趙艷爭 天津市北辰醫(yī)院 （天津 300400）

內(nèi)容提要： 隨著醫(yī)療水平的發(fā)展與進步，許多醫(yī)院都建立了病原微生物實驗室，以便為臨床診斷和治療提供及時和可靠的依據(jù)。病原微生物檢測結(jié)果的解讀和感染的判定是臨床診斷重要依據(jù)，也是后期正確治療的基礎(chǔ)。在病原微生物提取的前幾個步驟中，是必須直接接觸病例的生物學(xué)樣本的。該過程涉及加熱和裂解。當(dāng)檢驗人員打開樣本容器時，含有病原微生物的氣溶膠可能會散布到空氣環(huán)境中。所以，在負壓實驗室的生物安全柜中操作更為安全。

生物安全柜通過將柜內(nèi)的空氣連續(xù)向外排出，可使柜內(nèi)負壓持續(xù)保持?？諝庥汕按安僮骺谶M入負壓風(fēng)道與柜體內(nèi)空氣充分混合后，進入靜壓箱，再通過高效過濾器處理后垂直向下，以單向?qū)恿鞯臓顟B(tài)進入操作區(qū)，操作區(qū)三面墻體（除前窗玻璃外）均為負壓風(fēng)道，這樣在外部環(huán)境和操作區(qū)之間形成了雙層隔離（氣幕隔離和箱體隔離）。而且操作區(qū)周圍均為負壓，保證不會泄漏樣品，同時由于安全柜的氣流方向是由外向內(nèi)的，頂層設(shè)有高效過濾器，氣溶膠不易溢出進入實驗室，因此病原體提取等操作在生物安全柜內(nèi)進行，可防止含有病原微生物的氣溶膠在實驗操作過程中逸出感染檢驗人員，對檢驗人員具有非常有效的防護效果。

1.生物安全柜的分類

生物安全柜在醫(yī)療器械分類中屬于三類，而且生物安全柜分為Ⅰ級、Ⅱ級和Ⅲ級[1]，以適用于不同的生物安全等級的微生物檢測要求：

1.1 一級

通過設(shè)施的排氣系統(tǒng)進行排氣或使用生物制劑時，應(yīng)保護環(huán)境和人員免受氣溶膠的侵害，但不能保護產(chǎn)品免受污染。從外部排出的空氣或房間再循環(huán)到實驗室，排氣中使用了HEPA過濾器。

1.2 二級

通過設(shè)施的排氣系統(tǒng)正確通風(fēng)以及處理生物制劑和危險藥物時，保護產(chǎn)品，實驗室人員和環(huán)境。HEPA過濾器用于外部排氣或房間再循環(huán)，空氣供應(yīng)和排氣中均使用HEPA過濾器。因此，它是應(yīng)用最廣泛的。根據(jù)入口氣流速度和排風(fēng)循環(huán)方式，二級生物安全柜可分為A1、A2、B1、B2四級[2]。

1.2.1 在A1安全柜中，通過工作臺開口面吸入口的最小平均風(fēng)速保持在0.38m/s；經(jīng)過高效過濾器處理后垂直向下的氣流，有七成是過濾的原有循環(huán)氣體，有三成是新吸入經(jīng)過過濾的補充氣體，原有的循環(huán)氣體有三成通過排氣口高效過濾器過濾排放到實驗室內(nèi)。

1.2.2 A2安全柜中，通過工作臺開口面吸入口的最小平均風(fēng)速保持在0.5m/s；經(jīng)過高效過濾器處理后垂直向下的氣流，有七成是過濾的原有循環(huán)氣體，有三成是新吸入經(jīng)過過濾的補充氣體，原有的循環(huán)氣體有三成通過排氣口高效過濾器過濾排放到室外，不再返回實驗室內(nèi)。

1.2.3 B1安全柜中，通過工作臺開放表面吸入口的最小平均風(fēng)速保持在0.5m/s；經(jīng)過高效過濾器處理后垂直向下的氣流，有三成是過濾的原有循環(huán)氣體，有七成是新吸入經(jīng)過過濾的補充氣體，即原有的循環(huán)氣體大部分都通過排氣口高效過濾器過濾排放到室外，不再返回實驗室內(nèi)。所有被生物體污染的風(fēng)管和靜壓箱應(yīng)保持負壓，或?qū)⒇搲猴L(fēng)管和靜壓箱圍起來。

