張婕 戴巍 馮宇 葉佳琪

摘要：運用生物信息學(xué)方法分析小細胞肺癌的相關(guān)基因，選取GEO數(shù)據(jù)庫基因芯片數(shù)據(jù)集GSE66635進行深入挖掘，通過GEO2R篩選差異表達基因，并利用R軟件對其進行聚類分析、DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO功能和KEGG通路富集分析、STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，最終得到6個關(guān)鍵基因：TP53，CCL2，F(xiàn)GF2，F(xiàn)OS，F(xiàn)GFR4，PGF，其所參與的生物學(xué)過程等可能與小細胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。

關(guān)鍵詞：生物信息學(xué);相關(guān)基因;小細胞肺癌

中圖分類號：R319 ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：1009-3044（2020）34-0014-03

小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC） 是一類惡性程度高的肺癌，雖然只占肺癌的13%-15%，但是其死亡率極高[1]。有關(guān)研究表明，SCLC是多個分子水平改變累積的結(jié)果，單靶點的抑制對SCLC的治療作用有限[1]。由于SCLC的復(fù)雜性及其發(fā)病機制的不明確性導(dǎo)致研究人員無法確定靶向治療的靶點，因此我們需要更深入地研究與SCLC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因。

隨著精準醫(yī)療的發(fā)展，生物信息學(xué)分析技術(shù)的成熟為癌癥的診治提供更為廣泛的空間。由于生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫及其分析軟件的種類多樣性和開放共享性，使得利用生物信息分析方法識別疾病相關(guān)的治療靶基因成為可能。其中，NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫中有著大量的基因芯片數(shù)據(jù)集，其具有更新快、大規(guī)模等優(yōu)點，而且易于共享，避免在數(shù)據(jù)采集等方面浪費大量時間，因此在生命科學(xué)領(lǐng)域的研究中運用逐漸廣泛[2]。本研究通過生物信息學(xué)方法挖掘SCLC基因芯片數(shù)據(jù)集GSE66625，利用計算機分析預(yù)測SCLC的潛在相關(guān)基因，從分子層面探討SCLC可能的作用機制。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

以SCLC和差異表達基因為關(guān)鍵詞，在NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫中查找基因芯片數(shù)據(jù)集，最終選擇并下載檢索序列號為GSE66625的基因芯片數(shù)據(jù)集，此數(shù)據(jù)集基于GPL16951平臺，是人SCLC細胞NCI-H446經(jīng)一種化療藥物治療前后的基因表達變化數(shù)據(jù)，其中對照組為經(jīng)DMSO處理的3瓶SCLC細胞，實驗組為相同濃度藥物處理后的3瓶細胞，采用Phalanx OneArrayTM檢測它們之間的基因表達差異，體現(xiàn)了SCLC細胞經(jīng)化療藥物治療前后的基因表達差異。

1.2 ?方法

1.2.1 ?差異表達基因篩選

使用GEO2R在線分析藥物治療組與癌癥對照組的基因數(shù)據(jù)并保存所有基因的分析結(jié)果，在Excel中以|logFC|>2.00且P.Value<0.05為條件篩選出差異表達基因（Differential Expression Genes，DEGs），并使用SangerBox軟件和R軟件的Pheatmap包分別繪制出全部基因的火山圖以及DEGs的聚類熱圖。

1.2.2 ?功能與富集分析

DAVID是一個為大量基因提供一系列功能性注釋的生物信息數(shù)據(jù)庫。將DEGs上傳到DAVID 6.7版在線數(shù)據(jù)庫，并選擇物種homo sapiens，選定p<0.05，基因數(shù)目≥5的條件進行GO功能富集分析，以p<0.05為限定條件進行KEGG通路富集分析，并篩選出富集到每項條目的共同基因。

