霍 靜，卓春柳，羅文博，石玉祥*，柯躍華

（1. 河北工程大學(xué)，河北 邯鄲 056000；2. 安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 合肥 230000；3. 中國人民解放軍疾病預(yù)防控制中心，北京 100071）

沙門氏菌（Salmonella）作為一種性兼性厭氧胞內(nèi)致病菌，主要通過攝入受污染的食物和水，使人和動(dòng)物產(chǎn)生傷寒、副傷寒和腸胃炎等疾病，嚴(yán)重影響公共衛(wèi)生和食品安全[1]。在宿主細(xì)胞囊泡中的生存過程是沙門氏菌的重要步驟，開展對(duì)沙門氏菌與宿主細(xì)胞囊泡的相互作用研究，有助于了解沙門氏菌的胞內(nèi)生存機(jī)制，對(duì)感染沙門氏菌的臨床防控與治療具有重要意義。沙門氏菌利用兩套Ⅲ型分泌系統(tǒng)（Type three secretion system，TTSS）進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)，形成含沙門氏菌的液泡（Salmonella-containing vacuole，SCV），該液泡成熟后，不僅不與溶酶體融合，反而為胞內(nèi)生存提供有利環(huán)境。其中，TTSS-1由沙門氏菌致病性島-1（Salmonella pathogenicity islands 1，SPI-1）編碼，它在宿主細(xì)胞膜上將效應(yīng)蛋白（effect protein）注射入宿主細(xì)胞內(nèi)，協(xié)助沙門氏菌侵入細(xì)胞，形成SCV[2]。而沙門氏菌致病性島-2（Salmonella pathogenicity islands 2， SPI-2）編 碼 的TTSS-2 此時(shí)才激活，將效應(yīng)蛋白注射入細(xì)胞質(zhì)中，促進(jìn)SCV 成熟，逃避胞內(nèi)殺菌機(jī)制，并進(jìn)一步成熟，從而導(dǎo)致囊泡內(nèi)沙門氏菌大量繁殖。沙門氏菌在SCV 內(nèi)生存和復(fù)制，為其逃避模式識(shí)別受體（Pattern recognition receptor，PRR）的識(shí)別和殺傷作用創(chuàng)造了條件[3]。在正常情況下，宿主巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞通過吞噬作用對(duì)入侵微生物進(jìn)行內(nèi)化，形成吞噬體，吞噬體酸化后與溶酶體融合從而降解有害病原體，這是細(xì)胞消滅有害病原體的重要天然防御機(jī)制，然而沙門氏菌可破壞這一過程，其主要機(jī)制就是利用和多種宿主細(xì)胞器的復(fù)雜相互作用來實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)生存調(diào)控，促進(jìn)細(xì)菌的生存和繁殖[4]。本文從自噬體（Autophagosome）、溶酶體（Lysosome）和內(nèi)體（Endosome）三個(gè)重要的宿主細(xì)胞器與沙門氏菌的相互作用方面來闡明沙門氏菌如何調(diào)節(jié)所生存囊泡的功能以及相互作用機(jī)制。這些機(jī)制的闡明有助于發(fā)現(xiàn)沙門氏菌感染防治的新靶點(diǎn)和研究思路[5]。

1 自噬體在沙門氏菌感染中的作用

1.1 自噬體自噬體是存在于自噬（Autophagy）過程中的關(guān)鍵囊泡膜結(jié)構(gòu)，起源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，可包裹需降解的細(xì)胞內(nèi)容物，隨后與溶酶體融合，降解底物。自噬體的生物發(fā)生可以歸納為5 個(gè)階段：誘導(dǎo)、成核、擴(kuò)張、融合和底物降解或再循環(huán)[6]。此過程涉及36 種以上自噬相關(guān)蛋白（Autophagy-related protein，Atg）的復(fù)雜相互作用，這些蛋白質(zhì)是自噬體標(biāo)志物，參與調(diào)節(jié)自噬起始和延伸過程。其中，自噬體的形成需要Atg5、Atg12、Atg16 的參與，這些Atg 蛋白可促進(jìn)微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3 蛋白（Microtubule-associated protein1 light-chain 3，LC3）由LC-3A 到LC-3B 的轉(zhuǎn)化，并參與自噬體成熟[7]。