1.2.4 B2安全柜中，通過工作臺開放表面吸入口的最小平均風(fēng)速保持在0.5m/s；經(jīng)過高效過濾器處理后垂直向下的氣流全部是新吸入經(jīng)過過濾的氣體，原有的循環(huán)氣體全部通過排氣口高效過濾器過濾排放到室外，不再返回實驗室內(nèi)。所有受污染的風(fēng)管和靜壓箱應(yīng)保持負壓或是被直接排風(fēng)的風(fēng)道和靜壓箱包圍。

1.3 三級

柜子通過手套與柜子相連，是完全氣密式，為確保不受污染，測試產(chǎn)品需要通過雙門分動箱進出；在處理風(fēng)險時保護產(chǎn)品，實驗室人員和環(huán)境，生物制劑等，通常配備雙排氣HEPA過濾器，HEPA過濾器放置在空氣源中。安全柜適用于埃博拉病原微生物SARS相關(guān)實驗等高風(fēng)險場合[3]。

2.生物安全柜的安裝使用

在進行病原微生物檢測中，必須使用二級或二級以上的生物安全柜，并且在使用必須注意以下幾點：

2.1 安全柜的使用必須嚴格按照要求進行操作，如使用前啟動“消毒自凈”，柜內(nèi)物品合理擺放，定期維護驗證等。生物安全柜一旦發(fā)生操作錯誤，泄漏或損壞，將無法保護操作人員。生物安全柜前的氣幕非常脆弱，很容易受到干擾和污染。實驗中，前窗位置不能隨意打開，操作要輕柔，避免手臂頻繁進出安全柜，防止干擾氣流。安全柜在工作時，開關(guān)門，人員在室內(nèi)走動，甚至在操作人員身后咳嗽，都會形成湍流，增加微生物氣溶膠的溢出風(fēng)險，造成實驗室污染。許多污染事件都是由于實驗人員違反操作規(guī)程、注意力不集中、操作動作不穩(wěn)定、操作設(shè)備方法不當(dāng)造成的。因此，在使用時必須牢固樹立安全意識，養(yǎng)成良好的操作習(xí)慣，杜絕非法操作，嚴格執(zhí)行病原微生物檢測標準操作規(guī)程和生物安全操作規(guī)程，使用符合要求的實驗室標準化設(shè)備。而且在檢測操作中生物安全柜的管理非常重要，但往往被忽視，給實驗室安全帶來很大隱患。必須建立科學(xué)的管理制度，嚴格執(zhí)行，確保使用安全。

2.2 現(xiàn)在仍有很多醫(yī)院在使用醫(yī)用潔凈工作臺，他們認為醫(yī)用潔凈工作臺與生物安全柜外觀相同，功能相似。事實上，生物安全柜和醫(yī)用潔凈工作臺根本上是有很大區(qū)別的。在潔凈工作臺中空氣通過高效過濾器凈化后，垂直向下吹向操作區(qū)，從而保護樣品不受污染。但由于操作區(qū)是正壓狀態(tài)，氣流會向外溢出。它只保護樣品，而不為操作者和環(huán)境提供保護。在病原微生物檢測中將給操作者帶來極大的隱患。生物安全柜為負壓過濾式通風(fēng)柜，可防止操作人員和環(huán)境接觸實驗室過程中產(chǎn)生的有害氣溶膠。生物安全柜的正確操作可以完全保護操作人員、樣品和工作環(huán)境。因此，在進行病原微生物檢測時，應(yīng)使用生物安全柜。而且，項目啟動前應(yīng)對實驗室的微生物風(fēng)險進行評估，評估合格后方可進行檢測。

2.3 生物安全柜安裝的位置選擇不當(dāng)也會造成污染

柜體的兩側(cè)和背面應(yīng)保留30cm，并在柜體頂部保留30～34cm的空間。為了降低外部氣流的干擾并確保生物安全柜的正常運行，應(yīng)將生物安全柜的安裝在遠離實驗室門窗，出入口及通道的位置，并避開供氣口，以免對生物安全柜造成干擾。外部氣流影響生物安全柜中的氣流。放置生物安全柜的房間必須有足夠的空氣供應(yīng)量。二級A2級的空氣排量約為700～1200m3/h，而B2級的空氣排量1000～1600m3/h。有一些型號的生物安全柜的空氣排量會更高。所以在沒有充足輔助空氣供應(yīng)的條件下，生物安全柜周圍環(huán)境會變?yōu)楦哓搲簠^(qū)域，并且也會影響生物安全柜的正常運行。

