韓 悅 姚 煦

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所，南京，210042

程序性細(xì)胞死亡因子-1(programmed cell death 1，PD-1)是一類50～55 kD的I型跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族CD28/CTL-4成員，其胞漿區(qū)N端和C端各有兩個(gè)酪氨酸殘基，前者參與構(gòu)成一個(gè)免疫受體酪氨酸抑制基序，后者則參與構(gòu)成一個(gè)免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序[1-3]。PD-1表達(dá)于活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK)、樹突細(xì)胞(DCs)以及活化的單核細(xì)胞表面[4]。研究顯示PD-1在免疫反應(yīng)尤其是T細(xì)胞免疫反應(yīng)中具有重要作用[5]，其主要通過與程序性細(xì)胞死亡因子配體1(programmed cell death ligand 1，PD-L1)或程序性細(xì)胞死亡因子配體2(programmed cell death ligand 2，PD-L2)結(jié)合后，形成PD-1/PD-1配體信號(hào)通路，激活蛋白酪氨酸磷酸酶，作為共刺激信號(hào)對(duì)T細(xì)胞免疫起到調(diào)節(jié)功能[6-8]。PD-L1分布廣泛，表達(dá)于T細(xì)胞、B細(xì)胞、DCs、巨噬細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞等;PD-L2分布相對(duì)比較局限，主要表達(dá)在活化的單核-巨噬細(xì)胞和DCs[9,10]。以往大部分學(xué)者主要研究PD-1與各系統(tǒng)腫瘤、免疫性疾病及感染性疾病的關(guān)系[11-13]，所以先前綜述集中歸納總結(jié)PD-1及其配體在腫瘤及免疫性疾病中的作用，而前者在過敏性疾病如哮喘中所扮演的角色仍沒有一個(gè)明確的結(jié)論。故本文就目前PD-1信號(hào)通路在過敏相關(guān)疾病中的研究進(jìn)展，以及未來在該類疾病防治中的潛在價(jià)值做一綜述。

1 PD-1及其配體PD-L1和PD-L2

PD-1受體最初發(fā)現(xiàn)于T細(xì)胞表面，負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞的凋亡[14]。近幾年來，不少學(xué)者揭示其在免疫耐受及各種調(diào)控作用中扮演著重要的角色。實(shí)驗(yàn)表明，PD-1缺陷小鼠可以引發(fā)自身免疫性疾病，說明PD-1在建立或維持免疫自穩(wěn)態(tài)方面起到了關(guān)鍵的作用[15]。而且，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑液和干燥綜合征的唾液中T細(xì)胞表面表達(dá)的PD-1表達(dá)水平降低異常，表明PD-1可能針對(duì)靶器官發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能[16，17]。

PD-1通過與T細(xì)胞表面上的配體結(jié)合來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。PD-1配體PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)屬于B7:CD28配體家族成員，是由IgC和IgV型胞外結(jié)構(gòu)域組成的I型跨膜糖蛋白，由位于19號(hào)染色體上的基因編碼，兩者間距為22 kb[18-20]。PD-L1與CD28的配體B7.1具有20%的氨基酸同源性，而PD-L2與CTLA-4的成熟配體B7.2具有20%的氨基酸同源性[21]。在小鼠中，PD-L1和PD-L2具有70%的氨基酸同源性，而在人類中，這兩種配體的同源性為40%，人類PD-L1和PD-L2的表達(dá)譜與小鼠具有很高的一致性[22，23]。PD-L1和PD-L2均含有短的胞質(zhì)尾，沒有已知的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)序列，表明兩者在與PD-1相互作用時(shí)不轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)。