1.2.3 ?蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

STRING數(shù)據(jù)庫能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進行分析和預(yù)測，并提供詳細的相互作用信息。將顯著富集到生物過程、細胞組件、分子功能以及KEGG代謝通路中的共同DEGs上傳至STRING 11.0版數(shù)據(jù)庫，以數(shù)據(jù)庫、文本挖掘、實驗結(jié)果等為依據(jù)進行蛋白之間交互網(wǎng)絡(luò)的初步預(yù)測，篩選出綜合得分≥0.4的相互作用關(guān)系，將相互作用表格及注釋信息導(dǎo)入Cytoscape軟件中進行可視化交互網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?DEGs的篩選結(jié)果與分析

經(jīng)過藥物治療組與癌癥對照組的比較，得到864個DEGs，其中有566個基因上調(diào)，298個基因下調(diào)，將其繪制成火山圖，其中紅色表示上調(diào)，綠色表示下調(diào)，黑色部分為普通基因，如圖1（a）。利用R軟件的Pheatmap包將DEGs的基因表達矩陣繪制成聚類熱圖，如圖1（b）。

2.2 ?DEGs的GO功能與KEGG通路富集分析

通過GO功能的3種生物學(xué)關(guān)系分析，SCLC的DEGs主要參與細胞遷移的正調(diào)控、凋亡過程和正調(diào)控血管生成等生物學(xué)過程，如圖2（a）所示，其產(chǎn)物主要參與神經(jīng)元投射、細胞外空間、突觸小泡等細胞組分，如圖2（b）所示，并且DEGs主要發(fā)揮著調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)同二聚化活性、磷脂結(jié)合、肝素結(jié)合等分子功能，如圖2（C）。通過KEGG代謝通路分析，得到16條顯著富集的信號通路，主要包括PI3K-Akt信號通路、軸突導(dǎo)向、p53信號通路等代謝通路，如圖2（d）所示，與SCLC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。其中共有52個基因同時富集到3種生物學(xué)關(guān)系和KEGG代謝通路中，如圖3所示。

2.3 ?DEGs的蛋白-蛋白交互網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為發(fā)現(xiàn)DEGs之間的相互作用和SCLC的相關(guān)分子機制，將同時富集到KEGG通路以及GO功能3個條目的52個基因所編碼的蛋白進行蛋白-蛋白交互網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，隱藏沒有參與相互作用的4個蛋白，整個網(wǎng)絡(luò)中共有48個蛋白和187個交互關(guān)系。將相互作用信息導(dǎo)入Cytoscape軟件中進行互作網(wǎng)絡(luò)的可視化，每一個節(jié)點代表一個蛋白，每一條邊代表一個交互關(guān)系。其中，節(jié)點的大小隨度漸變，且紅色表示基因上調(diào)，綠色表示基因下調(diào)，邊的粗細隨相互作用的強度漸變。結(jié)果顯示（圖4），交互網(wǎng)絡(luò)中TP53，CCL2，F(xiàn)GF2，F(xiàn)OS，F(xiàn)GFR4和PGF與其他蛋白的關(guān)系最為密切，為整個交互網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點。將這6個基因所參與的生物過程（表1）、細胞組分（表2）、分子功能（表3）和KEGG代謝通路（表4）分別整理成表。

3 討論

本研究運用生物信息學(xué)方法從GEO數(shù)據(jù)庫中下載SCLC的相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)集GSE66625，并利用GEO2R對其進行初步分析，得到了864個DEGs，其中566個基因上調(diào)，298個基因下調(diào)。通過GO功能富集和KEGG通路分析，我們選取富集分析結(jié)果中交集的52個基因的編碼蛋白進行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，最終得到TP53，CCL2，F(xiàn)GF2，F(xiàn)OS，F(xiàn)GFR4，PGF為網(wǎng)絡(luò)的中心蛋白。

TP53（Tumor Protein 53）是與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因之一，編碼生成腫瘤蛋白p53。有研究發(fā)現(xiàn)，在人體正常細胞的活動中，TP53通過參與細胞調(diào)控、促進DNA修復(fù)等過程，發(fā)揮著維持基因組穩(wěn)定、調(diào)節(jié)細胞分化等作用[3]。在本研究中，TP53在經(jīng)化療藥物處理過后的細胞內(nèi)顯著下調(diào)，說明其在癌組織中表達量上調(diào)，同時在互作網(wǎng)絡(luò)中處于中心位置。此外，TP53顯著富集到細胞的凋亡過程以及p53、PI3K-Akt等信號通路中。PI3K與其下游分子蛋白激酶所組成的PI3K-Akt信號通路在人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中有著關(guān)鍵地位。TP53可能通過此過程以及代謝通路來抑制腫瘤細胞的表達并促進細胞凋亡，在SCLC的作用機制中起著關(guān)鍵作用。

