朱曉林 魏小紅 王寶強(qiáng) 馮悅 趙耀東

摘?要：該試驗(yàn)旨在通過生物信息學(xué)方法分析沙特番茄黃化曲葉病毒AC2基因編碼的轉(zhuǎn)錄激活蛋白TrAP（transcriptional activator protein）的結(jié)構(gòu)及功能。該文通過在線軟件預(yù)測(cè)和分析了番茄中AC2基因編碼蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、磷酸位點(diǎn)、糖基位點(diǎn)、三級(jí)結(jié)構(gòu)及其重要的功能;通過最大似然法對(duì)不同物種 AC2基因編碼蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明：番茄中AC2基因共編碼135個(gè)氨基酸，且編碼蛋白屬于不穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì);二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲折疊為主，比例為58.52%;該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，屬非跨膜蛋白且不存在信號(hào)肽;該蛋白1～129個(gè)氨基酸區(qū)域?yàn)殡p生病毒超基因家族 （Gemini_AL2 superfamily） 結(jié)構(gòu)域;系統(tǒng)進(jìn)化情況和植物分類學(xué)基本一致，沙特番茄雙生病毒AC2基因與南非木薯間的親緣關(guān)系最近。該基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)與功能的分析為進(jìn)一步研究AC2雙生病毒基因家族奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為番茄抗病在病蟲害防治方面提供一種可行的思路。

關(guān)鍵詞：沙特番茄黃化曲葉病毒， AC2基因， 轉(zhuǎn)錄激活蛋白， 生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)：Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2020）12-1773-08

Abstract：This experiment aimed to analyze the structure and function of the transcriptional activator protein transcriptal activator protein （TrAP） encoded by the AC2 gene of the Saudi tomato yellow leaf curl virus by bioinformatics.In this study， primary structure， secondary structure， phosphate site， glycosylation site， tertiary structure and important functions of the protein encoded by AC2 gene in tomato were predicted and analyzed by online software.Phylogenetic trees were constructed by maximal likelihood method for the encoded protein sequences of AC2 genes from different species for phylogenetic analysis.The results were as follows：The AC2 gene encoded a total of 135 amino acids in tomato， and the encoded protein belonged to an unstable hydrophilic protein; The secondary structure was dominated by random coil folding， with a ratio of 58.52%; The protein did not have a transmembrane domain，?it belonged to non-transmembrane protein and had no signal peptide; The 1-129 amino acid region of this protein was the Gemini_AL2 superfamily domain; The phylogenetics and plant taxonomy were basically the same， and the relationship between Saudi tomato yellow leaf curl virus AC2 gene and the South African cassava is recent.The analysis of the structure and function of the encoded protein provides a basis for further understanding of the AC2 geminivirus gene family， and provides a feasible approach for tomato disease resistance in pest control.

Key words：Saudi tomato yellow leaf curl virus， AC2 gene， transcriptional activator protein，?bioinformatics

番茄（Solanum lycopersicum）果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特、富含維生素等，能有效降低消化道癌、前列腺癌等多種疾病發(fā)生的幾率，是深受人們喜愛的蔬菜，在全世界種植廣泛（曹玉鑫等，2018）。隨著種植面積、復(fù)種指數(shù)不斷增加，各種病害也接踵而至。

