地中海貧血基因檢測(cè)研究進(jìn)展

施建剛

廣西壯族自治區(qū)貴港市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西貴港 537100

地中海貧血是由于珠蛋白基因突變而引起的一組常染色體隱形遺傳病[1]。目前，地中海貧血的治療方法正處于臨床研究的過程中，難以通過有效手段來(lái)達(dá)到根治的效果，因此需要通過婚前檢查、產(chǎn)前篩查、遺傳信息指導(dǎo)等方面來(lái)控制遺傳。特別是針對(duì)攜帶了地中海貧血基因的孕婦，應(yīng)加強(qiáng)妊娠早期的產(chǎn)前基因檢查，提高地中海貧血基因的診斷率，在合理的調(diào)控下減少貧血兒的出生人數(shù)，是目前最為有效的預(yù)防手段[2]。在此，現(xiàn)對(duì)地中海貧血基因突變檢測(cè)的研究進(jìn)展作出如下綜述。

1 地中海貧血的分子基礎(chǔ)

1.1 α-地中海貧血

α-地中海貧血是現(xiàn)階段最為常見的單基因遺傳病，其發(fā)病機(jī)制在于珠蛋白基因缺失的影響，或者是缺陷使α-珠蛋白鏈合成受到抑制所形成的[3]。從基因簇來(lái)看，α-珠蛋白基因位于16號(hào)染色體末端16pl3.3點(diǎn)位上，因此也將α-地中海貧血分為兩個(gè)不同的種類，其中包括：（1）缺失型α-地中海貧血：常見的為α0地中海貧血和α+地中海貧血，前者表現(xiàn)為缺失2個(gè)α基因，后者表現(xiàn)為缺失1個(gè)α基因；（2）非缺失型α-地中海貧血：基因樣本中缺失了小部分的堿基或者基因發(fā)生點(diǎn)突變的情況。在兩種不同的α-地中海貧血類型中，已經(jīng)確定了38種為α-地中海貧血缺失類型，而基因點(diǎn)突變的非缺失α-類型約有34種[4]。

1.2 β-地中海貧血

β-地中海貧血是一種β鏈在合成過程中受到抑制作用而形成的一組血紅蛋白病，其珠蛋白基因位于11號(hào)染色體短臂11pl15上，若是患者本身存在先天性遺傳基因缺陷的問題，就會(huì)因血紅蛋白癥而引發(fā)溶血性貧血[5]。臨床的相關(guān)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，目前大部分的β-地中海貧血均通過基因突變引起的，少部分是由于基因缺失而形成。β0珠蛋白的作用在于障礙性貧血的生成，而基因突變則會(huì)導(dǎo)致β鏈出現(xiàn)抑制效果，難以正常合成，最終無(wú)法生成β鏈；β+珠蛋白的作用即使也會(huì)一直β鏈的合成，但仍可以生成部分β鏈；非典型的β-珠蛋白則會(huì)由于分子缺陷的影響，導(dǎo)致β-珠蛋白基因啟動(dòng)出現(xiàn)異常，最終在基因表達(dá)方面也會(huì)受到影響[6]。

2 地中海貧血的基因研究檢測(cè)方法

2.1 質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)

2.1.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種用于DNA片段檢測(cè)的分子生物學(xué)技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)在生物體外進(jìn)行DNA的復(fù)制功效。目前，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于地中海貧血的基因檢測(cè)中，并在此基礎(chǔ)上研究了多種類型的檢測(cè)方法，進(jìn)一步提高了臨床地中海貧血的基因檢出率。而常見的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)新技術(shù)包括：（1）基因特異性PCR-溶解曲線分析技術(shù)：Danjou等[7]在β珠蛋白基因突變的患者中應(yīng)用基因特異性PCR-溶解曲線分析技術(shù)，通過加入新型的熒光染料來(lái)了解聚合酶鏈的動(dòng)態(tài)反應(yīng)變化過程，在研究中記錄熒光值變化的溶解曲線，以每5秒的時(shí)間間隔為宜，將所得的曲線圖用于β地中海貧血基因突變的觀察中。結(jié)果顯示，基因特異性PCR-溶解曲線分析技術(shù)的應(yīng)用成本低，在實(shí)際操作的過程中無(wú)需應(yīng)用熒光標(biāo)記探針，并且具有通量高、污染輕、質(zhì)控便捷、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)。（2）單管多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)結(jié)合RDB技術(shù)：Du等[8]采集了國(guó)內(nèi)常見的缺失型α-地中海貧血基因突變的診斷標(biāo)本，并選取82例作為研究對(duì)象，分析單管多重的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)對(duì)常見的地中海貧血基因突變的RDB法，并根據(jù)擴(kuò)增圖譜和顯色斑點(diǎn)等數(shù)據(jù)來(lái)判斷標(biāo)本的突變類型，以將產(chǎn)前診斷標(biāo)本與引產(chǎn)或者出生后的胎兒基因研究進(jìn)行結(jié)果對(duì)比。結(jié)果顯示，α-地中海貧血產(chǎn)前診斷的結(jié)果與胎兒臍帶血的HbBart"s的定量結(jié)果基本一致。

