非結核分枝桿菌臨床分離株的流行病學及臨床特征分析

周秋菊 於青峰 楊陽

[摘要] 目的 分析臺州市非結核分枝桿菌臨床分離株的流行病學及臨床特征，為非結核分枝桿菌病的疫情監(jiān)測和診斷治療提供參考依據(jù)。 方法 回顧統(tǒng)計分析我院于2015年1月～2019年12月間檢到的非結核分枝桿菌的分離率、菌種分布、混合感染情況、性別年齡構成和臨床特征等。應用DNA微陣列芯片法對分枝桿菌進行菌種鑒定。 結果 5年間共檢到非結核分枝桿菌331株，分離率為19.0%，且逐年增加。檢到的主要為胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌和龜/膿腫分枝桿菌，以胞內(nèi)分枝桿菌最為常見，占57.7%。男性高于女性，50歲以上高發(fā)。非結核分枝桿菌感染者常合并有肺結核、支氣管擴張、肺部感染和慢性阻塞性肺疾病，臨床表現(xiàn)多以咳嗽、咳痰首次就診。 結論 臺州市非結核分枝桿菌的分離率和患病率逐年增加，以胞內(nèi)分枝桿菌最為常見，DNA微陣列芯片法可以用于分枝桿菌的快速鑒定。

[關鍵詞] 非結核分枝桿菌;DNA微陣列芯片法;鳥分枝桿菌復合體;胞內(nèi)分枝桿菌

[中圖分類號] R52 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] B ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）31-0125-05

[Abstract] Objective To analyze the epidemiology and clinical feature of clinical isolates of nontuberculous mycobacteria in Taizhou， and to provide reference for epidemic monitoring，diagnosis and treatment of nontuberculous mycobacterial diseases. Methods The isolation rate， strain distribution， mixed infection， sex and age composition and clinical feature of non-tuberculous mycobacteria admitted to our hospital from January 2015 to December 2019 were analyzed retrospectively. DNA microarray chip method was used to make strain identification on mycobacteria. Results In the past five years， a total of 331 strains of non-tuberculous mycobacteria were detected， with an isolation rate of 19.0% and increasing year by year. Mycobacterium intracellulare， mycobacterium avium and mycobacterium chelonii/abscess were the main detected species， in which mycobacterium intracellulare was the most common， accounting for 57.7%. Incidence rates in men were higher than in women， with a higher incidence rate in people above 50 years old. Tuberculosis， bronchiectasis， pulmonary infection and chronic obstructive pulmonary disease often occur in patients with nontuberculous mycobacteria infection， and cough and expectoration were the first clinical manifestations. Conclusion The isolation rate and prevalence rate of nontuberculous mycobacteria in Taizhou are increasing year by year， of which intracellular mycobacteria are the most common. DNA microarray chip method is used for rapid identification of mycobacteria.

[Key words] Nontuberculous mycobacteria; DNA microarray chip method; Mycobacterium avium complex; Mycobacterium intracellulare

非結核分枝桿菌（Non-tuberculosis mycobacteria，NTM）是指結核分枝桿菌復合群和麻風分枝桿菌以外的分枝桿菌。NTM在自然環(huán)境中無處不在，多為腐物寄生菌。迄今為止，已鑒定200多種或亞種非結核分枝桿菌（http：//www.bacterio.net/mycobacterium.html），且新的菌種或亞種不斷被發(fā)現(xiàn)。其中致病的有50多種，臨床上常以鳥分枝桿菌復合體（Mycobacterium avium complex，MAC）、堪薩斯分枝桿菌和膿腫分枝桿菌為主[1]。MAC主要由胞內(nèi)分枝桿菌和鳥分枝桿菌組成。NTM可引起肺部感染和肺外感染，以肺部感染最常見，占65%～90%[2]。近年來，國內(nèi)外大量資料表明NTM的患病率和分離率呈上升趨勢，我國于1990年、2000年和2010年進行三次全國結核病流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)NTM分離率逐年上升，分別為4.9%、11.1%和22.9%[3-5]，引起廣泛關注。NTM肺病患者的臨床癥狀、病理學特征和影像學特征與肺結核極為相似，常被誤診為結核病，使用經(jīng)典的抗結核方案治療后常效果差或無效，不僅延誤了病情，還導致NTM耐藥菌株的產(chǎn)生，嚴重威脅人類的健康。DNA微陣列芯片技術能快速的對臨床上常見的17種或群分枝桿菌進行菌種鑒定，為實驗室分枝桿菌的診斷提供了有效手段。