CCL2蛋白是趨化因子CC亞家族的成員之一，可以趨化單核細胞、巨噬細胞、記憶T細胞等到達感染的部位，在腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[4]。它能夠增強腫瘤細胞的侵襲能力，促進腫瘤的轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致疾病惡化。在本研究中，CCL2的表達量在經(jīng)藥物處理后的細胞中顯著下調(diào)，且顯著富集到細胞外空間的細胞組分并參與肝素結(jié)合功能，這表明CCL2的下調(diào)可能通過調(diào)控胞外空間組分和肝素結(jié)合功能等途徑抑制SCLC的致癌作用。FOS蛋白是細胞增殖、分化等的調(diào)節(jié)因子。本研究中FOS在經(jīng)藥物處理的細胞中表達上調(diào)，在癌細胞中下調(diào)，且顯著富集到神經(jīng)元投射的細胞組件中，可能通過此過程在致癌機制的調(diào)控中發(fā)揮功能。

PGF（Placenta growth factor）一種胎盤生長因子，在本研究中，PGF表達量在經(jīng)藥物處理后的細胞內(nèi)顯著下調(diào)，在癌組織中顯著上調(diào)，顯著富集到血管生成、器官再生過程中，并參與著肝素結(jié)合等分子功能以及PI3K-Akt信號通路，可能發(fā)揮著促進腫瘤細胞生長的功能。

FGF2（Fibroblast Growth Factor 2）是成纖維細胞生長因子家族成員中較典型的一類多肽，具有促進血管生成、創(chuàng)傷修復(fù)、組織再生等功能。有研究發(fā)現(xiàn)其可通過PKC信號傳導(dǎo)途徑來促進小細胞肺癌細胞中凋亡抑制蛋白的表達，從而抑制細胞凋亡[5]。FGFR4（Fibroblast Growth Factor Receptor 4）是一種跨膜受體酪氨酸激酶，是成纖維細胞生長因子受體中的一員[6]。FGF2主要通過與細胞表面上的FGFRs高親和力結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。馮彥等人研究發(fā)現(xiàn)FGF2和FGFR4與SCLC的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]。在本研究中，F(xiàn)GF2表達量在經(jīng)藥物處理后的細胞內(nèi)顯著下調(diào)，在癌組織中顯著上調(diào)，而FGFR4的表達量在經(jīng)藥物處理后的細胞內(nèi)顯著上調(diào)，在癌組織中表達量下調(diào)。這兩種基因共同發(fā)揮肝素結(jié)合的分子功能而且同PGF、TP53富集到PI3K-Akt信號通路中，表明其基因表達結(jié)果可能通過影響肝素結(jié)合和PI3K-Akt信號通路調(diào)控SCLC的發(fā)展，阻止FGF2與其受體的結(jié)合從而抑制癌細胞的增殖。此外，F(xiàn)GF2參與著細胞遷移、血管生成以及經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程，與CCL2、PGF共同參與著胞外空間的細胞組分，且與TP53共同富集到癌癥中蛋白多糖代謝通路，這表明這些基因可能通過調(diào)控細胞遷移、細胞外空間的組分或者是蛋白多糖的代謝參與SCLC的發(fā)生、發(fā)展，從而在SCLC的作用機制中起重要作用，這可能是SCLC的潛在致病機制。

綜上所述，本研究通過對SCLC基因芯片數(shù)據(jù)集進行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)TP53，CCL2，F(xiàn)GF2，F(xiàn)OS，F(xiàn)GFR4，PGF可能是SCLC的潛在相關(guān)基因，然而我們?nèi)孕韪嗟匮芯縼碜C實其在SCLC中的作用。

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【通聯(lián)編輯：光文玲】