PD-L1和PD-L2在不同組織中均有表達(dá)，在肺、心臟和肝臟中呈高表達(dá)，在脾、淋巴結(jié)和胸腺中呈低表達(dá)[24]。PD-L1表達(dá)于淋巴組織和非淋巴組織中，表明PD-1/PD-L1通路可以調(diào)節(jié)二級(jí)淋巴器官和靶器官的免疫反應(yīng)[25]。此外，PD-L1和PD-L2在抗原提呈細(xì)胞(APC)也有表達(dá)[26]。研究顯示，PD-L1表達(dá)于B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和DCs表面，體外的各種刺激，包括脂多糖(LPS)、抗CD40、抗CD3、IFN-γ和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等，均可以上調(diào)其表達(dá)水平[27，28]。與PD-L1相比，PD-L2很難在B細(xì)胞和T細(xì)胞上被誘導(dǎo)表達(dá)[29]。有文獻(xiàn)報(bào)道，經(jīng)IL-4、IFN-γ刺激后巨噬細(xì)胞和DCs上可以誘導(dǎo)出PD-L2，IL-4比IFN-γ更容易誘導(dǎo)PD-L2，而IFN-γ比IL-4在巨噬細(xì)胞上更容易誘導(dǎo)PD-L1，由于這兩種細(xì)胞因子決定著Th細(xì)胞的極化方向，這表明Th1和Th2反應(yīng)在激活PD-L1和PD-L2上的差異[30]。

現(xiàn)已證實(shí)，PD-L1在多種腫瘤中均有表達(dá)，PD-L1的表達(dá)上調(diào)與多種癌癥的不良預(yù)后密切相關(guān)[31-35]。PD-L1在不同腫瘤中所扮演的角色使其成為潛在的腫瘤免疫治療靶點(diǎn)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關(guān)的PD-L1在T細(xì)胞凋亡和腫瘤侵襲中發(fā)揮了重要作用，阻斷PD-L1可增強(qiáng)T細(xì)胞免疫治療的效果，PD-L1或PD-L2與PD-1結(jié)合抑制了T細(xì)胞的增殖和極化或改變了IL-4、IFN-γ等細(xì)胞因子的產(chǎn)生[36]。此外，PD-1缺陷小鼠自身免疫性疾病的引發(fā)也驗(yàn)證了PD-1通過誘導(dǎo)Th細(xì)胞向Th2方向極化，從而參與抑制信號(hào)。作者在文中強(qiáng)調(diào)，小鼠模型中，Th1反應(yīng)與疾病進(jìn)展相關(guān)，而Th2反應(yīng)有助于抑制疾病的發(fā)生發(fā)展[37]。PD-L1通過抑制T效應(yīng)細(xì)胞的功能及增強(qiáng)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞1(Tregs1)分泌IL-10、Th3細(xì)胞分泌TGF-β來保護(hù)組織免受T效應(yīng)細(xì)胞的攻擊導(dǎo)致的免疫損傷[38]。總之，PD-1和配體PD-L1/PD-L2在維持T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面起著關(guān)鍵作用。

2 PD-1與不同細(xì)胞的作用

2.1 PD-1與樹突狀細(xì)胞 樹突狀細(xì)胞(DCs)在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中起著非常重要的作用，雖然通常都呈遞抗原，但它們?cè)谄鹪础⒎植?、?xì)胞表面表型及功能上存在差異[39]。與T細(xì)胞結(jié)合后，DCs主導(dǎo)從誘導(dǎo)耐受到建立效應(yīng)T細(xì)胞應(yīng)答的免疫反應(yīng)類型，DCs的作用取決于多種因素，如抗原的性質(zhì)、周圍組織分泌的細(xì)胞因子和表達(dá)特定的共刺激分子的DC亞群等[40，41]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PD-L1在小鼠DCs、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞上均有表達(dá)，且在活化后表達(dá)上調(diào)[42]。也有研究表明，活化的T細(xì)胞上PD-1表達(dá)升高，其配體具有不同的表達(dá)豐度，PD-L1比PD-L2的表達(dá)水平高很多[43]。相比之下，PD-L2在肺部及肺淋巴結(jié)源DCs中表達(dá)上升，并且通過α-半乳糖神經(jīng)酰胺(α-GalCer)激活iNKT細(xì)胞后在脾DCs中上調(diào)[44，45]。肺中局部細(xì)胞因子微環(huán)境在PD-L2的表達(dá)模式中起著重要作用，且PD-L1與PD-L2可能在急性炎癥過程中扮演了相反的角色。PD-1/PD-L1在DCs中具有保護(hù)作用。相對(duì)于PD-L1與PD-L2在Th1和Th2分化方面的作用，IFN-γ、IL-4在刺激PD-L1、PD-L2表達(dá)中的作用相對(duì)更大。