番茄黃化曲葉病作為蔬菜作物生產(chǎn)中最具毀滅性的病害，其致病因子是黃化曲葉病病毒。屬于雙生病毒科，是一個(gè)大型的單鏈DNA病毒家族，它在重要的經(jīng)濟(jì)作物上感染并造成毀滅性疾病（Sung & Coutts， 1996）。該病菌由煙粉虱（Bamesiatabasi）傳播，其病毒可以是單鏈DNA（ssDNA））或二份[（兩個(gè)相等）ssDNA稱為DNA A和B]（Zerbini et al.， 2017）。DNA A編碼互補(bǔ)的4～5個(gè)開放閱讀框（ORF）方向（AC1/C1，AC2/C2，AC3/C3，AC4/C4和AC5/C5）和兩個(gè)病毒感染的ORF（AV1/V1，AV2/V2）參與反式激活，復(fù)制和反應(yīng)的方向封裝（Hanley et al.， 2013）。它們被細(xì)分為九個(gè)屬，該病毒屬的成員編碼稱為AC2/C2的致病蛋白，該類轉(zhuǎn)錄激活蛋白是能與啟動(dòng)子中特定DNA序列結(jié)合并激活基因轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的蛋白質(zhì)分子，其相互作用使許多植物蛋白失活并通過C-末端反式激活結(jié)構(gòu)域反式激活許多宿主基因（Babu et al.， 2018）。同時(shí)TrAP激活葉肉細(xì)胞和原生質(zhì)體中病毒外殼蛋白（CP）和BR1運(yùn)動(dòng)基因啟動(dòng)子的表達(dá)，并起到抑制植物組織中CP啟動(dòng)子的作用（Rajeswaran et al.， 2007）。謝迎秋等（2001）對(duì)棉花曲葉病病毒AC2 功能進(jìn)行了初步探究，揭示了AC2基因編碼的蛋白在寄主植物中反式激活病毒鏈基因啟動(dòng)子的奇異現(xiàn)象，其為研究病毒與植物間的相互作用的分子機(jī)理提供了新依據(jù)。

目前國(guó)內(nèi)在番茄抗黃化曲葉病方面，主要集中于抗病基因的研究，對(duì)入侵病毒本身基因方面研究較少，尤其對(duì)病毒AC2基因的研究還鮮有報(bào)道，而當(dāng)今控制番茄黃化曲葉病病毒迫在眉睫。因此，完成對(duì)AC2 基因編碼的轉(zhuǎn)錄激活蛋白進(jìn)行全面的生物信息學(xué)分析，有助于理解病毒如何成功感染宿主，同時(shí)可通過分子手段抑制該基因的表達(dá)，從而為以后番茄在防治黃化曲葉病以及抵制抗病方面提供參考價(jià)值。

1?材料與方法

1.1 序列來(lái)源

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲取不同物種病毒基因AC2編碼的TrAP氨基酸序列及其他信息。

1.2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析預(yù)測(cè)

1.2.1 一級(jí)結(jié)構(gòu)?通過Expasy平臺(tái)，根據(jù)Relative mutability參數(shù)、 Zimmerman方案、 Hopp & Woods方案、Bulkiness參數(shù)、Average flexibility參數(shù)、Janin方案預(yù)測(cè)蛋白的相對(duì)突變性、極性、親水性、松散性、柔韌性、可及性理化性質(zhì)等一級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.2 二級(jí)結(jié)構(gòu)?通過法國(guó)里昂CNRS的SOPMA 軟件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi -bin/npsa_automat.pl？ page = npsa_sopma.html）） 預(yù)測(cè)該基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu); 利用CBS 系統(tǒng)中 SignalP5.0 server 平臺(tái)（http：/ / www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/） 預(yù)測(cè)沙特番茄黃化曲葉病毒TrAP蛋白信號(hào)肽序列（李玩生等，2010）;利用Scratch Predict Protein 在線軟件（徐慶剛等，2010）對(duì)該基因編碼產(chǎn)物進(jìn)行二硫鍵結(jié)合的預(yù)測(cè)與分析;利用 CBS 系統(tǒng)中TMHMM Server v.2.0平臺(tái)（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進(jìn)行蛋白跨膜區(qū)域的預(yù)測(cè)（Sonnhammer et al.， 1998）。

1.2.3 磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)?利用 CBS 系統(tǒng)中 NetPhos 3.1平臺(tái)（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhosK）以及NetOGlyc 4.0進(jìn)行蛋白磷酸位點(diǎn)與糖基位點(diǎn)的預(yù)測(cè)。

1.2.4 結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)?NCBI中的 CDD 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi） 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域。

1.2.5 三級(jí)結(jié)構(gòu)?通過 SWISSMODEL（Lin et al.， 2018）對(duì)沙特番茄黃化曲葉病病毒基因AC2編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

通過NCBI對(duì) 13個(gè)物種AC2基因編碼蛋白序列進(jìn)行同源比對(duì)分析，再利用MEGA X（Wang et al.， 2017）軟件中的鄰接法（neighbor-joining method，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2?結(jié)果與分析