目前為止，臺州市非結核分枝桿菌的流行病學及臨床特征尚未有詳細報道，本研究探討臺州市NTM的分離率、菌種分布、混合感染情況、性別年齡構成和臨床特征等，為臺州市NTM病的疫情監(jiān)測和診斷治療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 標本來源 ?收集我院2015年1月～2019年12月間分枝桿菌感染的各類臨床標本，除大量的痰標本外，還包括肺泡灌洗液、胸腹水、心包積液、腦脊液、膿液、胃液、尿液、糞便和病理組織標本等。

1.1.2 試劑 ?分枝桿菌核酸檢測試劑盒，購自博奧生物有限公司。檢測臨床常見的17種或群分枝桿菌，包括結核分枝桿菌復合群、胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、龜/膿腫分枝桿菌等。

1.1.3 儀器 ?晶芯Extractor36核酸快速提取儀、晶芯BioMixer 芯片雜交儀、晶芯SlideWasher 芯片洗干儀、晶芯LuxScan10K-B 微陣列芯片掃描儀均由北京博奧生物有限公司提供;T100TMThermal Cycler 梯度PCR儀購自美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

按說明書依次進行核酸提取、PCR 擴增、芯片雜交、芯片洗滌和干燥、芯片掃描和結果判讀。以試劑盒自帶的陰陽性對照作為質控。

1.3統(tǒng)計學方法

采用計數(shù)資料的統(tǒng)計描述，以相對數(shù)和構成比進行相關統(tǒng)計學分析描述，分析指標包括NTM分離率、菌種分布、混合感染情況、感染人群性別年齡構成、首次就診臨床表現(xiàn)和合并癥等。

2 結果

2.1 分枝桿菌屬的分離率

去除重復檢測的分枝桿菌臨床分離株，2015年1月～2019年12月期間采用DNA微陣列芯片技術共分離檢到1087例分枝桿菌屬，其中檢到結核分枝桿菌復合群1411例，占81.0%，而檢到非結核分枝桿菌331株，占19.0%。見表1。

2.2 非結核分枝桿菌的年分離率

去除重復檢測的臨床分離株，2015年1月～2019年12月期間采用DNA微陣列芯片法共檢到非結核分枝桿菌331株，NTM的分離率由2015年的11.1%上升到2019年的28.2%，且逐年增加。見表2。

2.3 非結核分枝桿菌的菌種分布

檢到的331株非結核分枝桿菌臨床分離株中，以胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌和龜/膿腫分枝桿菌為主，其中胞內(nèi)分枝桿菌最為常見，占57.7%，達一半以上，MAC占68.6%。并分離出少部分的淺黃分枝桿菌、草分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌。見表3。

2.4 分枝桿菌屬混合感染情況

61株分枝桿菌感染者存在著分枝桿菌屬間的混合感染，以胞內(nèi)分枝桿菌和鳥分枝桿菌的混合感染最為常見，占59.0%，其次是結核分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌的混合感染，占18.0%。見表4。

2.5非結核分枝桿菌感染者的性別和年齡分布

分離檢到的331例非結核分枝桿菌感染者中，男性多于女性，>50歲的中老年高發(fā)。見表5。

2.6合并癥

在分析合并癥的過程中，有個別病例的臨床信息缺失，未統(tǒng)計在內(nèi)。從以上非結核分枝桿菌的菌種分布情況可知，臺州市非結核分枝桿菌的感染主要以胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌和龜/膿腫分枝桿菌為常見，因此對這三類感染人群進行合并癥的統(tǒng)計分析。結果發(fā)現(xiàn)，非結核分枝桿菌感染者中的合并癥主要為肺結核、支氣管擴張、肺部感染和慢性阻塞性肺疾病。胞內(nèi)分枝桿菌感染者比例高，得到的信息相對較豐富，除了常見的合并癥外，還有少數(shù)病例合并有肺曲霉病、肺氣腫和2型糖尿病。見表6。