2.2 PD-1配體與T細(xì)胞、NKT細(xì)胞 Tregs在抑制過敏性反應(yīng)中具有重要作用。Tregs減少、Th2細(xì)胞增多導(dǎo)致過敏性哮喘的氣道高反應(yīng)(AHR)和氣道炎癥的發(fā)展[46]。眾所周知，Tregs分泌免疫抑制因子來調(diào)控免疫應(yīng)答。之前有文獻(xiàn)報(bào)道[47]，Tregs可能通過細(xì)胞表面標(biāo)志物PD-1發(fā)揮抑制作用，PD-L1可以調(diào)控Tregs的生成。McGee等[48]發(fā)現(xiàn)PD-1在Tregs抑制AHR和氣道炎癥過程中發(fā)揮作用，小鼠脾、肺源Tregs表達(dá)的PD-1可以逆轉(zhuǎn)肺部炎癥和AHR對(duì)乙酰膽堿的作用。大部分學(xué)者認(rèn)為，PD-1與Tregs的作用機(jī)制密切相關(guān)。研究表明，PD-1/PD-L1通路可以增強(qiáng)α-GalCer介導(dǎo)誘導(dǎo)NKT細(xì)胞的不應(yīng)答[44]。Zamani等[49]揭示，細(xì)胞因子IL-2、IL-7、IL-15和IL-21直接誘導(dǎo)純化的T細(xì)胞表達(dá)PD-1和PD-L1，以及誘導(dǎo)APC上表達(dá)PD-1配體。研究表明，PD-1/PD-L配體的表達(dá)似乎不會(huì)對(duì)T細(xì)胞擴(kuò)增、功能、存活產(chǎn)生不良影響，但后者易受PD-1配體介導(dǎo)的TCR觸發(fā)抑制。

盡管PD-L1和PD-L2是最重要的PD-1配體，但一些B7家族成員的其他受體也已被報(bào)道。早期研究顯示，PD-L2共刺激CD4+T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，而這種共刺激與PD-1無(wú)關(guān)[50]。Norde等[51]發(fā)現(xiàn)，PD-L1不僅與PD-1相互作用，而且與活化的T細(xì)胞上的第二受體B7-1相互作用，并且后者可以負(fù)調(diào)控T細(xì)胞的擴(kuò)增。最近報(bào)道一種單克隆抗體可以阻斷PD-L1與PD-1、B7-1(9G2)的相互作用，導(dǎo)致在α-GalCer刺激下脾臟iNKT細(xì)胞產(chǎn)生大量IFN-γ，但對(duì)IL-4沒有任何影響。然而，選擇性阻斷PD-L1/B7-1(2H11)相互作用的PD-L1單克隆抗體對(duì)IFN-γ或IL-4的產(chǎn)生沒有影響[52]。這些結(jié)果表明，PD-1/PD-L1相互作用主要是抑制iNKT細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，TCR介導(dǎo)活化后PD-1在T細(xì)胞上的表達(dá)上調(diào)。

