張立煒 蘇哲 劉大成 周長勇

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院急診內(nèi)科，山東 青島 266003)

目前，心血管疾病(CVD)仍然是人類主要的死亡原因[1]。心肌缺血再灌注(I/R)可導(dǎo)致局部缺血性心肌損傷，稱為心肌I/R損傷[2]，細(xì)胞凋亡是引起心肌I/R損傷的重要原因之一[3]。因此，減少心肌細(xì)胞的凋亡是治療CVD的關(guān)鍵。異黃酮是一種植物雌激素，可以有效治療CVD[4-5]。染料木黃酮(GEN)是一種大豆制品中的異黃酮，被普遍認(rèn)為是蛋白酪氨酸激酶(PTK)的抑制劑[6-7]，具有顯著的抗氧化、抗癌及抗衰老等作用[8-10]。目前，已有研究證明GEN具有心臟保護(hù)作用，其是通過激活Ca2+通道、Cl-通道或者通過激酶途徑發(fā)揮心臟保護(hù)作用[11-12]。也有報道發(fā)現(xiàn)GEN同時具有緩解心肌肥大[13]、減輕心臟功能障礙[11]等心臟保護(hù)功能。此外，最近有研究證明SDF-1a/CXCR4信號通路在CVD，尤其是心臟修復(fù)和缺血后的組織穩(wěn)態(tài)中起著重要作用[14-15]，但CXCR4是否影響心臟I/R仍然是未知的。本研究旨在探討GEN是否通過調(diào)控CXCR4蛋白的表達(dá)來抑制氧化應(yīng)激和I/R損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮心臟保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 材料

GEN購自西安青悅生物技術(shù)有限公司。H9c2細(xì)胞由青島大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)院提供。7～8周齡雄性C57小鼠購自北京維通利華生物科技有限公司。涉及動物的所有程序均經(jīng)過青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物保護(hù)與采用委員會的審查和批準(zhǔn)。

1.2 試劑與試劑盒

Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司；Bax抗體、Bcl-2抗體和CXCR4抗體均購自英國Abcam公司。TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國YEASEN公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

將H9c2細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)0.1牛血清、100 kU/L青霉素與100 mg/L鏈霉素的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基中，細(xì)胞置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)以普通培養(yǎng)液(對照組)、加入100 mol/L過氧化氫(過氧化氫組)及同時加入100 mol/L過氧化氫和0.1 mol/L GEN(研究組)分別培養(yǎng)H9c2細(xì)胞，24 h后進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)。

1.4 小鼠心肌I/R損傷模型的建立及各組的處理

將小鼠隨機(jī)分為對照組、I/R損傷組(I/R組)、I/R損傷+GEN組(研究組)，每組5只小鼠。對照組行假手術(shù)處理；I/R組將小鼠心臟左前降支冠狀動脈(LAD)結(jié)扎30 min后再灌注3 h；研究組小鼠預(yù)先腹膜內(nèi)注射50 mg/kg的GEN后結(jié)扎LAD并再灌注3 h。隨后用頸椎脫臼法處死所有小鼠，開胸取小鼠心臟，在4 ℃下置于4%多聚甲醛中固定24 h后對其行冰凍切片，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 TUNEL染色和測定

將細(xì)胞和組織切片分別在PBS緩沖液中洗滌，然后在4 ℃下于4%多聚甲醛中固定30 min。將固定的細(xì)胞及切片在PBS緩沖液中洗滌3次，并在室溫下用通透溶液處理25 min。采用TUNEL試劑盒檢測細(xì)胞凋亡情況，并記錄TUNEL陽性細(xì)胞的數(shù)目，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比。

1.6 免疫印跡分析

在含有體積分?jǐn)?shù)0.01蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液中裂解并提取動物實(shí)驗(yàn)中對照組、I/R組和研究組中心肌細(xì)胞的總蛋白以及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中對照組、過氧化氫組和研究組H9c2細(xì)胞的總蛋白。每個樣品中等量的蛋白質(zhì)在含有體積分?jǐn)?shù)0.12十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。37 ℃下將膜在封閉溶液中浸泡1 h后用Tris緩沖鹽水洗滌15 min，將膜在含體積分?jǐn)?shù)0.05的脫脂牛奶中封閉1 h后與相對應(yīng)的一抗和二抗按序孵育。檢測動物實(shí)驗(yàn)各組心肌細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)情況以及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中各組H9c2細(xì)胞的Bax、Bcl-2和CXCR4蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1 GEN對過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡以及蛋白表達(dá)的影響

TUNEL法檢測結(jié)果顯示，對照組、過氧化氫組以及研究組凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比分別為(36.23±3.03)%、(50.34±3.34)%、(38.92±2.63)%，研究組的凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比與對照組和過氧化氫治療組相比，差異具有顯著意義(F=326.53,P<0.05)。

