蛋白組學研究方法概述

陳芊凝

摘要：隨著人們對基因結(jié)構(gòu)的了解加深，關(guān)于生命科學的研究也慢慢進入了后基因組時代，這也就是功能基因組時代。功能基因組顧名思義就是對基因的功能進行挖掘，中心法則中DNA會調(diào)控RNA的轉(zhuǎn)錄，RNA又會調(diào)控蛋白質(zhì)的翻譯，但實驗結(jié)果表明RNA對蛋白質(zhì)的翻譯率并不是很高，而蛋白質(zhì)又是生命活動最直接的執(zhí)行體，因此對蛋白組學的研究將成為生物學研究的一個熱點，將會為生命活動原理的解讀帶來重大的貢獻。本文就通過對蛋白組學的相關(guān)論文進行總結(jié)，分析蛋白組學目前使用的研究方法，并對相關(guān)蛋白質(zhì)的分離進行重點介紹。

Abstract： With the deepening of people's understanding of gene structure， research on life sciences has gradually entered the post-genomic era， which is also the era of functional genomics. The functional genome， as its name implies， is to excavate the function of genes. In the central law， DNA regulates the transcription of RNA， and RNA regulates the translation of proteins. However， experimental results show that the translation rate of RNA to proteins is not very high， and proteins are the most direct executive body of life activities， so research on proteomics will become a hot spot in biological research， and it will bring significant contributions to the interpretation of the principle of life activity. This article summarizes the relevant papers on proteomics， analyzes the research methods currently used in proteomics， and focuses on the separation of related proteins.

關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)組學;研究方法;蛋白質(zhì)分離

Key words： proteomics;research methods;protein separation

中圖分類號：TQ931? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：1006-4311（2020）03-0243-03

0? 引言

蛋白質(zhì)組是指一種細胞、組織乃至一種生物所表達的全部蛋白質(zhì)。相較于傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)研究，蛋白質(zhì)組學可以在大規(guī)模水平上一次性鑒定成千上萬種蛋白質(zhì)的表達水平、修飾水平相互作用等，從而揭示蛋白質(zhì)參與生命活動的作用。近幾年來蛋白組學不斷發(fā)展，蛋白組學在各個方面應(yīng)用越來越廣泛，如植物逆境蛋白組學在研究植物的生長、發(fā)育、代謝等生理活動規(guī)律;另外，蛋白組學也漸漸成為腫瘤研究中尋找標志物的有力手段，為腫瘤的致病機理研究及藥物研究提供了新思路。蛋白組學也漸漸成為生命科學研究的最前沿領(lǐng)域。

1? 蛋白質(zhì)的提取

為了更好地研究蛋白質(zhì)，首先要做的就是從組織樣本中獲取較純的蛋白樣品。蛋白存在于組織細胞中，獲得蛋白之前需要將組織細胞進行破碎，破碎細胞的方法包括石英砂研磨、超聲波震碎、微波提取法、超臨界萃取法、反復凍融法、高速組織搗碎、玻璃勻漿器勻漿、振蕩珠擊破碎法、高速攪拌珠研磨破碎法、滲透壓沖擊破碎法、酶溶破碎法、化學破碎法、去垢劑破碎法等。將蛋白從組織細胞中釋放出來后就可以進行蛋白質(zhì)組學研究的后續(xù)過程，包括蛋白純化、鑒定等過程。

1.1 蛋白質(zhì)的沉淀

在將蛋白質(zhì)從組織細胞中釋放出來的同時還會在蛋白的提取液中混有其他的物質(zhì)，為了更好的研究蛋白質(zhì)，需要將蛋白質(zhì)從復雜體系中純化出來，首先考慮根據(jù)蛋白質(zhì)的特性將其從復雜體系中沉淀下來，常用的蛋白質(zhì)沉淀方法有鹽析法和有機溶劑沉淀法。

1.2 蛋白質(zhì)的分離

蛋白質(zhì)的分離在最開始是用一些簡單的離心技術(shù)進行處理的，但僅利用物理方法無法實現(xiàn)物質(zhì)徹底的分離， 分離后仍混有較多雜質(zhì)，而蛋白質(zhì)組質(zhì)譜技術(shù)要求較精確，目前蛋白質(zhì)組的分離方法朝向更加精確的方向發(fā)展，例如雙向電泳法，高效液相色譜法等。

