枝孢菌AY-42產(chǎn)纖維素酶液態(tài)發(fā)酵優(yōu)化

衡文，李豪，馬一凡，白光劍，鄒偉

(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644005)

纖維素酶(cellulase)是一種高活性的生物催化劑，在食品生產(chǎn)加工[1]、包裝運(yùn)輸中應(yīng)用廣泛。纖維素酶能有效降解細(xì)胞壁中的纖維素，使胞內(nèi)物質(zhì)溶出，提高芫荽總黃酮產(chǎn)率[2]。通過纖維素復(fù)合酶解法，研究復(fù)合發(fā)酵調(diào)味品[3]，增加調(diào)味品風(fēng)味的豐富度，提高冷榨大豆出油率[4]，提升產(chǎn)品質(zhì)量。利用酶解法制備的納米纖維素[5]，能均衡民眾每日攝入營養(yǎng)，提高膳食水平。自然界中有很多微生物都能降解纖維素類物質(zhì)，細(xì)菌[6,7]、真菌及放線菌都有大量相關(guān)報(bào)道。雖然纖維素酶生產(chǎn)菌株種類繁多，但多數(shù)存在纖維素酶活較低、酶系不完全等問題，影響菌株在發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用。目前纖維素酶生產(chǎn)主要有液體發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵兩種方式，其中，液體發(fā)酵具有過程易控制、不易染菌、效率高和質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，且技術(shù)成熟，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。

枝孢菌屬是一類廣泛存在于土壤、空氣、污泥等環(huán)境中的常見真菌微生物，屬于半知菌類，能夠產(chǎn)生串狀分生孢子。目前發(fā)現(xiàn)的枝孢菌多寄生于植物中或者為腐生菌，這種生活方式?jīng)Q定了枝孢菌具有降解木質(zhì)纖維素的能力[8]。目前，研究產(chǎn)纖維素酶的微生物以真菌為主，如木霉屬、曲霉屬、青霉屬、孢霉屬及脈孢霉屬等[9-14]。作為能夠產(chǎn)纖維素酶的菌株，枝孢菌屬產(chǎn)纖維素酶的報(bào)道以及在食品方面的應(yīng)用均較少。

本實(shí)驗(yàn)室前期從自然界腐殖土、腐木中篩選獲得產(chǎn)纖維素酶菌株，并對(duì)其進(jìn)行紫外誘變、常壓室溫等離子體(ARTP)復(fù)合誘變菌株，使其CMC酶活達(dá)到(3.23±0.01) IU/mL，F(xiàn)PA酶活達(dá)到(0.51±0.02) IU/mL，較原始菌株B03CMC酶活(2.37±0.02) IU/mL提高了36.14%，較FPA酶活(0.26±0.01) IU/mL提高了97.03%[15]。本研究對(duì)枝孢菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素條件進(jìn)行了優(yōu)化，為枝孢菌在食品工業(yè)方面的進(jìn)一步應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

試驗(yàn)菌株：枝孢菌AY-42，實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)存菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉(CMC-Na) 10 g，蛋白胨3.0 g，KH2PO44.0 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，去離子水1000 mL。

分離培養(yǎng)基：CMC-Na 10 g，(NH4)2SO44.0 g，蛋白胨1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41.0 g，瓊脂20 g，去離子水1000 mL。

液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基：CMC-Na 10 g，蛋白胨3.0 g，酵母膏0.2 g，(NH4)2SO42.0 g，KH2PO44.0 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，去離子水1000 mL。

氮源優(yōu)化培養(yǎng)基：CMC-Na 10 g，各類氮源2.0 g，NaCl 0.5 g，KH2PO44.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，去離子水1000 mL。

碳源優(yōu)化培養(yǎng)基：各類碳源10 g，酵母粉2.0 g，NaCl 0.5 g，KH2PO44.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，去離子水1000 mL。

1.1.3 試劑與藥品

檸檬酸鈉緩沖液(0.05 mol/L，pH 4.8)、DNS溶液、1 mg/mL剛果紅溶液、羧甲基纖維素鈉、NaCl、FeSO4、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、酵母膏、(NH4)2SO4、麩皮、秸稈粉等。

1.1.4 儀器設(shè)備

MJ-250恒溫培養(yǎng)箱、TG-16醫(yī)用離心機(jī) 四川蜀科儀器有限公司；PHS-3C酸度計(jì)、YX280A型高壓蒸汽滅菌鍋、SW-CJ-1F凈化工作臺(tái)、HH-6D數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州普天儀器制造有限公司；V-1000可見分光光度計(jì) 翱藝儀器有限公司；SKY-2102C恒溫振蕩器 上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 粗酶液制備

