECK蛋白在口腔鱗癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為51.67%，在正?？谇火つそM織中的陽(yáng)性表達(dá)率為90%，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05),RECK和MMP-9蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-3.266,P＜0.05)。RECK和MMP-9蛋白在口腔鱗癌中的表達(dá)與病理分級(jí)、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。結(jié)果提示RECK基因可能是通過(guò)下調(diào)MMP-9蛋白的表達(dá)水平達(dá)到抑制口腔鱗癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。

3.2 RECK與中耳鱗狀細(xì)胞癌

Liu等[23]采用免疫組化方法對(duì)30例中耳鱗狀細(xì)胞癌組織和20例相鄰正常外耳道皮膚組織進(jìn)行RECK檢測(cè)。中耳鱗狀細(xì)胞癌中RECK表達(dá)陽(yáng)性率明顯低于正常外耳道皮膚。RECK的表達(dá)與腫瘤組織學(xué)分級(jí)和腫瘤分期有關(guān)，與患者年齡或性別無(wú)關(guān)。結(jié)果顯示RECK參與了中耳鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展，可作為評(píng)價(jià)中耳鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物。

3.3 RECK與喉癌

Haoran等[24]選取41例喉癌組織和癌旁組織，喉息肉組織作為對(duì)照組，采用RT-PCR和WB法檢測(cè)RECK mRNA及蛋白的表達(dá)情況，RECK喉癌組織的表達(dá)低于癌旁和息肉組織,其與MMP-14（r=-0.812,P=0.027）和VEGF（r=-0.907,P=0.013）呈負(fù)相關(guān)，其表達(dá)與病理分級(jí)、淋巴轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)（P＜0.05）；結(jié)果顯示檢測(cè)RECK基因?qū)戆┗颊叩脑\斷、轉(zhuǎn)移及臨床分期的確定具有重要意義。Jiangbo等[25]采用PV9000免疫組織化學(xué)兩步法檢測(cè)24例喉鱗癌組織及對(duì)應(yīng)深部切緣組織中RECK蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示RECK在喉癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為42%,在不同距離(2,5,10,15 mm)深部切緣組織中陽(yáng)性表達(dá)率分別為50%、58%、88%、96%。癌組織與10 mm處切緣組織比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),5 mm與10 mm處組織之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.014)。隨著喉鱗癌分化程度的降低和臨床分期從T1到T4的提高，RECK蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率呈明顯下降趨勢(shì)。提示RECK在喉癌中的高表達(dá)與喉鱗癌的侵襲轉(zhuǎn)移、病理分化及臨床分期有密切關(guān)系。10 mm的距離對(duì)于喉癌的黏膜下侵襲是可靠的，可以將其作為指導(dǎo)臨床手術(shù)的安全切緣。Cui等[26]采用甲基化特異性PCR檢測(cè)手術(shù)切除的喉鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本70例及正常喉黏膜標(biāo)本15例的RECK基因甲基化情況，放療6個(gè)周期，隨訪5年后發(fā)現(xiàn)，放療敏感47例（67.14%），放療不敏感23例（32.86%），放療敏感組RECK基因甲基化水平低于放療不敏感組（P＜0.05）；緩解組RECK基因甲基化水平低于未緩解組，RECK基因甲基化可使腫瘤未緩解的危險(xiǎn)增高5.010倍。結(jié)果顯示RECK基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化是人喉鱗狀細(xì)胞癌的早期事件，與患者的放療敏感性和治療效果具有重要關(guān)系，對(duì)放療敏感和放療效果具有提示和預(yù)測(cè)作用。

3.4 RECK與食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)

Zhu等[27]通過(guò)甲基化特異性PCR和定量PCR分析310對(duì)ESCC組織中RECK的甲基化狀態(tài)和mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在ESCCs中RECK基因平均甲基化指數(shù)(MI)為0.65，在非腫瘤樣本中為0.49。RECK在ESCC組織中的mRNA表達(dá)水平低于非腫瘤組織，且RECK mRNA表達(dá)水平降低與ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。此外，RECK基因高甲基化的ESCC患者的RECK mRNA水平與RECK基因低甲基化組比較是下降的，RECK mRNA表達(dá)水平和RECK基因甲基化指數(shù)與術(shù)后生存率低有顯著相關(guān)性。研究結(jié)果提示啟動(dòng)子高甲基化可能是導(dǎo)致RECK mRNA表達(dá)缺失的重要因素，可能是ESCC生存不良的一個(gè)指標(biāo)。Zhu等[28]采用RT-PCR和WB法檢測(cè)40對(duì)ESCC組織中RECK的mRNA及蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果顯示，在食管鱗狀細(xì)胞癌中RECK為低表達(dá)。RECK的表達(dá)與ESCC組織學(xué)分級(jí)、浸潤(rùn)深度和淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究表明，RECK是miR-16的靶點(diǎn)，miR-16過(guò)表達(dá)可以抑制ESCC細(xì)胞的凋亡。MiR-16通過(guò)結(jié)合RECK mRNA的3’UTR，下調(diào)TE-1和Eca-109細(xì)胞系中的RECK，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，在ESCC發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

3.5 RECK與鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC)

Zhou等[29]通過(guò)免疫組化檢測(cè)鼻咽癌組織60例，慢性鼻咽炎組織30例RECK蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織中RECK為低表達(dá)，其表達(dá)水平與鼻咽癌MMP9表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，此外，RECK蛋白的異常表達(dá)與EBVCA-IgA滴度、淋巴轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、存活均呈正相關(guān)。結(jié)果顯示，RECK可能通過(guò)調(diào)節(jié)MMP9的表達(dá)參與鼻咽癌的腫瘤進(jìn)展過(guò)程，可能是檢測(cè)鼻咽癌的良好預(yù)后的指標(biāo)。Deng等[30]采用原位雜交技術(shù)檢測(cè)60例原發(fā)性NPC（頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無(wú)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組各30例）、10例NPC頸部轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)（MLT）和20例慢性鼻咽炎組織（CNT）中RECK mRNA的表達(dá)情況，與CNT比較，NPC和MLT中RECK表達(dá)下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。NPC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組RECK差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。NPC中RECK異常表達(dá)與患者性別、年齡、T分期和臨床分期無(wú)關(guān)，與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和治療后5年生存期有關(guān)，且二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān),結(jié)果提示RECK基因異常表達(dá)參與了NPC的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程，可能與NPC的進(jìn)展有關(guān)。RECK可作為評(píng)估NPC頸淋巴轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及預(yù)后的生物學(xué)參考指標(biāo)。

4 展望

RECK基因的下調(diào)與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成直接相關(guān)。大量實(shí)驗(yàn)表明，RECK基因表達(dá)的高低與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌[31]患者的預(yù)后有著密切的聯(lián)系。而RECK基因是一項(xiàng)相對(duì)較新的發(fā)現(xiàn)，能否作為頭頸部鱗狀細(xì)胞癌早期診斷生物標(biāo)志物和癌癥患者延長(zhǎng)生存期指標(biāo)成為大家共同的研究目標(biāo)?？赡茉诓贿h(yuǎn)的將來(lái)[32]，人們會(huì)看到依據(jù)RECK基因而設(shè)計(jì)的分子診斷和基因治療應(yīng)用于頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的臨床治療。