王進，王丹，郇傳勝，李朝陽，呂偉，周丁華

(中國人民解放軍火箭軍特色醫(yī)學中心，北京100088)

終末期肝病的最終治療手段是原位肝移植，心臟死亡器官捐獻(DCD)是主要的供肝來源，但DCD供肝常伴有嚴重的熱缺血再灌注損傷，受者術后早期肝功能明顯受到影響，移植物功能喪失發(fā)生率明顯升高[1]。為了增加供肝來源，臨床逐漸采用邊緣性供肝，其中以脂肪肝最為常見。但脂肪肝比正常肝對缺血再灌注損傷更敏感，肝功能損害、肝細胞凋亡、微循環(huán)障礙及氧化損傷更明顯，耐受缺血時間也比正常肝短，這些問題是脂肪肝供肝移植后患者肝功能障礙的主要原因[2,3]。因此，脂肪肝的脂肪變程度與移植后不良反應密切相關，決定了供肝能否用于移植手術。微透析技術是一種將灌流取樣和透析技術結合起來，并逐漸完善的一種從生物活體內(nèi)進行動態(tài)微量生化取樣的新技術，具有活體連續(xù)取樣、動態(tài)觀察、定量分析、采樣量小、組織損傷輕等特點[4]。通過微透析技術可觀察肝臟細胞外液樣本中化學物質(zhì)改變，監(jiān)測肝移植組織的代謝情況，提示細胞代謝異?；蚣毎軗p狀況[5]。2017年1～12月，本研究采用微透析技術對脂肪肝大鼠肝臟熱缺血和冷缺血過程中的能量代謝指標進行監(jiān)測，并探討脂肪變和缺血損傷對肝臟代謝能力的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級SD大鼠12只，雄性，5～7周齡，體質(zhì)量180～220 g。飼養(yǎng)于屏障設施內(nèi)，室溫控制在20～25 ℃，濕度40%～70%，12 h照明、12 h黑暗。微透析相關試劑復方氯化鈉注射液、肝素鈉注射液均購自上海第一生化藥業(yè)有限公司，UW液購自美國Bridge to life公司。微透析設備CMA402雙通道微量注射泵、CMA600微透析分析儀、CMA30線性探針以及微透析注射器、夾持器均購自瑞典CMA公司。

1.2 建模與分組處理 將12只SD大鼠隨機分為C0組、C30組、F0組、F30組，每組3只。C0組、C30組喂飼標準飼料，F(xiàn)0組、F30組喂飼高脂飼料，連續(xù)喂養(yǎng)12周。各組術前禁食12 h，自由進水,稱重后取仰臥位，戊巴比妥腹腔麻醉。C0組和F0組腹部正中線開腹，按體質(zhì)量下腔靜脈注入肝素100 U/100 g，結扎腹腔干以上主動脈；分別經(jīng)主動脈和門靜脈灌注UW液約20 mL，灌注后分離肝臟，置于冷保存液中進行冷缺血處理。C30組和F30組剪開膈肌，使心臟緩慢停搏5～10 min，造成無心跳供體(NHBD)的供肝模型，熱缺血30 min后參照上法灌注UW液、分離肝臟并進行冷缺血處理。

1.3 肝臟透析液葡萄糖、乳酸、丙酮酸、甘油水平檢測 采用微透析技術。各組冷灌注后將CMA30線性探針插入肝左葉，留在肝左葉內(nèi)約1 cm。導管連接至微量泵，用無菌復方氯化鈉溶液進行灌注，每20 min將透析液收集到微量管中。各組分別于冷缺血0、1、2、4、6、8、10、12 h，取透析液作為微透析標本，采用CMA600微透析分析儀用酶試劑和色譜方法自動檢測葡萄糖、乳酸、丙酮酸、甘油水平，同時計算乳酸/丙酮酸。

2 結果

2.1 各組不同時間點透析液葡萄糖水平比較 與同組冷缺血0 h比較，各組其余時間點透析液葡萄糖水平均降低(P均<0.05)；隨著冷缺血時間的延長，各組透析液葡萄糖水平均呈降低趨勢。F0組冷缺血2～12 h透析液葡萄糖水平均高于C0組、F30組同時間點(P均<0.05)。見表1。

表1 各組不同時間點透析液葡萄糖水平比較

注：與同組冷缺血0 h比較，*P<0.05；與C0組同時間點比較，#P<0.05；與F30組同時間點比較，△P<0.05。

2.2 各組不同時間點透析液乳酸水平比較 與同組冷缺血0 h比較，C0組其余各時間點透析液乳酸水平均降低，C30組、F0組冷缺血4～12 h透析液乳酸水平均升高(P均<0.05)；隨著冷缺血時間的延長，C0組透析液乳酸水平呈降低趨勢，C30組、F0組呈升高趨勢，F(xiàn)30組無明顯變化。與C0組同時間點比較，其余各組透析液乳酸水平均升高，以F30組升高最明顯(P均<0.05)。見表2。