2.1.2 高分辨溶解曲線分析技術(shù) 高分辨溶解曲線分析技術(shù)在臨床上的應(yīng)用中具有靈敏度高、特異性明顯等優(yōu)點(diǎn)，與定量探針法突變分析或者其他檢測(cè)技術(shù)手段相比，高分辨溶解曲線分析技術(shù)的靈敏度可高達(dá)0.1～0.8，特別是在多點(diǎn)位基因突變或者樣本量較大的點(diǎn)位篩查中，解決了傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)中性價(jià)比低、耗時(shí)長(zhǎng)等問題，因而應(yīng)用面更為廣泛，成為了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外遺傳學(xué)研究的重點(diǎn)方向之一。王晶晶等[9]在我國(guó)國(guó)內(nèi)常見的β-地中海貧血基因突變患者中應(yīng)用高分辨溶解曲線分析技術(shù)，選擇52例正常研究對(duì)象作為對(duì)照組，45例已知基因突變型患者作為觀察組；其中對(duì)照組曲線分析結(jié)果顯示基因篩查的區(qū)域中存在三個(gè)常見的SNPs，觀察組曲線分析結(jié)果顯示所有突變均能正常檢出，并且對(duì)于不同的基因型都能作出不同的溶解曲線變化圖。Mohammad等[10]在基于高分辨溶解曲線分析技術(shù)的應(yīng)用下，快速對(duì)β-地中海貧血基因突變?nèi)巳哼M(jìn)行位點(diǎn)篩查，結(jié)果顯示此類快速篩查的方法與直接所得的基因類型結(jié)果完全一致。

2.2 擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)

2.2.1 突變擴(kuò)增系統(tǒng)技術(shù) 在應(yīng)用突變擴(kuò)增系統(tǒng)技術(shù)的過程中，需要同時(shí)采用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的方法，以觀察檢測(cè)對(duì)象中是否攜帶基因突變的擴(kuò)增產(chǎn)物[11]。在現(xiàn)階段突變擴(kuò)增系統(tǒng)技術(shù)的應(yīng)用中，一般僅需要進(jìn)行單次的聚合酶鏈反應(yīng)電泳便能呈現(xiàn)出正常的檢測(cè)結(jié)果，同時(shí)具有成本低、方法簡(jiǎn)單便捷、檢測(cè)時(shí)間段等優(yōu)點(diǎn)，但其局限性在于無(wú)法一次性檢測(cè)多突變位點(diǎn)，具有方法單一、樣本容量小等缺陷。在Feng等[12]的研究中，采用突變擴(kuò)增系統(tǒng)技術(shù)檢測(cè)常見的地中海貧血突變位點(diǎn)，結(jié)果顯示，該方法能夠一次性檢測(cè)14種不同的突變位點(diǎn)情況，但是目前臨床上仍是以反向點(diǎn)雜交技術(shù)為主要應(yīng)用方法，突變擴(kuò)增系統(tǒng)技術(shù)應(yīng)用范圍有限。

2.2.2 多重連接探針擴(kuò)增技術(shù) 多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)出現(xiàn)于2002年后，起初是由荷蘭的一名學(xué)者提出的，作為一種相對(duì)定量分析技術(shù)被應(yīng)用于臨床檢測(cè)中。在多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用過程中，可明顯發(fā)現(xiàn)該方法具有靈敏度高、通量高等優(yōu)點(diǎn)，在基因序列的定量分析中，可以巧妙地結(jié)合銜接、雜交以及聚合酶鏈反應(yīng)，提高了檢測(cè)的樣本容量，可以應(yīng)用于30個(gè)以上的核苷酸序列拷貝數(shù)轉(zhuǎn)變的檢測(cè)中[13-14]。Rasoul等[15]采用多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合跨越斷裂點(diǎn)技術(shù)的檢測(cè)方法，用于地中海貧血新的基因突變類型研究中，結(jié)果顯示，發(fā)現(xiàn)1個(gè)新增的地貧突變類型，并將其稱為-α21.9。由此可見，多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)具有特異性明顯的特點(diǎn)，其良好的重復(fù)性功能可以用于檢測(cè)已知、甚至是未知的確實(shí)或重復(fù)型基因突變中。