2.1 沙特番茄黃化曲葉病毒TrAP氨基酸序列

沙特番茄黃化曲葉病毒AC2基因GenBank登錄號(hào)為 NC_022229.1，其編碼的蛋白TrAP氨基酸序列為MQPSSPSTSHCSQVPIKVQHKLAKKKIIRRR

RLDLDCGCSYYLHINCTNHGFTHRGTHHCSSGNEWRFYLGDKQSPLFQDHQPQREATQHEQRHNFNTNPIQSQHQEGVGDSQMFSQLPNLDDLTASDWSFLKSI。對(duì)沙特番茄黃化曲葉病毒AC2基因完整編碼蛋白序列進(jìn)行 BLAST 分析，將其與同源性較高的從NCBI里下載的卷心菜（ 序列號(hào)：NP_620887.1）、南非木薯 （序列號(hào)：NP_620664.1）、棉花（序列號(hào)：CDO50035.1）、云南煙草 （序列號(hào)：NP_722555.1）、甘薯 （序列號(hào)：NP_808770.1）、胡椒（序列號(hào)：NP_050016.1）、臺(tái)灣番茄（序列號(hào)：YP_001950236.1）、豆類（序列號(hào)：NP_612596.1）、土豆（序列號(hào)：NP_808757.1）、海南番茄（序列號(hào)：YP_003104749.1）、番木瓜 （序列號(hào)：NP_689460.1） 和云南番茄（序列號(hào)：YP_008060401.1）等序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.2 蛋白結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 一級(jí)結(jié)構(gòu)?預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白共含135個(gè)氨基酸，其分子量為15 640.38，等電點(diǎn)為8.67，帶負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)為（Asp + Glu）12個(gè)，帶正電荷殘基數(shù)為（Arg + Lys）15個(gè);分子式為C676H1037N211O206S7，原子總數(shù)為2 137個(gè);不穩(wěn)定指數(shù)為61.37;消光系數(shù)為15 470 mol·L-1， 對(duì)應(yīng)吸光值是0.989。脂肪族氨基酸指數(shù)為54.89;各個(gè)氨基酸組成如圖1所示，其中絲氨酸、谷氨酰胺的比例最高，分別為11.1%、10.4%，蛋氨酸、色氨酸的比例最低，均為1.5%。

Expasy平臺(tái)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示Relative mutability參數(shù)（圖2：A）得分位于53.000～100.556間，即該蛋白高突變區(qū)位于95～103位氨基酸間;Zimmerman方案（圖2：B）評(píng)分位于1.748～39.640間，因此可預(yù)測(cè)該蛋白高極性區(qū)位于21～34位氨基酸間;Hopp & Woods方案（圖2：C）評(píng)分表明其最大值為1.933，最小值為-1.156，因此該蛋白高親水性區(qū)域位于21～35位氨基酸間;Bulkiness參數(shù)（圖2：D）位于10.574～18.103之間，其蛋白的高松散區(qū)域位于12～33位氨基酸間;Average flexibility參數(shù)（圖2：E）得分位于0.397～0.494間，因此其高柔韌性區(qū)域在25～37位氨基酸之間;Janin方案（圖2：F）評(píng)分位于-1.067～0.256間，其高可及性區(qū)位于36～44位氨基酸間。

2.2.2 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析預(yù)測(cè)?由圖3可知，無(wú)規(guī)則卷曲在整個(gè)多肽鏈主鏈骨架上所占比例最大，為58.52%，由79個(gè)氨基酸構(gòu)成，且其較為突出的區(qū)域是1～15、71～83、95～111，其次為α-螺旋，為25.19%，由34個(gè)氨基酸構(gòu)成，其較突出部位為16～34、84～94，而該氨基酸序列無(wú)β-轉(zhuǎn)角與β-折疊，而延伸鏈占16.30%。則該番茄蛋白主要二級(jí)結(jié)構(gòu)元件為無(wú)規(guī)則卷曲與α-螺旋。按照蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)劃分標(biāo)準(zhǔn)來(lái)看，沙特番茄黃化曲葉病毒基因編碼產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)上屬于混合型（Skolnick & Fetrow， 2000; 曹建等，2012）。