3 PD-1及其配體在各種過敏性疾病中的作用

3.1 過敏性接觸性皮炎 PD-1及其配體在過敏性皮膚病中也發(fā)揮了重要的作用。接觸性過敏是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)，由皮膚和黏膜表面接觸過敏原引起。皮膚和黏膜過敏反應(yīng)的臨床表現(xiàn)各不相同，Hirunwidchayarat等[53]發(fā)現(xiàn)，黏膜較皮膚激發(fā)誘導(dǎo)的炎癥更快速更嚴(yán)重，出現(xiàn)更多的粒細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)。然而，這些炎癥反應(yīng)減弱迅速，招募CD8+T細(xì)胞的CD62L-CD44low-hi記憶型細(xì)胞比例升高，IFN-γ降低、PD-1升高提示趨化的CD8+T細(xì)胞不能分化為效應(yīng)性T細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)可以解釋黏膜從嚴(yán)重炎癥中得以迅速恢復(fù)。在炎癥高峰時(shí)，黏膜上皮中優(yōu)先上調(diào)PD-L1的表達(dá)，而其缺失進(jìn)一步加速了接觸性超敏反應(yīng)(CHS)，提示局部出現(xiàn)了PD-1/PD-L1介導(dǎo)的免疫調(diào)控。Dolch等[54]研究顯示，IL-10在過敏性接觸性皮炎的調(diào)節(jié)中扮演著特殊的角色。他們分析了小鼠CHS期間IL-10的細(xì)胞來源，并發(fā)現(xiàn)皮膚中表達(dá)IL-10的CD8+T細(xì)胞具有抗原特異性。即使沒有CD4+細(xì)胞，IL-10缺乏小鼠也與對(duì)照組的CHS程度相當(dāng)，表明CD8+T細(xì)胞衍生的IL-10對(duì)減弱CHS沒有顯著作用。一直以來，朗格漢斯細(xì)胞(LCs)被認(rèn)為對(duì)接觸性過敏原產(chǎn)生炎癥免疫反應(yīng)。有研究[55]揭示了接觸過敏原對(duì)LCs中PD-L1表達(dá)以及通過改變PD-L1的表達(dá)水平來影響T細(xì)胞釋放細(xì)胞因子。首先用鎳激發(fā)過敏性接觸性皮炎患者的單核細(xì)胞源性LCs，予皮膚切片，然后用共聚焦激光掃描顯微鏡和流式細(xì)胞儀分析PD-L1的表達(dá)。阻斷實(shí)驗(yàn)顯示，與未被阻斷的CD86+MoLC相比，LPS刺激后的MoLC表面CD86被阻塞而導(dǎo)致MOLC-Th細(xì)胞共培養(yǎng)中IL-17的分泌水平顯著減少；并且，PD-1與其配體PD-L1的結(jié)合可以調(diào)控特異性Th細(xì)胞亞群分泌促炎性細(xì)胞因子(IL-17、IL-22、TNF-α、IFN-γ等)，說明Th細(xì)胞特異性細(xì)胞因子的釋放依賴于LCs的刺激和PD-L1/PD-1的相互作用。肽聚糖或LPS刺激和特異性抗體阻斷PD-L1可觸發(fā)CD4+T細(xì)胞中IL-17、IL-22、TNF-α和IFN-γ的釋放。如果用鎳作為刺激物，PD-L1的阻斷會(huì)導(dǎo)致大量的TNF-α和IL-22產(chǎn)生。CCR6+/CCR4+T記憶細(xì)胞中IL-17的分泌上調(diào)，這個(gè)過程需要依賴PD-L1。結(jié)果表明，通過調(diào)控Th細(xì)胞應(yīng)答，LCs上的PD-L1在IV型過敏反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。

