石敏于寧丁大雄文藝楊風波胡一勇,李興啟呂萍*

1川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科(南充637000)

2中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)學部，國家耳鼻咽喉疾病臨床醫(yī)學研究中心聾病教育部重點實驗室，聾病防治北京市重點實驗室（北京100853）

耳聾是人類的常見疾病，據(jù)第二次全國殘疾人抽樣調(diào)查結果顯示我國有聽力障礙者約2000萬，占殘疾人總數(shù)的25%，位居各類殘疾之首[1]。而聽覺形成的起點位于耳蝸，在耳蝸中，外毛細胞(outer hair cells,OHCs)的電活動起著對聲音刺激進行主動放大的作用[2]。OHC這種高度敏感的功能需要一個極其有利的微環(huán)境，而現(xiàn)在越來越多的研究認為OHC周圍的支持細胞可以提供這個精細的微環(huán)境，同時維持Corti器的離子平衡。除了既往認為這些支持細胞僅僅起到支撐毛細胞、維持基底膜結構穩(wěn)定的作用上Smith等人[3]更加深入的研究了Hensen細胞在耳蝸功能的調(diào)節(jié)中起著至關重要的作用。Smith首先測量并報道了內(nèi)淋巴液中K+濃度超過了150 mM，耳蝸中鉀離子循環(huán)的形成主要是由于高K+可以通過外毛細胞及支持細胞之間的縫隙連接到達內(nèi)淋巴[4]。既往對鉀離子循環(huán)主要側重于研究血管紋細胞的作用，而有關支持細胞的作用研究甚少，尤其是Hensen細胞在鉀離子循環(huán)中的作用。本文回顧Hensen細胞的最新研究成果，對Hensen細胞調(diào)節(jié)耳蝸K+循環(huán)中扮演的角色以及Hensen細胞在內(nèi)耳疾病發(fā)生和發(fā)展的理論與實踐做一綜述，以進一步認識Hensen細胞在耳蝸中的重要作用。

1 Hensen細胞在K+循環(huán)中的重要作用

目前認為，耳蝸內(nèi)淋巴的高K+濃度是由血管紋邊緣細胞產(chǎn)生[5]，當毛細胞受到聲音刺激時，可將聲信號轉(zhuǎn)換成電信號，毛細胞的機械電活動使鉀離子外流，因此在毛細胞附近的蓄積的大量鉀離子可經(jīng)多種不同途徑循環(huán)進入內(nèi)淋巴，但目前關于這些可能的循環(huán)通路還未得到足夠的實驗證據(jù)來支持。根據(jù)多年研究，有學者認為支持細胞可能在維持鉀離子循環(huán)中扮演著非常重要的角色，因為經(jīng)測試淋巴流動電流提示，內(nèi)淋巴中的高鉀離子最終可經(jīng)螺旋韌帶進入血管紋[6,7]，再由血管紋分泌至內(nèi)淋巴中。哺乳動物Corti器中主要的支持細胞群包括Hensen細胞和Deiters細胞，它們位于靠近外毛細胞外排的基底膜上，并通過縫隙連接相連，從而形成胞質(zhì)合胞體，提供離子和代謝連接[8,9]。此外，Alexander[10]指出Hensen細胞可以緩沖外毛細胞附近蓄積的鉀離子，并為毛細胞附近高鉀離子向螺旋韌帶轉(zhuǎn)運提供通路[11]。Hensen細胞的鉀離子緩沖功能對聽功能很重要，因為K+代表著內(nèi)淋巴中的主要陽離子，也是感覺傳導的主要電荷載體。而這一鉀離子緩沖功能涉及到K+通道外向整流[12,13]以及支持細胞間的縫隙連接耦合[8,14,15]。Alexander[10]利用全細胞膜片鉗技術發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)ATP的缺失可導致耳蝸中Hensen細胞縫隙連接解耦，由此提出了一種假說，細胞內(nèi)ATP使對ATP敏感的內(nèi)向整流性鉀通道（Inwardly rectifying K+channels,Kir通道）處于封閉狀態(tài)，從而維持Hensen細胞的縫隙連接耦合。而在豚鼠耳蝸組織免疫熒光染色進一步首次顯示了ATP敏感的Kir通道亞單位Kir6.1和其受體（Subunits Receptor1,SUR1）在Hensen細胞中的表達，支持了上述假說。所以我們可以推測ATP敏感的Kir通道作為Hensen細胞縫隙連接偶聯(lián)的調(diào)節(jié)因子，很有可能是支持細胞代謝狀態(tài)與Corti器鉀離子循環(huán)之間的生理聯(lián)系。