如圖4所示， 經(jīng)預(yù)測(cè)， TrAP的1～135位氨基酸均位于細(xì)胞膜表面（圖4：A），由此可以推斷該蛋白無(wú)跨膜區(qū)域的形成。同時(shí)該蛋白也無(wú)信號(hào)肽的存在（圖4：B）。運(yùn)用 Scratch Protein Predictor軟件對(duì)該蛋白的二硫鍵進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，預(yù)測(cè)沙特番茄黃化曲葉病毒TrAP蛋白5個(gè) Cys 中，2個(gè) Cys 形成 1對(duì)二硫鍵，預(yù)計(jì)在第37、39、47、60位間形成。

2.2.3 磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)?運(yùn)用NetPhos 3.1在線軟件對(duì)番茄 TrAP蛋白磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，由圖5可知，該蛋白的氨基酸序列包含24個(gè)磷酸化位點(diǎn)，且其磷酸化位點(diǎn)分別位于絲氨酸 （Ser）、蘇氨酸 （ Thr）?和酪氨酸 （ Tyr） 殘基上。絲氨酸磷酸化位點(diǎn)15個(gè)、蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)7個(gè)以及酪氨酸磷酸化位點(diǎn)2個(gè)，多磷酸化位點(diǎn)在蛋白質(zhì)翻譯后修飾水平上發(fā)揮著重大作用。而NetOGlyc 4.0預(yù)測(cè)結(jié)果表明該蛋白含有9個(gè)糖基化位點(diǎn)。

2.2.4 結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)?應(yīng)用NCBI 中的CDD 數(shù)據(jù)庫(kù)（ http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi） 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域。預(yù)測(cè)結(jié)果如圖6所示，結(jié)果表明沙特番茄黃化曲葉病病毒基因AC2轉(zhuǎn)錄激活蛋白的1～129 個(gè)氨基酸區(qū)域?yàn)殡p生病毒超家族 （Gemini_AL2 superfamily） 結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?qū)υ摼幋a蛋白功能發(fā)揮有極其重要的作用。

2.2.5 三級(jí)結(jié)構(gòu)?通過同源建模方法構(gòu)建的沙特番茄黃化曲葉病毒基因AC2編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖7所示。該蛋白結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，卷曲鏈與折疊鏈結(jié)構(gòu)較少，蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)其生物學(xué)功能的發(fā)揮具有極其重要的作用，因此預(yù)測(cè)該蛋白功能相對(duì)單一。

2.3 AC基因編碼蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

從圖8可以看出，在通過系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建的13個(gè)物種中，沙特番茄黃化曲葉病毒與南非木薯間的親緣關(guān)系最近，其次是棉花、番木瓜、海南番茄、胡椒、云南番茄、臺(tái)灣番茄、云南煙草、土豆、豆類、卷心菜、甘薯。

3?討論

煙粉虱作為黃化曲葉病病毒的攜帶者，可操縱植物防御信號(hào)。在病蟲害侵染后，植物體內(nèi)主要進(jìn)化出兩種防衛(wèi)反應(yīng)機(jī)制，水平抗性與垂直抗性。植物首先動(dòng)員水楊酸（SA）依賴的水平抗性防御，其主要針對(duì)病原體。垂直抗性是植物在長(zhǎng)期抵制病原菌的過程中形成的專一抗性，通過進(jìn)化出專一抗性基因來(lái)抵抗病毒（Gill et al.， 2019）， 而部分番茄品種體內(nèi)不存在抗病基因，因此以病毒基因自身結(jié)構(gòu)作為一個(gè)切入點(diǎn)，利用RNA干擾沉默病毒AC2基因有助于病害的防御。黃化曲葉病病毒作為危害番茄產(chǎn)量最主要的病害，由雙生病毒引起，其該病毒不僅可作為表達(dá)載體在植物中直接表達(dá)外源基因，還可提供分離的調(diào)控元件，調(diào)控植物體的生理生化過程。研究表明，在AC2基因不存在時(shí)， ACMV病毒鏈基因啟動(dòng)子表達(dá)活性較低，AC2 基因存在時(shí)，病毒鏈基因啟動(dòng)子活性顯著增強(qiáng)，從而使病毒高效復(fù)制（Brough et al.， 1992）。同時(shí)導(dǎo)致AC2激活病毒鏈基因啟動(dòng)子復(fù)雜性的另一個(gè)可能因素是病毒鏈基因啟動(dòng)子的活性受時(shí)空調(diào)控，具有發(fā)育階段特異性和組織特異性（Sunter & Bisaro， 1997） 。而在該病毒入侵植物時(shí)，AC2基因編碼的轉(zhuǎn)錄激活蛋白在其病毒自我復(fù)制中發(fā)揮了很重要的作用，已發(fā)現(xiàn)在煙草中AC2基因能產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，使煙草屬植物的葉組織發(fā)育不全（Siddiqui et al.， 2008）。AC2編碼的蛋白可作為植物體內(nèi)寄主RNA沉默的抑制子，而寄主RNA沉默是植物抵御病毒入侵的有效手段，因此抑制AC2基因編碼產(chǎn)物是防止病毒在植物體內(nèi)傳播的有效途徑。本研究對(duì)沙特番茄黃化曲葉病毒基因編碼的TrAP蛋白序列的一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)以及功能分類等進(jìn)行預(yù)測(cè)及分析，該結(jié)果為研究AC2基因及其編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能提供了更多的信息，同時(shí)對(duì)AC2基因進(jìn)行全面的生物信息學(xué)分析，以期通過分子手段抑制其基因的表達(dá)，為番茄抗病育種提供可行的思路。