3.2 過敏性哮喘 過敏性哮喘是一種與多種免疫細(xì)胞、遺傳因素和環(huán)境因素有關(guān)的復(fù)雜的慢性肺病，尤其受體內(nèi)肥大細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞影響[56]。目前很多研究也闡明了PD-L1和PD-L2在過敏性哮喘中的作用。最近發(fā)現(xiàn)，PD-L2可以顯著調(diào)節(jié)氣道炎癥和AHR，缺乏PD-L2會(huì)導(dǎo)致肺部炎癥加重和AHR，表明肺中PD-L2可抑制氣道炎癥的發(fā)生和發(fā)展[57]。有學(xué)者驗(yàn)證了PD-L2在致敏小鼠的肺DCs和巨噬細(xì)胞中高表達(dá)，在過敏原激發(fā)期間，阻斷抗PD-L2的抗體(非抗PD-1或PD-L1的抗體)可增強(qiáng)AHR和Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生。這一作用是由IFN-γ介導(dǎo)的，因?yàn)樵谟每筆D-L2抗體治療的IFN-γ缺陷小鼠中沒有觀察到這種現(xiàn)象。將PD-L2-Fc加入過敏性哮喘小鼠模型中可導(dǎo)致血清IgE水平升高、嗜酸粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)增加，PD-L2缺乏顯著推進(jìn)了小鼠AHR的進(jìn)展[58]。有文獻(xiàn)進(jìn)一步探究了PD-L1和PD-L2在AHR中的差別：在α-GalCer的刺激下，PD-L1缺陷小鼠的AHR水平降低，氣道炎癥減弱，而PD-L2缺陷小鼠的AHR水平較野生型小鼠升高[59]。這些研究提示PD-L2優(yōu)先調(diào)節(jié)過敏性哮喘反應(yīng)的效應(yīng)階段。PD-L2的抑制作用在早期研究中已有報(bào)道，Lewkowich等[60]發(fā)現(xiàn)，PD-L2在小鼠模型中負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化，并且其可能在耐受過程中起著關(guān)鍵作用。由于PD-L1可以抑制IFN-γ的產(chǎn)生，因此缺乏PD-L1會(huì)導(dǎo)致肺中AHR水平降低，炎癥和黏液分泌減少，與PD-L2在哮喘發(fā)病機(jī)制中具有相反的作用。同時(shí)在PD-L1/PD-L2雙敲除小鼠中，PD-L1和PD-L2均缺失，抵消了單敲除小鼠的作用，雙敲除小鼠出現(xiàn)了與野生型小鼠水平相當(dāng)?shù)臍獾栏叻磻?yīng)性。這些數(shù)據(jù)表明PD-L1和PD-L2可能在過敏性疾病的發(fā)病機(jī)制中具有相反的作用。盡管PD-L1對(duì)小鼠的AHR的發(fā)展至關(guān)重要，但激活PD-1/PD-L2通路可能引起保護(hù)性免疫反應(yīng)。

3.3 過敏性鼻炎 很多人將過敏性鼻炎和慢性鼻竇炎的定義混淆，過敏性鼻炎是慢性鼻竇炎的發(fā)病原因之一，過敏性鼻炎是過敏原引起的過敏反應(yīng)，只有在接觸到過敏原的狀態(tài)下，患者才會(huì)出現(xiàn)癥狀[61]。過敏性鼻炎的特點(diǎn)是鼻炎反應(yīng)過敏原暴露，近期一項(xiàng)試驗(yàn)顯示，過敏原激發(fā)導(dǎo)致體內(nèi)IL-5、CCL11和CXCL8的分泌水平升高[62]。除了氣道與皮膚，PD-1及其配體也參與過敏性鼻炎的發(fā)生發(fā)展。近年有文獻(xiàn)報(bào)道[63]，PD-1的表達(dá)水平與慢性過敏性鼻炎的嚴(yán)重性和組織IL-5的表達(dá)水平有關(guān)，而與患者自身的過敏狀態(tài)無(wú)關(guān)。作者采用PCR檢測(cè)了21例慢性過敏性鼻炎患者和21名健康對(duì)照組原代上皮細(xì)胞PD-1、PD-L1、PD-L2、TGF-β、IL-5和IL-10的表達(dá)水平，采用頜面電腦斷層掃描的Lund-Mackay評(píng)分評(píng)估疾病嚴(yán)重程度，利用流式細(xì)胞術(shù)和免疫組織化學(xué)測(cè)定PD-1和PD-L1/L2的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，慢性過敏性鼻炎患者鼻息肉組織中的PD-1及其配體PD-L1/L2的 mRNA表達(dá)增加，PD-1的表達(dá)與總CT掃描評(píng)分相關(guān)；此外，無(wú)論是對(duì)照組還是實(shí)驗(yàn)組，PD-1 mRNA與IL-5存在顯著正性相關(guān)。Kim等[64]研究發(fā)現(xiàn)，過敏性鼻炎小鼠模型中IL-5通過促進(jìn)嗅覺球細(xì)胞凋亡而抑制嗅覺再生。這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)過敏性鼻炎小鼠模型中高表達(dá)Caspase-3，用IL-5刺激后，Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增加，而Ki67表達(dá)無(wú)顯著差異。此外，通過Annexin V和PI染色進(jìn)一步證實(shí)了凋亡細(xì)胞的比例，并發(fā)現(xiàn)與其他組相比，IL-5刺激后的嗅覺球細(xì)胞的總凋亡率增加。毫無(wú)疑問，這些發(fā)現(xiàn)表明，嗅覺黏膜上的局部IL-5炎癥可能誘導(dǎo)嗅覺球細(xì)胞上的凋亡途徑，盡管凋亡信號(hào)途徑尚未明確。