1.2 自噬體與沙門氏菌的相互作用沙門氏菌進(jìn)入宿主細(xì)胞后，在SCV 內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。沙門氏菌能夠主動(dòng)抑制SCV 向降解性結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化，比如使SCV 不能獲得溶酶體水解酶，這使得沙門氏菌可以借助SCV 在宿主體內(nèi)生存、繁殖并擴(kuò)散。雖然大部分侵入宿主細(xì)胞的沙門氏菌存留在SCV 中，但是一部分細(xì)菌可引起SCV 裂解，進(jìn)入胞質(zhì)，在胞漿中復(fù)制，但是從SCV 釋放后的沙門氏菌不久便會(huì)被泛素標(biāo)記[8]。NDP52、OPTN 和p62 等多種自噬受體可識(shí)別被泛素化的沙門氏菌，這些受體與富含Atg8 的自噬膜結(jié)合形成自噬體，自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體（Autolysosome），可殺死隔離在完整自噬體中的沙門氏菌[9]。

沙門氏菌效應(yīng)蛋白SifA 和SseJ 通常參與維持SCV 完整性。當(dāng)沙門氏菌開始胞內(nèi)復(fù)制時(shí)，SifA 缺乏易導(dǎo)致SCV 破裂，SifA 突變體隨SCV 破裂迅速成為自噬途徑靶點(diǎn)，破壞宿主細(xì)胞，而SseJ 缺失可以抑制SifA 突變體引起的SCV 破裂；SifA 缺乏時(shí)，SseJ 維持SCV 膜完整性的功能也降低，從而導(dǎo)致沙門氏菌進(jìn)入胞漿，這意味著SifA 和SseJ 功能緊密協(xié)調(diào)[10]。此外，研究表明，沙門氏菌TTSS-2 效應(yīng)蛋白SseF 和SseG 可通過抑制自噬作用促進(jìn)胞內(nèi)生存，這種作用由Rab1A 失活介導(dǎo)，SseF 和SseG 通過干擾運(yùn)輸?shù)鞍琢Ｗ覫II（TRAPPIII）復(fù)合物與鳥嘌呤核苷酸交換因子相互作用，從而阻止Rab1A激活。破壞Rab1A信號(hào)可阻止Unc-51類自噬激活激酶1（ULK1）的合成和激活，并降低PI（3）P 的生物合成能力，最終阻礙自噬體形成[11]?？傊?，沙門氏菌的部分效應(yīng)蛋白可以作為抗沙門氏菌躲避自噬體降解的潛在靶點(diǎn)。

2 溶酶體在沙門氏菌中的作用

2.1 溶酶體溶酶體是單膜的囊泡結(jié)構(gòu)細(xì)胞器，含有60 多種不同酸性水解酶，包括蛋白酶、核酸酶、糖苷酶、脂肪酶等，可對(duì)內(nèi)源或者外源大分子物質(zhì)進(jìn)行降解。溶酶體膜主要來源于高爾基體，主要成分為糖蛋白，分為溶酶體相關(guān)膜蛋白（Lysosome-associated membrane protein，LAMPs）、溶酶體整合膜蛋白（Lysosome integral membrance protein，LIMPs）和溶酶體糖蛋白（Lysosomal glycoprotein，LGPs）三類[12]。其中溶酶體相關(guān)膜蛋白是維持溶酶體完整性、pH和分解代謝的主要糖蛋白[13]。

2.2 溶酶體與沙門氏菌的相互作用在反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)（Trans-Golgi network，TGN）中，大多數(shù)新合成的溶酶體水解酶與甘露糖磷酸受體（Man portable robotic system，MPRs）結(jié)合，將水解酶傳遞到內(nèi)體，內(nèi)體酸化后，水解酶與MPRs 分離，這些MPRs再循環(huán)到TGN。早期內(nèi)體（Early endosome）成熟為晚期內(nèi)體（Late endosome）時(shí)，水解酶轉(zhuǎn)化為活性形式，并轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體[11]，溶酶體與含有微生物和其他外源物質(zhì)的囊泡融合，將其降解[14]。這是宿主細(xì)胞防御感染的途徑之一，然而沙門氏菌可通過干擾溶酶體水解酶的合成來干擾宿主細(xì)胞的免疫防御機(jī)制。有研究表明，沙門氏菌效應(yīng)蛋白SifA 可破壞MPRs 的再循環(huán)，干擾新合成水解酶的分泌，減弱溶酶體效力[15]。隨后，TTSS-2 增強(qiáng)SCV 與缺酶溶酶體之間的相互作用，從而為SCV 膜提供營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)沙門氏菌的生長。