縫隙連接是細胞間進行直接信息物質(zhì)交換的通道，允許代謝物、離子和小信號分子與鄰近細胞交換，縫隙連接通道是由連接子半膜形成的，連接子半膜與相鄰膜上的連接子連接。每個連接子由連接蛋白(Cx)的六聚體組裝而成[16]。目前已在小鼠基因組中發(fā)現(xiàn)19個Cx基因，在人類基因組中發(fā)現(xiàn)20個Cx基因，分別在不同的細胞類型中特異表達和調(diào)控[17]。于飛[18]等人指出GJB2基因突變可使產(chǎn)生的縫隙連接蛋白缺乏正常功能，而缺乏正常功能的縫隙連接蛋白可降低細胞間縫隙連接通透性，從而無法正常開啟連接通道，導致細胞間信息的傳遞受阻或紊亂，這將嚴重影響鉀離子的循環(huán)，從而導致嚴重的聽力下降。Blodow[16]等人的實驗是首次研究了鈣調(diào)素拮抗劑對單個Hensen細胞縫隙連接耦合的影響。Blodow采用全細胞膜片鉗技術，進一步分析了鈣調(diào)素(CaM)拮抗劑W7、三氟哌啶(TFP)和鈣調(diào)素抑制肽對Corti器官Hensen細胞縫隙連接偶聯(lián)的影響，在umol范圍內(nèi)加入常規(guī)CaM拮抗劑W7和TFP，延遲數(shù)分鐘后，縫隙連接電導率迅速呈劑量依賴性下降，而鈣離子濃度無明顯變化。該實驗結果表明，W7和TFP在鈣離子濃度不變的情況下可以誘導Hensen細胞縫隙連接解耦。另有研究發(fā)現(xiàn)，聽覺創(chuàng)傷實際上降低了耳蝸中CaM的表達[19]，所以我們有理由推測，相應的CaM依賴性縫隙連接耦合的降低削弱了Hensen細胞在鉀離子循環(huán)中的功能作用。然而，通過直接與Hensen細胞的主要縫隙連接蛋白結合來實現(xiàn)CaM依賴門控的明確證據(jù)仍未找到。目前，有關CaM與鈣離子調(diào)控耳蝸Hensen細胞縫隙連接電導進而調(diào)控鉀離子循環(huán)的分子機制有待進一步研究。

耳蝸內(nèi)的支持細胞為毛細胞提供物質(zhì)支持和營養(yǎng)，在維持耳蝸離子穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用[20,21]。ATP是一種重要的細胞外信號分子，可以激活嘌呤能(P2)受體，產(chǎn)生內(nèi)向的陽離子電流，提高內(nèi)外毛細胞內(nèi)鈣離子濃度，從而改變聲音轉(zhuǎn)導和神經(jīng)傳遞[22-26]。P2受體有兩個亞群:ATP門控的電離能(P2X)受體和G蛋白偶聯(lián)的偏代謝能(P2Y)受體，P2X和P2Y受體均在耳蝸支持細胞中表達[27-29]。Zhu等人[30]研究發(fā)現(xiàn)ATP可以通過激活P2X受體介導耳蝸支持細胞鉀離子的吸收和循環(huán)，在耳蝸離子動態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用。根據(jù)以上眾多學者研究我們可以推測，在聲音刺激時，毛細胞受到了機械刺激，離子通道開啟，鉀離子由內(nèi)淋巴進入毛細胞，毛細胞興奮后將鉀離子排出至組織間隙，再被Hensen細胞、Deiters細胞等支持細胞所攝取，而上述支持細胞所產(chǎn)生的外向性鉀電流可進一步將多余的鉀離子從支持細胞排出，依次轉(zhuǎn)運至螺旋韌帶，最終到達血管紋，再由血管紋泵入內(nèi)淋巴，從而維持毛細胞微環(huán)境中鉀離子循環(huán)及其平衡[31-33]。由此可見，Hensen細胞對耳蝸微環(huán)境尤其是鉀離子循環(huán)和平衡非常重要。

2 Hensen細胞維持EP與鉀離子平衡電位的作用

耳蝸蝸內(nèi)直流電位（endocochlear potential），舊稱內(nèi)淋巴電位（endolymphatic potential），起源于血管紋。正常耳蝸毛細胞內(nèi)的靜息電位值大約為-60mV，哺乳動物類耳蝸的EP大約在+80mV，由此可得出在正常耳蝸毛細胞纖毛的內(nèi)側與外側的絕對電位差值為+140mV，因此有人把EP比喻為耳蝸的“電源”，一旦EP因血管紋功能障礙而喪失毛細胞表皮板兩側的電位差，則所有耳蝸生物電反應和聲—電轉(zhuǎn)換功能都將消失[34]。