1.2.1 離心法

離心法是較為基礎(chǔ)的分離方法，高速旋轉(zhuǎn)中的物體會有強大的向心力，從而使得放入其中的物體中的懸浮顆粒發(fā)生不同程度的漂浮或沉降，最終使得部分顆粒發(fā)生濃縮，與其他物質(zhì)發(fā)生分離，整體的操作沒有太高的技術(shù)要求但無法將各物質(zhì)徹底分離，如Herbik等在1996比對正常番茄與缺鐵性番茄中蛋白質(zhì)表達方式的不同時，使用離心法無法完全分離甘油醛_3_磷酸脫氫酶，甲酸脫氫酶等一些可幫助獲得鐵的酶，使用更精確的雙電泳凝膠法才將此類酶成功分離。一般，離心法無法將物質(zhì)完全分離，處理后產(chǎn)物仍混有較多雜質(zhì)，需要在離心后采用其他技術(shù)進行下一步分離。

1.2.2 色譜法

離子交換色譜法。離子交換色譜法是利用蛋白質(zhì)含電量的不同進行分離，層析柱中填充陰（陽）離子交換樹脂顆粒，根據(jù)電荷同性相斥，異性相吸的原理，洗柱時用含陰（陽）離子的溶液，若蛋白質(zhì)所帶電荷較小，靜電力較小，則會先與層析柱分離，增加溶液離子濃度，所帶電荷較多的蛋白質(zhì)也會與層析柱分離，即可分離蛋白。

凝膠排阻色譜法，或稱凝膠過濾或分子篩，當分子量不同的物質(zhì)通過多孔性親水性凝膠時，若蛋白質(zhì)分子直徑太大無法進入凝膠的孔徑內(nèi)，則不會通過凝膠內(nèi)部直接順著凝膠的縫隙流出，若蛋白質(zhì)分子直徑小于凝膠的孔徑，則會進入凝膠內(nèi)部，增大了通過凝膠需經(jīng)過的長度。這樣，通過在柱內(nèi)停留時間的不同，可達到將蛋白質(zhì)分離的目的。（如圖2）

如阮振剛等在檢測酚醛樹脂中的游離酚時，使用凝膠排阻色譜法無法得到分離度很好的譜峰，增大了實驗的誤差。

親和色譜法利用某些物質(zhì)存在特異性結(jié)合，混合物通過層析柱時柱內(nèi)凝膠只與和凝膠有特異性結(jié)合的物質(zhì)結(jié)合達到從原混合物中分離特定物質(zhì)的目的，抗體與抗原之間可用親和層析進行分離。

高效液相色譜法，采用高壓輸液系統(tǒng)，將待檢測的液相進行多次的層析分析，隨著蛋白質(zhì)分離檢測的次數(shù)增多，蛋白質(zhì)被檢測的精度也越高。如高旭東等建立了黃芩苷，鹽酸小檗堿和大黃素的高效液相色譜檢測方法;色譜法作為目前較為常用的方法，分離效率較高，具有較快的分析速度，靈敏度高，選擇性好，可同時分析多組，易于自動化，如張元梅等利用高效液相色譜法鑒定柑橘過時中18種類黃酮的含量，實驗結(jié)論證明其分離效果較好。經(jīng)檢測，各類黃酮均被成功分離，偏差較小;但高效液相色譜法不能進行蛋白質(zhì)的定性分析，不能進行相關(guān)蛋白質(zhì)的具體檢測。

1.2.3 電泳法

SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS—PAGE）。SDS—PAGE法是利用蛋白質(zhì)分子量大小不同進行分離[8]。 SDS—PAGE技術(shù)相對誤差較小，如朱廣廉等在用SDS—PAGE分離蛋白質(zhì)時測定丙酮酸激酶等蛋白質(zhì)的分子量，多次測定的誤差均遠小于利用層析法測定所產(chǎn)生的誤差;但凝膠濃度對實驗的精確性有較大影響，在同一實驗中，朱廣廉等通過實驗結(jié)果分析出若膠濃度太低，無法分離核糖核酸酶和嗅酚藍帶，增大了實驗的誤差。若分離膠過濃，則無法分離分子量相似的蛋白質(zhì)分子，使實驗誤差增大。