LAMP-1 和LAMP-2 對(duì)于SCV 和沙門氏菌誘導(dǎo)絲（Salmonella inducing filaments，Sifs）的生物發(fā)生及穩(wěn)定性至關(guān)重要[16]。為了促進(jìn)胞內(nèi)生存，沙門氏菌將LAMP-1 和LAMP-2 從細(xì)胞表面招募到SCV 上，然后在SPI-1 效應(yīng)蛋白協(xié)助下進(jìn)入到Sifs[13]。此外，LAMP-3 由沙門氏菌感染引起，并被招募到SCV中，干擾LAMP-3 的基因表達(dá)可減少胞內(nèi)的沙門氏菌數(shù)量[17]。因此，LAMPs 在沙門氏菌的感染中發(fā)揮著重要作用。

3 內(nèi)體在沙門氏菌感染中的作用

3.1 內(nèi)體（Endosome）內(nèi)體是膜包被的囊泡結(jié)構(gòu)，主要負(fù)責(zé)將物質(zhì)從細(xì)胞膜外經(jīng)內(nèi)吞途徑運(yùn)送到溶酶體中。內(nèi)體主要分為：早期內(nèi)體、晚期內(nèi)體及循環(huán)內(nèi)體（Recycling endosome）。可以根據(jù)不同的分子標(biāo)記Rabs 進(jìn)行區(qū)分。早期內(nèi)體由管狀和小泡狀網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成，由于細(xì)胞內(nèi)吞作用而形成的含有內(nèi)吞物質(zhì)的囊泡，分子標(biāo)記主要有Rab5A 和Rab4[18]。晚期內(nèi)體也稱為多囊體（Multivesicular bodies，MVBs），與早期內(nèi)體相比體積增大，內(nèi)部酸度增加，可分揀內(nèi)吞物質(zhì)至溶酶體，分子標(biāo)記主要有Rab7 和Rab9。循環(huán)內(nèi)體位于微管組織中心，是早期內(nèi)體與質(zhì)膜之間的中間站,分子標(biāo)記為Rab11。

3.2 內(nèi)體與沙門氏菌的相互作用沙門氏菌進(jìn)入宿主細(xì)胞后，形成SCV。SCV 與循環(huán)內(nèi)吞作用的幾個(gè)組成部分相互作用，形成與早期內(nèi)體、晚期內(nèi)體和循環(huán)內(nèi)體相關(guān)的Rabs[19]，大部分Rabs 參與調(diào)節(jié)循環(huán)內(nèi)吞作用。Rab4 在感染早期與SCV 相互作用，隨后從細(xì)胞膜上消失[20]。此外，Rab11 與早期SCV 有顯著的相互作用，其從SCV 回到細(xì)胞表面，調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附受體CD44 的循環(huán)，但不調(diào)節(jié)免疫分子MHC-I 的循環(huán)[21]。

沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB 參與調(diào)節(jié)Rab35 與SCV關(guān)系[22]。SopB 通過降低SCV 膜上PI（4，5）P2 和磷脂酰絲氨酸水平，改變早期SCV 靜電表面電荷[23]，這使宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從SCV 分離，并抑制SCV 與溶酶體融合。另外，二磷酸腺苷核糖基化因子6（Adenosine diphosphate-ribosylation factor 6，ARF6）在外周質(zhì)膜和內(nèi)體系統(tǒng)中發(fā)揮作用，同時(shí)存在于SCV感染早期，參與調(diào)控膜重組區(qū)再循環(huán)。ARF6 與SCV相互作用可能是由于沙門氏菌內(nèi)化而引起的膜重排反應(yīng)[20]。因此，SopB 及ARF6 有可能成為抗沙門氏菌感染的新靶點(diǎn)。

綜上所述，由于沙門氏菌和宿主細(xì)胞之間相互作用的復(fù)雜性，對(duì)參與調(diào)控沙門氏菌與宿主細(xì)胞囊泡作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍然有限。本文通過對(duì)沙門氏菌在自噬體、溶酶體、內(nèi)體中生存機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，初步闡明自噬體、溶酶體和內(nèi)體3 個(gè)宿主細(xì)胞囊泡與沙門氏菌感染的關(guān)聯(lián)作用，為沙門氏菌感染治療提供借鑒意義。另外，探索沙門氏菌部分效應(yīng)蛋白、LAMPs、ARF6 等對(duì)沙門氏菌感染的調(diào)控作用，為沙門氏菌感染的臨床治療提供新的研究思路和靶點(diǎn)，將有望從新角度上開展對(duì)沙門氏菌感染的控制。