將枝孢菌AY-42接種于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h制成種子液，按5%的接種量接種于液體產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中28 ℃、180 r/min培養(yǎng)3 d，用紗布將菌液過濾再以8000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液，依據(jù)濾紙酶(FPA酶)活力測定粗酶液的CMC酶活。

1.2.2 培養(yǎng)基單因素試驗(yàn)

以麩皮、油菜秸稈粉、羧甲基纖維素鈉、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉為碳源，以NH4Cl、NH4NO3、蛋白胨、酵母粉、(NH4)2SO4、尿素為氮源，優(yōu)化培養(yǎng)基。將接種液以5%體積比接種到碳、氮源優(yōu)化培養(yǎng)基中，探究菌株的最佳碳、氮源。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)選定油菜秸稈粉、酵母粉、NaCl、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O 6個(gè)因素進(jìn)行考察，以CMC酶活為響應(yīng)值，各因素水平見表1。

表1 Plackett-Burman因素水平Table 1 Factors and levels used for Plackett-Burman design g

1.2.4 最陡爬坡試驗(yàn)

最陡爬坡試驗(yàn)是根據(jù)響應(yīng)值的變化梯度確定爬坡方向，再根據(jù)顯著因素的效應(yīng)值確定步長。根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果，確定影響因素最顯著的3個(gè)因素為油菜秸稈粉、MgSO4·7H2O、KH2PO4。最陡爬坡設(shè)計(jì)見表2。

表2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 2 Experimental design of steepest ascent path g

1.2.5 Box-Behnken設(shè)計(jì)

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果確定Box-Behnken設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)及各因素的水平，對(duì)影響產(chǎn)纖維素酶顯著的因素是油菜秸稈粉、MgSO4·7H2O、KH2PO4(見表3)。在三因素三水平上，對(duì)枝孢菌產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 3 Factors and levels used for Box-Benhnken design g

利用Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面分析，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果使用Design-Expert軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立響應(yīng)面模型，以確定最優(yōu)的培養(yǎng)基成分組合。為了檢驗(yàn)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果的準(zhǔn)確性，使用響應(yīng)面優(yōu)化的最佳培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株，將試驗(yàn)值與預(yù)測值進(jìn)行對(duì)比分析，驗(yàn)證模型是否準(zhǔn)確。

1.2.6 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

通過響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，使用得到的最優(yōu)培養(yǎng)基進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件。其余培養(yǎng)條件不變，依次對(duì)接種量、搖瓶裝液量、溫度、轉(zhuǎn)速、時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。接種量分別選擇2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%的種子液；裝液量選擇150 mL三角瓶中盛裝30，50，70，90，110 mL的液體培養(yǎng)基；發(fā)酵溫度選擇20，23，25，28，30，33，35，38 ℃；轉(zhuǎn)速設(shè)置為140，160，180，200，220，240 r/min；發(fā)酵時(shí)間選擇1，2，3，4，5，6，7 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳、氮源對(duì)酶活的影響

圖1 不同碳、氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.1 The effect of carbon and nitrogen sources on enzyme production of AY-42

由圖1可知，以可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖為碳源時(shí)菌株可生長，但產(chǎn)纖維素酶活力不高。纖維素酶在微生物中為誘導(dǎo)酶，在外界沒有纖維素類物質(zhì)誘導(dǎo)時(shí)微生物產(chǎn)纖維素酶不多，因此在可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中菌株產(chǎn)纖維素酶活力不高。在以油菜秸稈粉、麩皮、羧甲基纖維素鈉為碳源時(shí)菌株能生長，并且產(chǎn)纖維素酶活力較高，這說明在有纖維素類物質(zhì)存在的情況下，菌株產(chǎn)纖維素酶水平得到提高，纖維素類物質(zhì)對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶能力具有較好的誘導(dǎo)作用。綜上，選擇油菜秸稈粉為碳源做下一步優(yōu)化。

不同氮源下培養(yǎng)菌株產(chǎn)CMC酶活見圖1。試驗(yàn)結(jié)果顯示：以酵母粉作為氮源時(shí)菌株發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活力最高，以(NH4)2SO4與蛋白胨作為氮源時(shí)產(chǎn)酶活力也較高，以尿素、NH4NO3作為氮源時(shí)酶活力較低，因此，選擇酵母粉為氮源。