3.生物安全柜的校驗

目前，對生物安全柜的定期檢查和驗證認識不足。很多人認為，只要生物安全柜能夠轉(zhuǎn)移，就可以繼續(xù)使用。高效過濾器是生物安全柜的關(guān)鍵部件，具有使用壽命。使用一段時間后，細菌和灰塵在高效過濾器上積聚并造成損失，導(dǎo)致生物安全柜的空氣流速、清潔度和負壓降低。跌落不良等，如果生物安全柜的安全防護能力降低，檢測樣本、實驗室環(huán)境和檢驗人員的安全無法得到保證，給實驗室生物安全留下隱患。因此，必須定期對生物安全柜進行檢查和驗證。此外，需要注意的是，生物安全柜定期進行檢查和驗證，并要求有資質(zhì)機構(gòu)的專業(yè)人員對生物安全柜進行檢查。并且具備以下條件：

3.1 專業(yè)可靠的，有資質(zhì)認證的，首先需要有CMA資質(zhì)認證

3.2 需要有生物安全柜檢測資質(zhì)能力，嚴格按照檢測標準及項目指標要求檢測，出具CMA檢驗報告。

3.3 檢驗報告格式規(guī)范，檢測設(shè)備在校準有效期內(nèi)并且參數(shù)齊全、量程適合、檢測數(shù)值準確可靠。而且此檢驗檢測機構(gòu)為第三方獨立機構(gòu)，并且與安全柜制造商之間沒有利益關(guān)系。

3.4 檢測參數(shù)包括

（1）外觀；（2）高效過濾器完整性；（3）報警及聯(lián)鎖系統(tǒng)；（4）氣流方式；（5）進氣流速；（6）下降流速。

檢驗應(yīng)由健全資質(zhì)的專業(yè)人員按照相關(guān)測試標準流程執(zhí)行，以確定生物安全柜的運行性能和儀器狀態(tài)，并依照國家相關(guān)標準判斷是否符合要求?，F(xiàn)場測試時，檢測人員應(yīng)穿戴好防護潔凈服，并在生物安全柜徹底消毒清潔后進行測試[4]。

4.生物安全柜的保養(yǎng)維護

4.1 生物安全柜應(yīng)定期進行保養(yǎng)維護，并注意以下幾點：

4.1.1 維修人員必須配備生物防護設(shè)備，并經(jīng)過相關(guān)生物安全防護知識專業(yè)培訓(xùn)，考核合格。

4.1.2 維修中通風(fēng)風(fēng)機不得開啟。如特殊原因必須打開通風(fēng)系統(tǒng)的，必須在經(jīng)過甲醛熏蒸消毒后再開啟，確認致病性生物危害已被有效殺滅，過濾器能得到有效控制病原微生物外溢擴散。

4.1.3 使用后的過濾器，一旦報廢，必須在取出后嚴格滅菌后才能廢棄。

4.2 操作人員在取得病原微生物檢測資格證，并經(jīng)過生物安全柜培訓(xùn)后方可進行病原微生物檢測，但持證上崗后還應(yīng)時刻保持警惕，避免病原微生物擴散事故發(fā)生。首先，使生物安全柜保持良好運行狀態(tài)。因此檢驗人員應(yīng)注意：

4.2.1 熟悉生物安全柜的工作原理，結(jié)構(gòu)特點，性能參數(shù)、維護項目、相關(guān)生物安全知識等。

4.2.2 熟悉生物安全柜的運行狀態(tài)，檢查運行參數(shù)是否正常，上次檢驗和檢驗的時間、下次檢驗和檢驗的時間；更換過濾器等主要部件。

4.2.3 在每次運行前，都必須檢查生物安全柜的運行狀態(tài)。確認狀態(tài)良好后方可使用。一旦異常，應(yīng)立刻停機。

4.2.4 每次運行都應(yīng)檢查壓差、風(fēng)速等關(guān)鍵參數(shù)。如果生物安全柜的顯示功能中沒有壓差、風(fēng)速等參數(shù)，應(yīng)使用手持風(fēng)速儀進行檢測，菌落總數(shù)應(yīng)每季度進行測試。