表2 各組不同時間點透析液乳酸水平比較

注：與同組冷缺血0 h比較，*P<0.05；與C0組同時間點比較，#P<0.05；與F30組同時間點比較，△P<0.05。

2.3 各組不同時間點透析液丙酮酸水平比較 與同組冷缺血0 h比較，C0組、F0組冷缺血4～12 h透析液丙酮酸水平均升高，C30組、F30組冷缺血6～12 h透析液丙酮酸水平均降低(P均<0.05)；隨著冷缺血時間的延長，F(xiàn)30組透析液丙酮酸水平呈降低趨勢，其余三組無明顯變化趨勢。F30組冷缺血0～6 h透析液丙酮酸水平均高于其余各組同時間點(P均<0.05)。見表3。

表3 各組不同時間點透析液丙酮酸水平比較

注：與同組冷缺血0 h比較，*P<0.05；與C0組同時間點比較，#P<0.05；與F30組同時間點比較，△P<0.05。

2.4 各組不同時間點透析液乳酸/丙酮酸比較 與同組冷缺血0 h比較，C0組冷缺血1～12 h透析液乳酸/丙酮酸均降低，C30組、F30組冷缺血4～12 h透析液乳酸/丙酮酸水平均升高(P均<0.05)。與C0組同時間點比較，其余各組冷缺血1～12 h透析液乳酸/丙酮酸均升高，以F30組升高最明顯(P均<0.05)。見表4。

表4 各組不同時間點透析液乳酸/丙酮酸比較

注：與同組冷缺血0 h比較，*P<0.05；與C0組同時間點比較，#P<0.05；與F30組同時間點比較，△P<0.05。

2.5 各組不同時間點透析液甘油水平比較 隨著冷缺血時間的延長，C0組透析液甘油水平先降低后升高，其余各組均呈升高趨勢。與C0組同時間點比較，其余各組冷缺血1～12 h透析液甘油水平均升高，以F30組升高最明顯(P均<0.05)。見表5。

表5 各組不同時間點透析液甘油水平比較

注：與同組冷缺血0 h比較，*P<0.05；與C0組同時間點比較，#P<0.05；與F30組同時間點比較，△P<0.05。

3 討論

脂肪肝的脂肪變程度與肝移植后不良反應的發(fā)生密切相關，脂肪變程度決定了供肝能否用于移植手術。臨床上常規(guī)診斷脂肪肝的方法包括BMI、腰臀比、血清TG水平、超聲、CT、MRI和病理切片等。病理切片是判斷脂肪肝的金標準[6]，但病理判斷脂肪變程度比較主觀，很難定量，對病理醫(yī)師的經(jīng)驗要求高，而且切片厚度、染色技術等均可能對判斷脂肪變程度產(chǎn)生影響[7]。微透析技術以透析原理作為基礎，通過插入生物體內(nèi)的微透析探頭在非平衡條件下進行灌流，物質(zhì)沿濃度梯度擴散，使被分析物質(zhì)穿過細胞膜擴散進入透析管內(nèi)，并被透析管內(nèi)連續(xù)流動的灌流液不斷帶出，從而達到活體組織取樣的目的[8]。微透析系統(tǒng)由微透析導管、微量注射泵、微量收集瓶和微透析分析儀組成，微透析導管通過模擬毛細血管的被動轉運功能來監(jiān)測組織液的物質(zhì)成分變化。在肝移植領域，微透析技術已逐漸應用于臨床肝移植術前準備和術后監(jiān)測，且應用前景良好。研究表明，肝臟熱缺血1 h為供體使用極限，脂肪肝冷缺血6 h為供體使用極限，而正常肝臟冷缺血時間也不能超過24 h[9]。因此，本研究選擇心跳停止后30 min作為熱缺血時間，冷缺血時間選擇12 h作為研究時間上限，微透析檢測每隔2 h進行取樣，分析指標包括反映細胞能量代謝的相關指標葡萄糖、乳糖、丙酮酸、乳糖/丙酮酸以及反映細胞膜損傷的相關指標甘油，以研究脂肪肝及缺血對肝臟功能的影響。