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果分析

確定最佳的碳源和氮源后，以AY-42為試驗(yàn)菌株，CMC酶活為響應(yīng)值進(jìn)行搖瓶產(chǎn)酶發(fā)酵，選定油菜秸稈粉、酵母粉、MgSO4·7H2O、NaCl、KH2PO4、FeSO4·7H2O 6個(gè)因素進(jìn)行考察，A為油菜秸稈粉、B為酵母粉、C為MgSO4·7H2O、D為NaCl、E為KH2PO4、F為FeSO4·7H2O，G，H，I，J，K為虛擬變量，用以驗(yàn)證試驗(yàn)誤差，試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果表Table 4 Experimental result of Plackett-Burman

表5 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果分析Table 5 Experimental result analysis of Plackett-Burman

注：“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01。

根據(jù)表5中結(jié)果，使用Design-Expert軟件對(duì)各因素進(jìn)行顯著性分析，可知對(duì)酶活影響最顯著的3個(gè)因素為：C MgSO4·7H2O>A 油菜秸稈粉>E KH2PO4。不同菌株對(duì)培養(yǎng)基的要求存在差異，陳逸文[16]在對(duì)密旋鏈霉菌菌株進(jìn)行培養(yǎng)基組成優(yōu)化時(shí)，通過Plackett-Burman試驗(yàn)得到的顯著影響因素為麩皮、KH2PO4、吐溫-80。董妙音[17]優(yōu)化綠色木霉培養(yǎng)基組成時(shí)發(fā)現(xiàn)初始pH、CMC-Na濃度、蛋白胨這3個(gè)因素對(duì)酶活的影響最顯著。纖維素酶是誘導(dǎo)酶，秸稈粉的存在會(huì)使菌株分泌更多的纖維素酶，Mg2+、K+對(duì)酶的生成、分泌會(huì)造成影響。

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)分析

在Plackett-Burman試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究油菜秸稈粉、MgSO4·7H2O、KH2PO4這3個(gè)關(guān)鍵因素對(duì)CMC酶活的影響，結(jié)果見表6。

表6 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Experimental result of steepest ascent path

續(xù) 表

由表6試驗(yàn)結(jié)果可知，第3組試驗(yàn)纖維素酶活力達(dá)到最大，為3.72 IU，選擇第3組試驗(yàn)作為中心點(diǎn)。

2.4 響應(yīng)面分析

2.4.1 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果分析

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果確定Box-Behnken設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)及各因素的水平，以影響產(chǎn)纖維素酶顯著的因素油菜秸稈粉、MgSO4·7H2O、KH2PO4的用量做自變量，以CMC酶活作為因變量，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表7。

表7 Box-Behnken設(shè)計(jì)表Table 7 Experimental result of Box-Behnken

使用Design Expert軟件，對(duì)Box-Behnken設(shè)計(jì)組合試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，得到菌株纖維素酶酶活與A油菜秸稈粉、C MgSO4·7H2O、E KH2PO4之間的三元二次回歸方程：

Y=3.72+0.18A+0.23C+0.19E+0.0072AC-0.058AE-0.16CE-0.29A2-0.13C2-0.82E2。

回歸方程的方差分析見表8，結(jié)果表明試驗(yàn)所用模型P<0.0001,達(dá)到極顯著，說明方程擬合良好。失擬項(xiàng)P值為0.2663，>0.05，不顯著。失擬項(xiàng)是評(píng)估方程可靠性的重要指標(biāo)，失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著也說明方程模擬較好，如果顯著說明方程誤差占比很大，需要重新建模。方程的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9957，說明擬合良好，試驗(yàn)誤差較小。一次項(xiàng)A，C，E的線性效應(yīng)均顯著，二次項(xiàng)A2、C2、E2對(duì)產(chǎn)酶的曲面效應(yīng)均顯著，因素A，C和C，E對(duì)菌株產(chǎn)酶的交互作用顯著，A，E對(duì)產(chǎn)酶的交互影響不顯著。

表8 回歸方程方差分析表Table 8 ANOVA analysis for regression equation

2.4.2 各因素交互作用的響應(yīng)面分析

各因素對(duì)CMC酶活的交互作用響應(yīng)面見圖2。

圖2 兩兩因素對(duì)CMC酶活交互影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface of cellulase activity of two factors interaction