2.2.3 跨越斷裂點(diǎn)技術(shù) 跨越斷裂點(diǎn)技術(shù)是一種檢測(cè)地中海貧血缺失型基因突變的方法，其機(jī)制和原理在于通過在缺失片段中建立引物，來(lái)了解受檢者基因中是否出現(xiàn)缺失、擴(kuò)增等情況[16]。在正常情況下，若是引物設(shè)計(jì)出現(xiàn)缺失片段時(shí)，引物之間通常會(huì)保持一定的距離，因此不會(huì)出現(xiàn)擴(kuò)增出目的的片段；若是在出現(xiàn)缺失片段的狀態(tài)下，引物之間的距離則會(huì)縮短，同時(shí)也能出現(xiàn)擴(kuò)增出目的的片段。Chan等[17]采用跨越斷裂點(diǎn)技術(shù)檢測(cè)常見的α-地中海貧血基因，結(jié)果顯示-α4.2、-（α）20.5、-αSEA等六種常見基因能夠被正常檢出，這充分說(shuō)明跨越斷裂點(diǎn)技術(shù)在地中海貧血的基因診斷中可以起到重要的作用。目前，Gap-PCR技術(shù)在應(yīng)用過程中具有設(shè)備要求低、步驟簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，但是其局限性在于未能檢測(cè)點(diǎn)突變或者未知的缺失突變基因。

2.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種以熒光化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)后產(chǎn)物總量的檢測(cè)方法，始終發(fā)生在DNA的擴(kuò)增反應(yīng)過程中，其機(jī)制在于能夠?qū)Φ刂泻Ｘ氀驑悠分械腄NA序列進(jìn)行定量分析，以了解地中海貧血患者基因突變的發(fā)展進(jìn)程。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的擴(kuò)增階段內(nèi)，熒光信號(hào)可以對(duì)其階段的發(fā)展情況進(jìn)行實(shí)時(shí)的檢測(cè)，而在反應(yīng)擴(kuò)增期間，隨著各類指數(shù)的變化影響，該模板內(nèi)的CT值和起始拷貝數(shù)均存在明顯的線性聯(lián)系，而這也是決定定量的重要依據(jù)[18]。在地中海貧血基因突變的檢測(cè)中，針對(duì)核酸拷貝數(shù)的檢測(cè)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是敏感度最高的一種方法，在DNA基因表達(dá)的研究中也應(yīng)用廣泛。Danjou等[19]選取32例常規(guī)缺失型地中海貧血患者作為研究對(duì)象，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)其進(jìn)行基因檢測(cè)，結(jié)果顯示，32例樣本中均缺失α-珠蛋白基因。由此可見，實(shí)時(shí)熒光定量PCR在檢測(cè)未知缺失類型的α-地中海貧血中檢出率較高，并且具有檢測(cè)快速便捷的特點(diǎn)，但是在未來(lái)的技術(shù)研究中，仍需要加強(qiáng)傳統(tǒng)基因檢測(cè)的不足，改善其局限性，提高檢出率。

2.3 雜交檢測(cè)技術(shù)

2.3.1 Southern印跡雜交技術(shù) 在地貧基因檢測(cè)中，Southern印跡雜交技術(shù)一直是缺失型α-地中海貧血診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[20]。經(jīng)臨床檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該技術(shù)具有穩(wěn)定性強(qiáng)、檢出率高、檢測(cè)準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但與其他檢測(cè)技術(shù)相比，也存在一定的缺點(diǎn)，如檢測(cè)時(shí)間過長(zhǎng)、操作復(fù)雜、需要加入放射同位素?zé)?。因此，Southern印跡雜交技術(shù)在常規(guī)診斷中應(yīng)用較少。

2.3.2 等位基因特異性核苷酸探針雜交技術(shù) 等位基因特異性核苷酸探針雜交技術(shù)是一種基于雜交理念下進(jìn)行基因突變檢測(cè)的技術(shù)，屬于常規(guī)檢測(cè)的一種。在檢測(cè)過程中，采用等位基因特異性核苷酸探針雜交技術(shù)擴(kuò)增目的基因的片段，以促進(jìn)產(chǎn)物與探針的雜交，進(jìn)而通過自顯影來(lái)記錄并觀察地中海貧血基因檢測(cè)的結(jié)果[21]。目前，等位基因特異性核苷酸探針雜交技術(shù)在應(yīng)用過程中具有靈敏度高、準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)，但如若針對(duì)多個(gè)突變基因進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，也會(huì)耗費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間，因此也不是地中海貧血雜交檢測(cè)技術(shù)的最優(yōu)選擇。