本研究中AC2 基因編碼產(chǎn)物共含135個(gè)氨基酸，其中絲氨酸含量最高，該氨基酸含量的高低與蛋白親水性有密切關(guān)聯(lián)，同時(shí)該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)高達(dá)61.37，因此其屬于不穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)。AC2 基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲為主，存在2個(gè)二硫鍵，這與該蛋白分子對(duì)抗外界因素影響的不穩(wěn)定性有很大關(guān)系。該基因編碼蛋白是一種轉(zhuǎn)錄激活因子，其結(jié)構(gòu)不存在跨膜區(qū)，即不屬于定位于生物膜的膜蛋白。該編碼蛋白含有1個(gè)雙生病毒超家族結(jié)構(gòu)域，其在細(xì)胞被運(yùn)輸以及結(jié)合嘌呤和嘧啶中起關(guān)鍵的作用，同時(shí)在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用。沙特番茄黃化曲葉病毒基因與南非木薯間的親緣關(guān)系最為密切，其次是棉花、番木瓜、海南番茄、胡椒、云南番茄、臺(tái)灣番茄、云南煙草、土豆、豆類、卷心菜、甘薯。由各物種同源性高于 25% 就可判斷其功能上的相似性（Garnier et al.， 1996）。 這種同源性一方面體現(xiàn)出各物種間的親緣關(guān)系，另一方面也表明各個(gè)物種的AC2基因編碼產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)特征中的相對(duì)穩(wěn)定性，同時(shí)表明AC2基因編碼蛋白在漫長(zhǎng)的生物演變過程中更多地受凈化選擇作用的束縛，其保守性較強(qiáng)。

4?結(jié)論

本研究通過生物信息學(xué)方法對(duì)沙特番茄黃化曲葉病毒AC2基因編碼的轉(zhuǎn)錄激活蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。結(jié)果表明，沙特番茄黃化曲葉病毒AC2主要編碼病毒轉(zhuǎn)錄激活蛋白，其在病毒入侵番茄的過程中發(fā)揮極其重要的作用，對(duì)病毒在植物體內(nèi)的繁殖起關(guān)鍵作用。該編碼蛋白由135個(gè)氨基酸組成， 是一種相對(duì)不穩(wěn)定的親水性蛋白;二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲與α-螺旋為主，該蛋白無(wú)信號(hào)肽與跨膜結(jié)構(gòu)域，但存在二硫鍵;三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型較為簡(jiǎn)單;其蛋白1～129 個(gè)氨基酸區(qū)域?yàn)殡p生病毒超家族 （Gemini_AL2 superfamily） 結(jié)構(gòu)域。利用鄰接法對(duì)AC2基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)沙特番茄黃化曲葉病毒AC2與南非木薯間的親緣關(guān)系最近，與卷心菜、甘薯之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

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（責(zé)任編輯?周翠鳴）