3.4 其他過敏性疾病 PD-1/PD-L1/PD-L2相互作用在其他過敏性疾病中也有報(bào)道。Fukushima等[65]發(fā)現(xiàn)PD-1及其配體參與小鼠過敏性結(jié)膜炎的發(fā)生，抗PD-L2單克隆抗體治療可增強(qiáng)效應(yīng)期嗜酸粒細(xì)胞的局部浸潤(rùn)，表明PD-L2與其受體(非PD-1)之間的作用對(duì)嗜酸粒細(xì)胞向結(jié)膜的募集至關(guān)重要。近年來，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)角蛋白相關(guān)PD-L1在局部炎癥中CD8+ T細(xì)胞的功能和外周T細(xì)胞對(duì)外源性抗原的耐受中起著關(guān)鍵作用[66]。

4 PD-L1與PD-L2的前景展望

隨著PD-1配體的功能被逐漸揭示，PD-1/PD-L通路在T細(xì)胞活化、耐受和免疫介導(dǎo)的疾病中發(fā)揮著重要和多種免疫調(diào)節(jié)作用。由于PD-1在動(dòng)物模型中及其與配體間的作用，人們?cè)絹碓接信d趣研究PD-L并將之作為人類過敏性疾病的新治療靶點(diǎn)。上調(diào)人PD-1、PD-L1和PD-L2的抗體是可行的，它們與非人類靈長(zhǎng)類基因組編碼的等效分子的交叉反應(yīng)為檢驗(yàn)其在過敏性疾病發(fā)病機(jī)制的調(diào)控通路提供一個(gè)新方法。值得一提的是，通過融合蛋白或抗體PD-L1上調(diào)可能為降低過敏性疾病發(fā)病機(jī)制提供了一項(xiàng)有效途徑。

5 總結(jié)

以往學(xué)者認(rèn)為，PD-1在自身免疫、腫瘤免疫、感染免疫、移植免疫中起著關(guān)鍵作用。近年來研究揭示PD-1及其配體PD-L1和PD-L2在過敏性疾病發(fā)病機(jī)制中的重要共刺激作用。證據(jù)表明，PD-L1參與維持耐受性并誘導(dǎo)過敏。此外，過敏動(dòng)物模型顯示，在氣道高反應(yīng)或皮膚黏膜炎癥中，PD-L1和PD-L2在調(diào)控和極化T細(xì)胞方面具有相反的作用。隨著人們對(duì)PD-1及其配體了解的深入，PD-1有望成為過敏性疾病的一種新型治療方法。