糖代謝主要是指葡萄糖在體內(nèi)通過一系列復雜的化學反應產(chǎn)生能量的過程，在缺氧條件下機體則通過糖酵解生成乳酸，產(chǎn)能效率低于有氧氧化。糖酵解最主要的生理意義在于迅速提供能量，其代謝反應過程可分為兩個階段，第一階段是葡萄糖分解成丙酮酸的過程，稱為酵解途徑，第二階段是丙酮酸轉變成乳酸的過程。糖酵解反應均在細胞質(zhì)中進行，最終生成乳酸[10]。在葡萄糖的無氧代謝過程中，涉及到巴斯德效應，即有氧氧化抑制糖酵解的現(xiàn)象。當組織氧供充足時，有氧代謝抑制糖酵解，產(chǎn)生能量提供組織活動所需；缺氧時丙酮酸不能進入三羧酸循環(huán)，在細胞質(zhì)中轉變成乳酸，而丙酮酸和乳酸可通過彌散的方式通過細胞膜滲透到細胞外液中，從而可以被微透析儀器監(jiān)測到[11]。因此，監(jiān)測葡萄糖和乳酸水平可以反映肝組織內(nèi)進行的是有氧代謝還是無氧代謝，監(jiān)測丙酮酸水平可以反映肝臟代謝的能量是否充足[12,13]。乳酸水平和乳酸/丙酮酸能夠反映組織葡萄糖酵解和無氧代謝的程度，也是反映細胞缺血缺氧的標志物[14]。當細胞主要依靠無氧酵解供能時，乳酸水平升高，而丙酮酸水平下降，二者比值則升高，提示氧氣和葡萄糖供應不足[15]。本研究微透析結果顯示：①各組透析液葡萄糖水平均隨冷缺血時間均下降，說明冷保存過程中肝臟正在利用暫存的葡萄糖進行能量代謝，各組下降趨勢一致，沒有明顯差異。②C0組和C30組乳酸水平維持較低水平，說明正常肝臟具備一定的抗缺血缺氧的能力。C30組乳酸水平高于C0組，說明熱缺血導致肝臟進入無氧酵解，生成乳酸。F0組乳酸水平高于C0組，并隨冷缺血時間的延長逐漸升高，說明脂肪肝耐受缺血缺氧能力差，冷缺血后迅速進入無氧酵解方式進行能量供應，丙酮酸生成乳酸，造成乳酸持續(xù)升高。F30組熱缺血后乳酸水平即顯著升高，在冷缺血過程中無明顯變化，但整體水平顯著高于其他各組;這說明F30組冷缺血前的熱缺血階段已經(jīng)迅速啟動無氧酵解產(chǎn)生能量，30 min的熱缺血過程幾乎耗盡了脂肪肝所有的能量代謝底物，丙酮酸生成大量乳酸，造成乳酸堆積而自身又無法清除，因此肝臟處于能量缺乏狀態(tài)。③F30組冷缺血0～6 h透析液丙酮酸水平均高于其余各組同時間點，且在熱缺血后即上升到很高水平，并隨時間延長呈下降趨勢；這說明熱缺血造成了有氧代謝缺失，無氧酵解發(fā)生，產(chǎn)生大量丙酮酸，隨著冷缺血時間的延長，丙酮酸代謝生成乳酸，乳酸增加而丙酮酸減少；同時脂肪肝耐受缺血的能力差，比正常肝臟更敏感。④各組乳酸/丙酮酸變化情況與乳酸表現(xiàn)相似，但C30組該比值隨冷缺血時間升高，而F30組不僅熱缺血后比值高且隨著冷缺血時間延長而繼續(xù)升高，因此熱缺血脂肪肝不耐受缺血缺氧損傷的表現(xiàn)更加明顯。因此，對于正常肝臟30 min的熱缺血和12 h的冷缺血并未引起肝臟明顯的代謝異常，肝臟對缺血缺氧的耐受能力以及修復能力可以使其仍能基本維持一個比較正常的代謝狀態(tài);但是,脂肪肝對缺血缺氧損傷的耐受力差，無法完成這種適應性調(diào)節(jié)，代謝相關指標水平改變顯著，缺氧狀態(tài)明顯。

甘油可反映細胞損傷，其主要在脂肪酸和磷脂代謝中釋放。磷脂是細胞膜的主要成分，能量缺乏使鈣內(nèi)流和磷脂酶類激活，導致甘油從細胞膜磷脂中脫離，甘油釋放意味著細胞膜損傷[16]。研究表明，連續(xù)監(jiān)測肝臟透析液中的甘油水平能夠在移植前評估細胞膜損傷程度[17]。本研究結果顯示，隨著冷缺血時間的延長，C0組透析液甘油水平先降低后升高，其余各組均呈升高趨勢；與C0組同時間點比較，其余各組冷缺血1～12 h透析液甘油水平均升高，以F30組升高最明顯；這說明脂肪肝和熱/冷缺血均會導致肝細胞膜損傷，且多種損傷因素同時存在會加重肝損傷。因此，在冷缺血中加強對肝細胞膜的保護可以減輕肝功能損傷，改善肝移植患者預后。甘油水平監(jiān)測有助于更好地評估肝移植過程中肝臟總體的損傷情況，早期評估肝臟質(zhì)量可避免使用較差質(zhì)量的移植肝進行移植。

綜上所述，脂肪肝大鼠熱缺血后透析液葡萄糖水平降低，乳酸/丙酮酸、甘油水平升高，并隨冷缺血時間延長而加?。恢咀兒腿毖鶗斐筛渭毎麚p傷和肝臟代謝能力下降，兩種因素共同作用可導致肝損傷加重。微透析技術可以定量、敏感、持續(xù)并快速檢測供體損傷情況，是移植前供肝質(zhì)量評估實時、準確的評價方法，值得推廣。