1.2.4 等電聚焦法

等電聚焦法是利用蛋白質(zhì)等電點不同進行分離。等電聚焦pH梯度電泳法可以隨意設(shè)定pH梯度，尤其第二輪分析可縮小測定pH值的范圍，提高分辨率及重復性。

1.2.5 雙向電泳

利用蛋白質(zhì)分子大小和等電點不同。第一向等電聚焦電泳，第二向SDS—PAGE電泳[10]，經(jīng)過雙向電泳的分離，蛋白質(zhì)會在二維平面上形成不同的點，每個點就可認為是被分離出的不同蛋白質(zhì)。雙向電泳技術(shù)對蛋白質(zhì)的檢驗較為靈敏，同時檢測后的分辨率較高;但對酸堿性極強的蛋白質(zhì)，疏水性蛋白質(zhì)及含量較少蛋白質(zhì)用此種技術(shù)不易分離，雙向電泳技術(shù)仍存在不足之處。

2? 蛋白質(zhì)分析

2.1 含量的檢測方法

凱氏定氮法、雙縮脲法、紫外吸收法、考馬斯亮藍法等是蛋白質(zhì)含量檢測的常用方法，在實驗中考慮采用何種方法，都是需要結(jié)合不同的環(huán)境進行選擇的，需要用不同的實驗去確定采用的方法。

2.2 蛋白質(zhì)功能分析

酵母雙雜交法免疫共沉淀法和蛋白質(zhì)芯片質(zhì)譜技術(shù)等可以用來對蛋白質(zhì)的功能進行分析。對于蛋白質(zhì)的功能進行分析是一個比較復雜的實驗操作，但是為了研究蛋白質(zhì)在不同生物通路上的作用，對于蛋白質(zhì)功能的研究是必須的，因此應(yīng)該考慮使用不同的適用方法進行研究。

2.3 蛋白質(zhì)的鑒定

以前對蛋白質(zhì)的鑒定主要通過測序和雙向電泳來完成。雙向電泳通過蛋白質(zhì)分子量和等電點的不同使蛋白質(zhì)在凝膠上移動分離，將凝膠上的蛋白質(zhì)位置對比已有的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，鑒定出蛋白質(zhì)種類的方法特異性低、低效、且準確率低。利用質(zhì)譜技術(shù)可以快速、高效地對目的蛋白進行鑒定分析，且使用的樣品量小。原理是將分子離子化后的樣品，根據(jù)分子離子間荷質(zhì)比的不同來分離并生成圖譜。

3? 蛋白組學的現(xiàn)狀及改進

目前蛋白組學的應(yīng)用存在于多個方面，在各個生物領(lǐng)域均可發(fā)揮其作用。利用研究植物在極端條件下（高溫）的蛋白質(zhì)種類變化，即將正常的植株進行一定的處理，使其形成突變體，將突變體內(nèi)的蛋白質(zhì)種類與正常個體內(nèi)的蛋白質(zhì)種類進行比較，得出極端條件下植物體內(nèi)的蛋白質(zhì)種類會發(fā)生變化，分析含量變化的蛋白質(zhì)可能存在的對植物在非生物脅迫下的抗性能力的影響，并據(jù)此對蛋白組學相關(guān)應(yīng)用展開展望。同時，可利用蛋白組學分析具有將強活性的生物堿的分泌機理，在蛋白組學上更好的研究如何對植株進行誘導使其活性增加。針對較復雜的（全身性自身免疫疾?。┘膊。珙愶L濕關(guān)節(jié)炎，單從基因水平無法闡釋病理各環(huán)節(jié)錯綜復雜的聯(lián)系，而利用蛋白組學技術(shù)則在蛋白質(zhì)組水平上解釋該類問題，加快了相關(guān)疾病治療的效率。但若疾病涉及的易感因子較多，考慮將多個蛋白進行結(jié)合以檢測。蛋白組學技目前存在較廣泛的應(yīng)用，但仍有待改進，發(fā)展之處，其中大概包括蛋白質(zhì)的動態(tài)分辨率，定量，純化方面存在的問題。之前的蛋白質(zhì)組學檢測技術(shù)的定量精度都非常低，甚至是無法實現(xiàn)定量。但是在現(xiàn)如今生命科學發(fā)展迅猛的情況下，對于蛋白質(zhì)的動態(tài)變化要求很高，所以對于蛋白質(zhì)的定量精度也提高了要求。例如在SDS-PAGE膠上用熒光染料來檢測蛋白質(zhì)，同樣質(zhì)譜法也可對蛋白質(zhì)進行定量。值得注意的是，疏水蛋白因其難溶于水的性質(zhì)，在蛋白組學的研究中難以進行實驗，因而可以采用有機溶劑溶解疏水性蛋白后進行下一步的實驗。