2.7 首次就診臨床表現(xiàn)

胞內(nèi)分枝桿菌感染者占絕大多數(shù)，因此針對胞內(nèi)分枝桿菌感染者的首次就診臨床表現(xiàn)進行統(tǒng)計分析，同樣的有16例缺失臨床信息未統(tǒng)計在內(nèi)，有36例同時合并有兩個或三個主訴。結果發(fā)現(xiàn)，以咳嗽、咳痰來首次問診的最為常見，占51.7%。見表7。

3 討論

NTM在世界各地的流行有所差異，但總的來說，NTM分離率和患病率呈上升趨勢，每年估計上升2.5%～8.0%[6]。美國NTM肺病的年患病率為（1.4～13.9）/10萬，每年上升3%[6]。日本NTM肺病的患病率由2007年的5.7/10萬上升到2014年的14.7/10萬，提高了2.6倍[7]。加拿大NTM肺病的年分離率為（14.1～22.2）/10萬，年患病率為9.8/10萬[8]。澳大利亞的年分離率為5.9/10萬，年患病率為0.56/10萬[9]。在個別發(fā)達國家，NTM的流行甚至超過了結核分枝桿菌。NTM在中國的流行趨勢表現(xiàn)為南方高于北方，東部高于西部。全國結核病流行病學調(diào)查中發(fā)現(xiàn)浙江省NTM的分離率最高，為44.89%[5]。據(jù)相關報道，杭州地區(qū)NTM的分離率從2009年的11.9%上升到2014年的25.8%，且逐年升高[10]，寧波地區(qū)NTM的總分離率為13.7%[11]，溫州地區(qū)NTM的總分離率為7.3%[12]，紹興地區(qū)NTM的總分離率為11.2%[13]，麗水地區(qū)NTM的總分離率為12.07%[14]。類似的，本研究結果顯示，臺州市非結核分枝桿菌的總分離率為19.0%，年分離率由2015年的11.1%上升到2019年的28.2%，增加幅度較大，可能是非結核分枝桿菌感染者實際人數(shù)增加，也可能是臨床醫(yī)生對非結核分枝桿菌有了更多的認識，能準確地做出診斷，還有可能與我院近來開展了非結核分枝桿菌藥敏試驗后就診患者增加所致。

MAC是一類慢生長型非結核分枝桿菌，屬于Runyon分類的Ⅲ類。MAC是大多數(shù)國家（如日本、美國、南非、澳大利亞和中國等）NTM中的主要分離株，占日本的93.3%，美國的86.0%，澳大利亞的71.0%[15]。在菌種分布上有差異，大多數(shù)地區(qū)以鳥分枝桿菌為主，而胞內(nèi)分枝桿菌在中國、南非和澳大利亞更常見[15]。在中國東部，胞內(nèi)分枝桿菌是最常見的NTM，其次是膿腫分枝桿菌[16]。而在廣州膿腫分枝桿菌復合群是最常見的NTM[17]，NTM菌種分布差異可能與地域、氣候有關。本研究發(fā)現(xiàn)非結核分枝桿菌的菌種分布中以胞內(nèi)分枝桿菌最常見，占57.7%，達一半以上，排在第二位的是鳥分枝桿菌，第三位是龜/膿腫分枝桿菌。這個結果不同于廣州，也不同于中國東部。潘愛珍等[18]研究浙江省NTM的菌種分布情況時發(fā)現(xiàn)，浙江以胞內(nèi)分枝桿菌、龜/膿腫分枝桿菌、鳥分枝桿菌為主，與本研究結果大體一致，但又有細微差別。