由圖2中a可知，油菜秸稈粉與MgSO4·7H2O的交互作用不明顯，由圖2中b和圖2中c可知，油菜秸稈粉與KH2PO4、MgSO4·7H2O與KH2PO4的交互作用明顯。本試驗(yàn)菌株產(chǎn)CMC酶活經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基組成后達(dá)(3.67±0.04) IU，高于陳逸文、Han L R等[18]研究的菌株產(chǎn)酶水平，使用響應(yīng)面優(yōu)化效果較好。

2.5 液體發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

試驗(yàn)使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基油菜秸稈粉12.5 g/L、酵母粉2 g/L、MgSO4·7H2O 0.75 g/L、NaCl 0.5 g/L、KH2PO45 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L，優(yōu)化菌株的培養(yǎng)時(shí)間、裝液量、接種量、轉(zhuǎn)速、溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響，見圖3。

圖3 發(fā)酵條件對(duì)CMC酶活力的影響Fig.3 Effect of fermentation conditions on CMC enzyme activity

由圖3中a可知，菌株在第3天進(jìn)入平穩(wěn)期，產(chǎn)酶能力在3 d時(shí)達(dá)到最高水平，從第4天開始產(chǎn)酶能力開始下降，與菌株生長周期基本一致。故選擇發(fā)酵3 d作為最佳的發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間。由圖3中b可知，在150 mL三角瓶中裝液量為70 mL時(shí)產(chǎn)酶能力最高，CMC酶活達(dá)到(3.81±0.07) IU，超過70 mL后菌株產(chǎn)酶能力下降。由圖3中c可知，接種量達(dá)到5%后，接種量對(duì)菌種產(chǎn)酶的影響不大。接種量為5%或大于5%時(shí)菌株能較快達(dá)到適宜的菌體濃度并利用培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)酶，使得產(chǎn)酶能力較高。由圖3中d可知，轉(zhuǎn)速增至200 r/min時(shí)酶活達(dá)到最大值(4.06±0.05) IU，隨后酶活隨轉(zhuǎn)速增加而降低。由圖3中e可知，枝孢菌產(chǎn)酶能力隨著溫度的升高而升高，在培養(yǎng)溫度為28 ℃時(shí)菌株產(chǎn)酶能力最好，CMC酶活達(dá)(4.20±0.06) IU，28 ℃后隨著溫度的上升，菌株產(chǎn)酶能力減弱。

3 結(jié)果與討論

目前纖維素酶已應(yīng)用到食品、發(fā)酵、飼料、能源及環(huán)保等多個(gè)領(lǐng)域中，具有巨大的應(yīng)用前景。本文的菌株篩選于自然界腐殖土、腐木，初始酶活為(2.37±0.02) IU/mL，高于陳逸文等報(bào)道的初始酶活，具有較強(qiáng)的初始產(chǎn)酶能力。經(jīng)紫外誘變、ARTP誘變得到的AY-42菌株酶活為(3.23±0.01) IU/mL，高于陳麗燕等[19]報(bào)道的菌株酶活。本試驗(yàn)以誘變后的菌株為基礎(chǔ)，通過單因素試驗(yàn)得到培養(yǎng)基的最適碳源、氮源分別為油菜秸稈、酵母粉，以CMC酶活力作為響應(yīng)值，對(duì)CMC酶活的關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，得出關(guān)鍵因素的最佳添加量：油菜秸稈粉12.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.75 g/L，KH2PO40.5 g/L。經(jīng)驗(yàn)證，此條件下CMC酶活為(3.67±0.04) IU，提高了13.62%。在最佳培養(yǎng)基組成條件下，進(jìn)一步對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，菌株的最佳培養(yǎng)時(shí)間為3 d，最佳接種量為5%，最適裝液量為70 mL，最適轉(zhuǎn)速為200 r/min，最佳培養(yǎng)溫度為28 ℃。經(jīng)過優(yōu)化后CMC酶活最終達(dá)到(4.20±0.06)IU，相比優(yōu)化前酶活3.23 IU提高了30.03%，高于韓立榮等[20]、任璐等[21]報(bào)道的產(chǎn)纖維素酶能力。

目前關(guān)于產(chǎn)纖維素酶的菌具有纖維素酶合成能力的微生物，多為木霉屬、曲霉屬、青霉屬等，枝孢菌產(chǎn)纖維素酶的報(bào)道不多。本研究探究了枝孢菌AY-42的粗酶酶活，后續(xù)將分離純化纖維素酶以獲得純度較高的酶，為其進(jìn)一步應(yīng)用于食品及調(diào)味品提供了理論基礎(chǔ)。