EP與中階的高鉀離子濃度密切相關，盡管血管紋是產(chǎn)生EP的結構早有定論，但是具體的機制還不完全清楚。由于邊緣細胞上特有的鈉鉀泵的分布，以及邊緣細胞內(nèi)部有比EP還高的正電位[35]，所以大多學者認為EP的產(chǎn)生和鉀離子的分泌來源于血管紋邊緣細胞。而在最新文獻中發(fā)現(xiàn)血管紋基底細胞有一種KCNJ10基因編碼的特殊鉀離子通道[5]，目前認為，該通道是產(chǎn)生EP的基礎，邊緣細胞更多是維持鉀離子轉(zhuǎn)運，從而間接幫助基底細胞產(chǎn)生EP，即邊緣細胞可通過從血管紋紋內(nèi)間隙吸收鉀，與此同時再將鉀離子分泌入內(nèi)淋巴，從而協(xié)同基底細胞共同維持紋內(nèi)間隙中的低鉀濃度[36]。其主要理論依據(jù)是因為Salt的電生理實驗表明在基底細胞邊界可產(chǎn)生EP，邊緣細胞邊界無EP產(chǎn)生[37]；由于內(nèi)向整流鉀電流與EP對藥物的敏感性具有相似性，Takeuchi[38]在實驗中證明EP對鉀離子通道阻滯劑敏感，由此可提示鉀離子通道有直接產(chǎn)生EP的作用。Ando選擇了一種對EP敏感的鉀離子通道阻滯劑，將該種鉀離子通道阻滯劑作用于KCNJ10鉀離子通道，結果發(fā)現(xiàn)KCNJ10鉀離子通道僅存在于基底細胞，并未在邊緣細胞中發(fā)現(xiàn)該通道[39]；而Marcus[40]采用基因敲除的實驗證實了分布于基底細胞的KCNJ10鉀離子通道在EP產(chǎn)生中的作用至關重要；更有趣的是Carlisle[41]研究基因突變的小鼠，發(fā)現(xiàn)當抑制血管紋中間細胞的存活，可以得到EP正向成分消失的結果，并且發(fā)現(xiàn)基底細胞與中間細胞有豐富的間隙連接，中間細胞缺失的動物不能產(chǎn)生EP，進而推測他們可能在功能上是一個整體。李建雄[42]在實驗中給予鉀通道阻斷劑阻斷鉀電流后，再給予ATP刺激時在Hensen細胞上沒有記錄到內(nèi)向性離子流，證明Hensen細胞上的電壓依賴性鉀電流參與了耳蝸中鉀離子循環(huán)。因此內(nèi)淋巴中的高鉀主要來源于血管紋中基底細胞、邊緣細胞等多種細胞的協(xié)同活動，血管紋中多種細胞的協(xié)同活動與耳蝸內(nèi)外毛細胞、支持細胞等參與構成鉀離子循環(huán)，鉀離子循環(huán)對于維持內(nèi)外淋巴之間鉀離子的濃度差和維持正常耳蝸功能有著至關重要的作用[43]。綜上所述，我們基本可以確定鉀電流參與了EP的形成，EP實際上是鉀離子平衡電位[44,45]。

3 Hensen細胞與內(nèi)耳疾病

如前所述，Hensen細胞對耳蝸鉀離子循環(huán)和平衡非常重要，EP的產(chǎn)生與維持首先需依賴于血管紋的功能。有實驗證明先天缺失血管紋中間細胞（或是后天抑制血管紋中間細胞的存活）可引起EP的降低甚至消失，進而造成引出聽神經(jīng)復合動作電位（compound action potential,CAP）所必需的聲壓強度閾值的升高，導致重度耳聾[46]。如果血管紋的血液供應或者能量代謝被中斷，即中階高鉀離子環(huán)境被破壞，可迅速導致EP下降，毛細胞表皮板兩側電勢差降低，進而引起毛細胞的感受器電位和神經(jīng)元的動作電位下降，換言之，EP下降可直接影響耳蝸電位，如微音器電位（cochlear microphonics potential,CM）[5]。一旦內(nèi)耳Hensen細胞受損，則進一步可破壞耳蝸中階內(nèi)鉀離子平衡環(huán)境，耳蝸的“電源”EP受到影響，造成毛細胞表皮板兩側的電動勢消失，將導致毛細胞上的機械門控離子通道的活動和耳蝸內(nèi)其他電活動無法進行，這對于臨床上很多內(nèi)耳疾病的病理機制提供了新的理論依據(jù)。