感染了非結核分枝桿菌不一定致病，是否患NTM病需要結合臨床癥狀、影像學特征和微生物檢查的診斷標準。非結核分枝桿菌中與臨床相關性較高的有瑪爾摩分枝桿菌（95%）、蘇爾加分枝桿菌（76%）、MAC（56%）、膿腫分枝桿菌（35%）和龜分枝桿菌（31%），而經(jīng)常分離到的偶然分枝桿菌、戈登分枝桿菌和土分枝桿菌與臨床相關性較差（1%～3%）[19]。因此，在臨床工作中，特別需要區(qū)分感染和致病，不要過度診斷治療。本研究發(fā)現(xiàn)有部分與臨床相關性差的淺黃分枝桿菌和草分枝桿菌，考慮為呼吸道定植或環(huán)境污染。且分枝桿菌屬間存在著較多的混合感染，以胞內(nèi)分枝桿菌和鳥分枝桿菌的混合感染最為常見，這可能與胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌有著高度同源性相關。其次是結核分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌的混合感染，為結核分枝桿菌患者肺部受累，易感染非結核分枝桿菌。

NTM多為條件致病菌，正常情況下不會引起人類致病，但對于免疫力低下或患有相關基礎肺部疾病時卻容易感染非結核分枝桿菌。本研究發(fā)現(xiàn)，非結核分枝桿菌感染者常合并有肺結核、支氣管擴張、肺部感染和慢性阻塞性肺疾病，此外，有部分NTM感染者合并有肺曲霉病、肺氣腫、2型糖尿病、肺大泡、兩肺結節(jié)、惡性腫瘤、艾滋病和矽肺等?；加谢A肺部疾病后，支氣管的結構遭到破壞，防御功能受損，從而易感染NTM。其臨床常表現(xiàn)為咳嗽、咳痰、咯血、胸悶氣促、發(fā)熱、胸痛、乏力、納差等，與非結核分枝桿菌感染者的主訴基本一致。因此，對于長期咳嗽、咳痰就診者應高度懷疑是否為非結核分枝桿菌的感染，應常規(guī)進行非結核分枝桿菌的篩查。男性高于女性，可能與男性吸煙者眾多，易患有基礎肺部疾病。50歲高發(fā)，可能與中老年人的抵抗力下降有關。

NTM感染者的治療與肺結核的治療有很大的不同。應用抗結核一線藥物治療往往治療無效。不同的NTM感染的用藥方案也各不相同。ATS/IDSA推薦以克拉霉素為基礎藥物，聯(lián)合利福平和乙胺丁醇組成的三聯(lián)用藥來治療MAC病，以利福平為基礎藥物，聯(lián)合異煙肼和乙胺丁醇組成的三聯(lián)用藥來治療堪薩斯分枝桿菌病[20]。因此，臨床迫切的需要一種快速準確的實驗室診斷方法可以將分枝桿菌鑒定到各個菌種或亞種。

傳統(tǒng)上結核分枝桿菌復合群與非結核分枝桿菌的初步鑒別方法是根據(jù)TCH/PNB生長試驗，由于培養(yǎng)時間長，且無法對非結核分枝桿菌進行菌種或亞種的鑒定，應用相對較局限。DNA測序作為分枝桿菌鑒定的“金標準”，可以發(fā)現(xiàn)新的菌種或亞種，但花費高，臨床應用少。MALDI-TOF也可用于分枝桿菌的菌種鑒定，但要求菌量大、菌株純，加上數(shù)據(jù)庫的不完整，臨床上分枝桿菌的檢出率反而不高。為了滿足臨床的需要，DNA微陣列芯片法應時而生。其能有效快速的鑒定臨床常見的17種分枝桿菌，缺點是不能區(qū)分活菌與死菌，不能區(qū)分同源性較高的菌種或亞種，且對實驗室建設和專業(yè)技術人員的要求較高，很多市縣級醫(yī)院無法開展，因此還需要繼續(xù)努力尋找更簡單快速準確的實驗室診斷方法。

目前，NTM的臨床診斷和治療還存在很多問題，如沒有一個簡單快速準確的生物標志物用于結核分枝桿菌和NTM的鑒別;推薦的治療方案多來自于專家的意見，治療成功率低、復發(fā)率高;尚未開發(fā)一種專用于治療NTM病的藥物;很多藥物的體外藥物敏感性與臨床療效未建立關聯(lián);NTM耐藥菌株的增加等，因此，解決問題仍需任重道遠。

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（收稿日期：2020-05-18）