免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組、過氧化氫組及研究組中心肌細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)量分別為1.57±0.50、30.75±1.70、11.00±1.82，研究組Bax蛋白表達(dá)量與對照組和過氧化氫治療組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.32,P<0.05)；對照組、過氧化氫組及研究組心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)量分別為0.47±0.03、0.35±0.01、0.44±0.06，研究組Bcl-2蛋白表達(dá)量與對照組和過氧化氫組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=144.76,P<0.05)。對照組、過氧化氫組及研究組中H9c2細(xì)胞CXCR4蛋白表達(dá)量分別為0.54±0.04、0.84±0.07、0.62±0.03，研究組H9c2細(xì)胞CXCR4蛋白水平與對照組和過氧化氫組相比，差異有顯著性(F=23.98,P<0.05)。

2.2 GEN對動物I/R損傷后心肌細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL法檢測結(jié)果顯示，對照組、I/R組及研究組動物模型心臟中凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比分別為(1.25±0.95)%、(21.50±2.65)%、(6.07±1.35)%，與I/R組相比較，研究組小鼠I/R損傷后心肌細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少，差異具有顯著意義(F=121.74,P<0.05)。免疫印跡結(jié)果顯示，對照組、I/R組及研究組動物模型心臟中Bcl-2/Bax比值分別為1.23±0.07、0.42±0.03、2.03±0.08，與I/R組相比，研究組小鼠I/R損傷后心肌Bcl-2/Bax比值明顯增高，差異具有顯著性(F=54.16,P<0.05)。

3 討 論

CVD分為慢性CVD和急性CVD，患者死亡率極高[1-2]。目前CVD的治療方案多采用西藥治療，但西藥治療存在一定的副作用，致使患者依從性較差。研究表明，中藥療法是預(yù)防和治療CVD比較有前途的綜合療法之一[16-18]。

GEN具有顯著的心臟保護(hù)作用。本研究中，經(jīng)GEN預(yù)處理可抑制過氧化氫誘導(dǎo)的Bax蛋白表達(dá)增加，同時可增加過氧化氫誘導(dǎo)的Bcl-2蛋白表達(dá)，TUNNEL法檢測結(jié)果顯示，GEN預(yù)處理可顯著減少H9c2細(xì)胞的凋亡，在動物實(shí)驗(yàn)中，GEN預(yù)處理也可減少小鼠I/R損傷后的心肌細(xì)胞凋亡，這表明GEN預(yù)處理可明顯抑制氧化應(yīng)激和I/R損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。另一方面，CXCR4蛋白的表達(dá)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，其可促進(jìn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，而免疫印跡法檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究組中H9c2細(xì)胞的CXCR4蛋白表達(dá)量遠(yuǎn)低于過氧化氫組細(xì)胞的CXCR4蛋白表達(dá)量，提示GEN預(yù)處理可明顯抑制CXCR4蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。GEN于1994年首次被證明通過Ras-MAP激酶信號傳導(dǎo)途徑預(yù)防心肌細(xì)胞肥大[6]，后續(xù)研究證明它通過調(diào)節(jié)Ca2+通道、Cl-通道的活性以及心肌細(xì)胞中的心臟興奮-收縮耦聯(lián)來參與心臟代謝[11-12]。同時，GEN還可通過調(diào)節(jié)miR-451/TIMP2來逆轉(zhuǎn)心臟肥大[13]。因此，GEN是一種靶向治療CVD十分有前途的藥物，可能在改善心臟功能障礙方面具有更多潛在的作用。而本研究結(jié)果顯示，GEN能夠通過調(diào)節(jié)CXCR4蛋白表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，以防止氧化應(yīng)激對心臟的傷害。但是，該機(jī)制下的特定信號傳導(dǎo)途徑尚不明確。CXCR4已被證明是microRNA-210的重要靶基因，microRNA-210通過靶向CXCR4蛋白進(jìn)而加重缺氧所致的心肌細(xì)胞損傷[19]。另外，GEN也參與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞中microRNA的表達(dá)[15,20]，其極有可能調(diào)節(jié)CXCR4上游的某些microRNA或蛋白質(zhì)從而影響細(xì)胞的凋亡程序。因此，探討GEN對CXCR4蛋白表達(dá)的調(diào)控機(jī)制具有重要的應(yīng)用價值。

綜上所述，GEN可能通過下調(diào)心肌細(xì)胞內(nèi)的CXCR4蛋白的表達(dá)進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激和I/R損傷下的心肌細(xì)胞凋亡，然而GEN調(diào)節(jié)CXCR4的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。