4.2.5 有資質(zhì)的專業(yè)人員才能進行過濾器的維護和更換。當(dāng)風(fēng)速經(jīng)過調(diào)節(jié)仍低于目標參數(shù)時，必須更換高效過濾器，定期將粗濾器中的濾料取出進行清洗，并用手持風(fēng)速儀測量實驗室風(fēng)速，確保風(fēng)速達到使用要求。

5.使用生物安全柜的注意事項

在使用生物安全柜進行病原微生物檢測時我們還發(fā)現(xiàn)一些問題如下：

5.1 在進行病原微生物檢測時需要穿戴防護服，防護服較為寬松，當(dāng)手臂進入生物安全柜的工作區(qū)域操作時，防護服的袖子容易堵塞進氣格柵開口，而且生物安全柜內(nèi)物品較多或者操作人員較多時，堵塞進氣格柵氣孔的風(fēng)險就越大，這樣會對生物安全柜的氣流影響較大，當(dāng)氣流流速波動超過進入生物安全柜的空氣流量標準值的±20%時，會降低生物安全柜的保護系數(shù)。所以應(yīng)束縛袖口并注意對進氣格柵開口的保護。

5.2 生物安全柜內(nèi)物品不可過多，應(yīng)盡量減少物品擺放，因為生物安全柜內(nèi)氣流由上而下，風(fēng)速穩(wěn)定，近似于單一的定向氣流，單向氣流的最大特點是氣流中包含的污染物顆粒不受外界的干擾。顆粒的軌跡不會變化，軌跡是平行。但當(dāng)在生物安全柜的操作區(qū)域放置物品時，氣流模式會受到物體不規(guī)則表面的影響而改變[5]。這樣，污染顆粒在氣流中的平行軌跡被改變，從而在工作區(qū)域?qū)⒊霈F(xiàn)不規(guī)則移動，從而增加交叉污染的風(fēng)險。

5.3 操作時前窗開啟高度一定要在度線內(nèi)

前窗玻璃下邊緣到臺面前格柵的距離為前窗操作口的高度[6]。前窗操作口高度的變化直接影響到進風(fēng)氣流的流量，在前窗操作口形成負壓屏障。從而隔離工作區(qū)在實驗過程中產(chǎn)生的污染因素擴散到周圍環(huán)境中，達到保護環(huán)境和檢驗人員安全的目的。流入氣流的流量可以確定操作口的公稱高度，并以生物安全柜的負壓風(fēng)量為準。工作端口的高度與流入氣流的流速成反比。前窗開啟高度過大，進風(fēng)流速減小會破壞負壓屏障氣幕，污染因素會通過前窗開口在操作區(qū)域的擴散，危及環(huán)境和人員安全。前窗工作口過低時，會引起氣流速度上升，波動值超過±0.025m/s（YY0569標準5.4.8.1的要求）。在生物安全柜的設(shè)計開發(fā)階段，對操作口前窗開啟高度的標稱值進行了理論驗證，在檢驗過程中通過微生物挑戰(zhàn)實驗（樣本，檢驗人員和交叉污染防護）進行了驗證。因此，操作口前窗開啟高度必須保持在刻度線內(nèi)。

5.4 檢測過程中的操作區(qū)域位置尤為重要

在生物安全柜中檢測樣本時，樣品是否得到良好的保護是影響檢測結(jié)果的主要因素之一。如果將樣本放在前窗開口的進氣格柵上，就會受到影響，將失去潔凈空氣的保護。而且會污染進氣格柵處的負壓氣流（顆粒物和微生物失去控制）。進氣格柵是為保護工作區(qū)內(nèi)產(chǎn)生的負壓力而設(shè)計的。當(dāng)樣品放在進氣格柵上方時，整個負壓屏障氣簾破裂。樣品暴露在非受控區(qū)域時產(chǎn)生的污染因子不受控制。此外，在實驗過程中，當(dāng)操作人員進入生物安全柜前窗的開啟區(qū)域時，會接觸到生物危害，也會污染工作區(qū)內(nèi)的潔凈氣流。檢驗人員可以通過玻璃前窗進行實驗觀察，玻璃前窗的隔離性能夠保證生物安全柜內(nèi)氣流受控。

5.5 生物安全柜內(nèi)進氣口和生物安全柜頂?shù)呐艢饪诮^對不能有物品遮擋，否則會破壞原有的風(fēng)量平衡，倒置排風(fēng)量下降，降低生物安全柜的保護系數(shù)[7]。