耳蝸在結構以及生理功能方面類似于人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)的血腦屏障，所以大部分觀點認為耳蝸是一種具有免疫特性的器官[47]。如噪聲性耳聾、爆震性耳聾以及藥物性耳聾等，都與耳蝸炎癥反應及耳蝸內(nèi)外淋巴液中離子活動密切相關。而其中與Hensen細胞密切相關的是參與調(diào)節(jié)耳蝸炎癥反應的Annexin蛋白（ANXA1）[48]：ANXA1是一種脂質(zhì)和鈣離子結合蛋白，且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了在豚鼠耳蝸中階（SM）的上皮細胞中表達，Kalinec等[48]進一步發(fā)現(xiàn)ANXA1在Hensen細胞的脂滴內(nèi)大量儲存，而ANXA1相關受體FPR2/ALX則廣泛分布于耳蝸上皮。

支持細胞（包括Hensen細胞和Deiter細胞）通過縫隙連接廣泛連接，這是相鄰細胞間維持聽力功能最重要的通訊通路之一[49,50]。由縫隙連接蛋白β2和β6（分別為GJB2和GJB6）編碼的connexin26（Cx26）和connexin30（Cx30）是耳蝸縫隙連接的主要蛋白亞基，其中GJB2突變是遺傳性感音神經(jīng)性聾最典型的病因[51]。此外，老化過程被認為與活性氧對線粒體的損傷有關[52]，而活性氧的產(chǎn)生與支持細胞間縫隙連接的表達和功能的改變有關，并影響連接蛋白的表達[53]，因此，Cx26可能受到耳蝸支持細胞間氧化應激的影響，從而導致與年齡有關的聽力損失（Age-related hearing loss,ARHL）。

內(nèi)耳疾病中，噪聲性聾與鉀離子和鈣離子關系密切[49,54]。正常耳蝸功能與耳蝸中鉀離子循環(huán)息息相關，其中支持細胞（包括Hensen細胞和Deiter細胞）不僅參與維持鉀離子循環(huán)過程，還具有緩沖Corti器內(nèi)外淋巴中的離子濃度，以及調(diào)制毛細胞活動等重要作用[31]。Chen[55]等人的研究證明，ATP是機體內(nèi)一種重要的調(diào)質(zhì)，而且可同時在內(nèi)外淋巴液中表達，他們發(fā)現(xiàn)在給予豚鼠噪聲暴露時，耳蝸內(nèi)ATP會明顯增加，此時給予ATP受體拮抗劑則可以明顯降低耳蝸毛細胞對噪聲刺激的敏感性，從而減輕噪聲引起的聽力損失。李建雄[56]在實驗中證明高濃度的ATP可以介導Hensen細胞產(chǎn)生非選擇性內(nèi)向性離子流，該離子流與鉀通道有非常緊密的聯(lián)系，由此我們可以推測，當機體受到噪聲的刺激，耳蝸內(nèi)ATP會明顯增加，而高濃度ATP可以引起Hensen細胞產(chǎn)生非選擇性內(nèi)向性離子流（主要是鉀電流），從而影響耳蝸鉀離子循環(huán)及耳蝸功能。楊風波[57]等人將豚鼠耳蝸Hensen細胞單獨分離出來探究其脂滴的性質(zhì)與分布特點，該實驗提出了一個假設：內(nèi)耳毛細胞實現(xiàn)聽覺換能過程的物質(zhì)基礎是充足的能量供應，外毛細胞可能可以利用Hensen細胞中的脂類物質(zhì)供能，但是有關Hensen細胞功能對內(nèi)耳疾病的影響機制有待進一步研究。

4 小結

綜上所述，近年來，耳蝸支持細胞在聽覺功能中的作用成為研究熱點，在最新研究中發(fā)現(xiàn)，Hensen細胞在內(nèi)耳鉀離子循環(huán)中扮演著重要的角色。眾所周知，EP與中階的高鉀離子濃度密切相關，一旦鉀離子循環(huán)受阻，可迅速導致EP下降，可見Hensen細胞對耳蝸功能的調(diào)節(jié)起著至關重要的作用。此外，Hensen細胞還參與了許多內(nèi)耳疾病機制的發(fā)生，如噪聲性耳聾、爆震性耳聾等?，F(xiàn)階段有關Hensen細胞的研究還較少，進一步有關Hensen細胞在耳蝸微環(huán)境中的角色的研究將會為探討耳蝸疾病的發(fā)生機制提供新的理論和實驗依據(jù)。

致謝

衷心感謝李興啟教授對本文的悉心指導。