2.3.3 反向點(diǎn)雜交（RDB）技術(shù) 反向點(diǎn)雜交技術(shù)在1989年被Rigas等[22]提出，是一種用于檢測(cè)點(diǎn)突變的新技術(shù)。與常規(guī)的雜交檢測(cè)技術(shù)相比，固定靶DNA的方式被膜上固定探針?biāo)〈?，其機(jī)制是通過將擴(kuò)增靶序列與膜上固定探針進(jìn)行雜交，讓多種特異性的探針能過在首次雜交中篩查檢測(cè)出DNA中的突變位點(diǎn)。這一技術(shù)的出現(xiàn)和應(yīng)用，改善了ASO探針雜交技術(shù)等傳統(tǒng)檢測(cè)方法中1次檢測(cè)只能檢出1種基因突變的弊端，也體現(xiàn)出了該檢測(cè)方法的多樣性。有研究指出[23]，目前我國(guó)的地中海貧血檢測(cè)技術(shù)中，基因檢測(cè)檢出率最高的就是反向點(diǎn)雜交技術(shù)，并且具有操作便捷、診斷迅速，準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)，但與此同時(shí)仍存在一些不足之處，如費(fèi)用高、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù)雜、影響檢測(cè)結(jié)果的因素較多等，也為該檢測(cè)技術(shù)的推廣應(yīng)用帶來(lái)了一定的阻力。梁漢彰[24]在針對(duì)β-地中海貧血基因攜帶者中采用反向點(diǎn)雜交結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，結(jié)果顯示，單一的反向點(diǎn)雜交技術(shù)假陰性率為17.56%，反向點(diǎn)雜交結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的假陰性率為3.42%。由此可見，與單一的反向點(diǎn)雜交技術(shù)相比，PCR-PDB技術(shù)在檢測(cè)中的敏感度、特異性、通量更高，同時(shí)在成本和檢測(cè)時(shí)間方面也具有許多優(yōu)勢(shì)，甚至能夠在同一時(shí)間內(nèi)進(jìn)行3～5個(gè)已知基因突變的檢測(cè)，在未知突變基因檢測(cè)中也能表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)，甚至在質(zhì)量控制方面也具有顯著效果。

2.4 基因測(cè)序技術(shù)

基因測(cè)序技術(shù)是指對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的產(chǎn)物進(jìn)行突變檢測(cè)的一種方法，不僅可以通過檢測(cè)來(lái)確定受檢樣本基因突變的部位，甚至還能夠明確基因突變的性質(zhì)，在臨床地中海貧血基因檢測(cè)中起到了重要的作用。在基因測(cè)序技術(shù)的實(shí)際檢測(cè)應(yīng)用中，該技術(shù)具有靈敏度高、通量高等特點(diǎn)，并且采用了新的基因鑒定方法，在突變檢驗(yàn)中可以驗(yàn)證新方法的鑒定效果。Mohanty等[25]選用了基因測(cè)序技術(shù)結(jié)合多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)來(lái)檢測(cè)86例疑似地中海貧血基因缺陷的血清樣本，結(jié)果顯示，在檢測(cè)中能夠明確α合并β的雙重雜合缺陷基因，其中α基因型占97.1%，β基因型占62.8%，α合并β的雙重雜合基因型占26.4%。這充分提示采用基因測(cè)序技術(shù)結(jié)合多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)能夠彌補(bǔ)單次基因測(cè)序技術(shù)的不足，進(jìn)一步提高地中海貧血基因缺陷檢測(cè)的準(zhǔn)確率。

3 結(jié)語(yǔ)

隨著各類檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步和發(fā)展，地中海貧血的基因診斷技術(shù)在此類疾病的診療中起到了不可替代的作用。但是，在檢測(cè)技術(shù)實(shí)際應(yīng)用的過程中，存在操作復(fù)雜、費(fèi)用高、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)等不足，因此大部分地中海貧血患者未能體會(huì)到檢測(cè)技術(shù)帶來(lái)的效益。與此同時(shí)，在現(xiàn)階段地中海貧血基因的篩查中，檢測(cè)方法和指標(biāo)尚未完全統(tǒng)一，臨床在進(jìn)行研究的過程中也缺乏大量的樣本來(lái)進(jìn)行數(shù)據(jù)的驗(yàn)證，從而導(dǎo)致基因檢測(cè)中存在一定程度的假陽(yáng)性率或假陰性率。因此，繼續(xù)加強(qiáng)檢測(cè)方法的研究，追求一種操作便捷、經(jīng)濟(jì)便利、檢測(cè)準(zhǔn)確的技術(shù)方法成為了討論和研究的熱點(diǎn)?？傊?，在地中海貧血的基因檢測(cè)技術(shù)發(fā)展過程中，需要不斷提高各類檢測(cè)技術(shù)的質(zhì)量，提出能夠廣泛推廣的檢測(cè)技術(shù)，旨在做好地中海貧血基因診斷的工作，同時(shí)還應(yīng)加強(qiáng)新的基因突變位點(diǎn)序列的研究和分析，不斷研究新的檢測(cè)方法，對(duì)基因篩查、提高人口素質(zhì)來(lái)說(shuō)都具有積極的意義。