4? 總結(jié)與展望

質(zhì)譜技術(shù)、色譜技術(shù)的不斷研究和創(chuàng)新，使植物蛋白組學不斷向前邁進。植物蛋白組學憑借其廣泛的應(yīng)用范圍和巨大的利益效應(yīng)，取得許多重大的成就，充分體現(xiàn)蛋白組學巨大的發(fā)展?jié)摿?。本文就蛋白組學的研究方法做了總結(jié)，包括蛋白質(zhì)的獲取以及蛋白質(zhì)含量的測定、功能分析，再到蛋白質(zhì)組的鑒定，著重介紹了研究過程中涉及到的技術(shù)，以期能夠為想開展蛋白質(zhì)組學研究的人員提供參考，同時也希望能對蛋白組學技術(shù)的發(fā)展起到鋪墊作用。

參考文獻：

[1]李肖芳.應(yīng)用蛋白質(zhì)組學方法研究鹽角草（Salicornia europaea L.）的抗鹽性[D].中國科學院研究生院（植物研究所），2006.

[2]李雪輝，段紅麗，潘錦添，等.離子交換色譜法檢測離子液體中陰離子[J].分析化學，2006，34（u09）：192-194.

[3]張根連，范術(shù)麗，宋美珍，等.植物蛋白質(zhì)組學技術(shù)研究進展[J].生物技術(shù)通報，2011（7）：26-30.

[4]楊中華，張立娜，張錦，等.中空纖維離心超濾-高效凝膠排阻色譜法測定青霉素V鉀中蛋白雜質(zhì)[J].分析科學學報，2018（2）.

[5]余秀娟，王驪麗，張如月，等.L-精氨酸對提高蛋白質(zhì)復性與純化率的作用及其分析[J].內(nèi)蒙古大學學報（自然科學版）， 2017（6）：612-618.

[6]高旭東，師永清，陳士恩，等.雙波長HPLC測定梔子金花丸中梔子苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿和大黃素的含量[J].國際藥學研究雜志，2015，42（3）：409-412.

[7]高旭東，師永清，陳士恩，等.雙波長HPLC測定梔子金花丸中梔子苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿和大黃素的含量[J].國際藥學研究雜志，2015，42（3）：409-412.

[8]Liang X， Bai J， Liu Y H， et al. Characterization of SDS--PAGE-separated proteins by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry[J]. Analytical Chemistry， 1996， 68（6）：1012.

[9]張元梅，周志欽，孫玉敬，等.高效液相色譜法同時測定柑橘果實中18種類黃酮的含量[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2012，45（17）：3558-3565.

[10]朱廣廉，楊中漢.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的分子量[J].植物生理學報，1982（2）：45-49.

[11]劉素麗，魯勇，王學軍，等.一種新型速效人胰島素類似物的構(gòu)建、制備及性質(zhì)研究[J].東南大學學報（醫(yī)學版），2009，28（5）：371-375.

[12]鄧湘雄，張曉勤，胡江，等.一種適用于雙向電泳的水稻磷酸化蛋白富集方法——酚提取法結(jié)合固相金屬離子親和層析法[J].中國生物化學與分子生物學報，2012，28（11）：1057-1063.