6.樣本泄漏應(yīng)急措施

在檢測過程中一旦樣本灑濺會造成病原微生物泄漏事故，所以泄漏響應(yīng)措施尤為重要。

6.1 預(yù)留一個防漏工具包，可以隨時解決泄漏問題

應(yīng)仔細閱讀的泄漏響應(yīng)標準操作程序（SOP）摘要，實驗室中的每個人都應(yīng)閱讀和理解，并配備適當(dāng)干凈的磨砂布，以及防止衣物污染的備用防化服。你還需要吸收性材料、消毒劑（10%次氯酸鈉）、鉗子或鑷子來撿起破損的容器和雜物。

6.2 正確穿戴防護服

在生物安全柜中進行新冠核酸檢檢測之前，請確保正確穿戴防護服并在測試過程中始終穿著。不要脫下或打開衣領(lǐng)和袖口。此外，在處理培養(yǎng)、污染的表面或設(shè)備時，必須使用乳膠或丁腈手套。必須遵守相關(guān)的生物安全程序。

6.3 在機柜運行時執(zhí)行去污步驟

當(dāng)生物安全柜內(nèi)有生物有害物質(zhì)泄漏時，應(yīng)立即開始清洗，柜內(nèi)生物安全柜繼續(xù)運行。生物安全柜應(yīng)保持運行狀態(tài)，防止空氣污染物逸出，并確保柜內(nèi)任何物品都留在柜內(nèi)，以保護操作人員和實驗室周圍的人員的安全。

6.4 從溢出區(qū)域移除物品

在處理溢出物之前，首先移除可能含有溢出液體的試管、移液管和任何其他物品，然后將其放入柜中的生物危害容器中。重要的是要在操作柜中存放受污染的材料，以避免暴露在實驗室中。為防止人身傷害，請始終使用鉗子或鑷子撿起玻璃和尖銳物體。

6.5 用吸收性材料覆蓋溢出物

用吸收性材料（如紙巾）覆蓋生物安全柜內(nèi)的溢出物，并將其浸入水中。這有助于防止污染物的霧化。用毛巾蓋住溢出物，從毛巾的外緣到毛巾的中間，在毛巾上涂抹合適的消毒劑。從外到內(nèi)使用消毒劑，有助于將材料困在紙巾中并進行去污。重要的是要注意，溢出的藥劑不能抵抗用于清潔的消毒劑。通過實驗室程序解決您可能遇到的生物危害將確保您有適當(dāng)?shù)牟牧峡捎糜谛孤?。次氯酸鈉溶液具有成本低、作用迅速、廣譜有效等優(yōu)點，但對生物安全柜內(nèi)的不銹鋼表面具有腐蝕性，應(yīng)沖洗。（生物安全柜內(nèi)使用氯化或鹵素材料會損壞不銹鋼）

6.6 允許20min的消毒劑接觸時間

根據(jù)使用的消毒劑，消毒劑的反應(yīng)時間可能需要改變。根據(jù)經(jīng)驗，20min應(yīng)該足以中和污染物。

6.7 用毛巾擦掉溢出物和多余的液體

在溢出物被控制并且消毒劑有足夠的時間反應(yīng)后，用毛巾擦掉多余的液體。把用過的毛巾放在柜子里的生物危害袋里。

6.8 用清潔劑再次處理該區(qū)域

在溢出區(qū)域再次涂上消毒劑，并在適當(dāng)?shù)墓ぷ鲿r間后用干凈的毛巾擦拭。這有助于確保所有受污染的材料和表面都得到凈化。如有必要，檢查工作面下方的溢油盤，并遵循相同的消毒程序。

6.9 徹底沖洗溢流區(qū)

如果使用次氯酸鈉（或任何其他腐蝕性消毒劑）清潔溢出物，用無菌水沖洗，然后從工作表面擦去剩余的漂白劑（或消毒劑）。次氯酸鈉對不銹鋼有很強的腐蝕性。如果用它來清潔生物安全柜，久而久之會造成損壞。

6.10 清潔機柜后，取下并妥善處理與污染物接觸的手套和防護服

此外在完成每批次檢測后應(yīng)及時對生物安全柜內(nèi)進行擦拭消毒，并對紫外燈進行清潔維護，然后開啟紫外燈照射約15min。根據(jù)生物安全柜的使用情況還應(yīng)進行定期清潔，尤其是需要潔凈的關(guān)鍵位置進行清潔[8]，以保證生物安全柜的良好運行狀態(tài)。