楊顯紅，齊新文，李松軍

(遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬(珠海)醫(yī)院骨二科，廣東 珠海 519100)

骨質(zhì)疏松性骨折(osteoporotic fracture，OPF)是骨組織發(fā)生實質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松、骨脆性增加等病理生理改變后，在低能量甚至無暴力情況下發(fā)生的一種病理性骨折，以高發(fā)病率(13%)、高致殘率、高致死率的特征嚴(yán)重危害人類健康，成為繼心血管疾病、糖尿病之后的第三大慢性疾病[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國部分地區(qū)OPF患病率高達(dá)55.8%，成為全球OPF發(fā)病率最高的國家，是老年患者致殘和致死的主要病因[2-4]。目前臨床上治療OPF主要以手術(shù)內(nèi)固定為主，但骨實質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松易導(dǎo)致骨折延遲愈合，甚至不愈合，顯著增加了再骨折的發(fā)生風(fēng)險[5]。因此，尋找有效的治療方向和措施對OPF有重要的研究意義。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是存在于機(jī)體結(jié)締組織和間質(zhì)中具有多向分化潛能的一種干細(xì)胞，BMSCs數(shù)量減少或生物學(xué)活性下降可減弱成骨細(xì)胞的增殖能力，使骨小梁生成減少，引起骨組織動態(tài)重建失衡，骨實質(zhì)微結(jié)構(gòu)稀疏，最終發(fā)生OPF[6]。另一方面，在OPF發(fā)生時，BMSCs可通過細(xì)胞分泌、免疫調(diào)節(jié)、基因調(diào)節(jié)、信號通路等多種作用機(jī)制促進(jìn)受損骨組織生成新骨，同時還可提高局部血管的再生能力，為骨組織重建提供良好的微環(huán)境?？梢?，維持BMSCs的正常生物學(xué)活性與OPF的疾病治療之間有著密切的聯(lián)系。現(xiàn)就BMSCs治療OPF的機(jī)制予以綜述。

1 BMSCs概述

BMSCs于軸骨或外周骨松質(zhì)骨(海綿狀)的骨小梁中生成，在體內(nèi)、體外多種不同的誘導(dǎo)條件下可進(jìn)一步分化為胰腺細(xì)胞(內(nèi)胚層)、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞(中胚層的)以及神經(jīng)細(xì)胞(外胚層)等多胚層細(xì)胞，與機(jī)體多系統(tǒng)功能的維持有重要的聯(lián)系。研究顯示，BMSCs在骨髓組織中表達(dá)最豐富，但含量很少，且與年齡的增長呈負(fù)相關(guān)；同時，體外實驗研究證實，可通過控制細(xì)胞的培養(yǎng)條件，致使BMSCs作為“種子細(xì)胞”被定向誘導(dǎo)分化為特定的功能目的細(xì)胞，到達(dá)特定部位，完成歸巢，從而發(fā)揮特有的生物學(xué)活性作用；且BMSCs可多途徑獲得，具有標(biāo)本取材方便、體外增殖能力強(qiáng)、細(xì)胞順應(yīng)性高、免疫排斥反應(yīng)弱等優(yōu)點，經(jīng)局部微環(huán)境移植到宿主后對激素性、糖尿病性、代謝性、老年性等多種OPF均有一定的療效[7-8]。近年來，BMSCs的移植治療機(jī)制、途徑、劑量等成為骨折治療的研究熱點。

2 BMSCs治療OPF的相關(guān)機(jī)制

2.1BMSCs歸巢 BMSCs歸巢是OPF治療機(jī)制的重要環(huán)節(jié)，OPF發(fā)生時，BMSCs在機(jī)體各種機(jī)制的協(xié)同作用下進(jìn)入血液循環(huán)，與受損骨組織中被激活的血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行高速“滾動”接觸，并且在局部炎癥因子、免疫調(diào)節(jié)因子、趨化因子等多細(xì)胞因子刺激下發(fā)生卷曲形變，隨即粘連附著在血管內(nèi)皮細(xì)胞上，與G蛋白偶聯(lián)因子、整合素等跨膜受體相結(jié)合激活后，可穿跨細(xì)胞膜，進(jìn)入骨髓龕位微環(huán)境；緊接著，在白細(xì)胞介素-1、炎癥趨化因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β等各種細(xì)胞因子的介導(dǎo)下，與骨折處血管內(nèi)皮細(xì)胞上的“地址素細(xì)胞黏附分子”靶向結(jié)合，發(fā)生定向遷移和分化，最終實現(xiàn)BMSCs到達(dá)OPF病變部位，從而發(fā)揮生物學(xué)活性的歸巢和植入過程；由此可見，在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的滾動過程是BMSCs歸巢的第一步，研究BMSCs歸巢機(jī)制有十分重要的意義[9-10]。

但是BMSCs自身缺乏血管內(nèi)皮細(xì)胞的緊密結(jié)合能力，移植到動物體內(nèi)骨折處5～8 d后，在骨折區(qū)才有微弱的熒光信號，代表了少數(shù)BMSCs完成歸巢移植過程，且該信號持續(xù)1～3 d后消失[11]。因此，提高BMSCs移植歸巢率對治療OPF有十分重要的作用。BMSCs表面能夠表達(dá)多種整合素分子，可促進(jìn)BMSCs的附著歸巢過程。試驗顯示，在P-選擇素基因缺失或體內(nèi)呈現(xiàn)中和抗體的P-選擇素元件時，人BMSCs與人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞滾動結(jié)合的發(fā)生率會顯著降低[12-13]。另外，Xiao和Chen[14]研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)含有N-連接唾液乳糖胺的CD44糖原變異體使用α-(1，3)-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶vi修飾后，產(chǎn)生E-/L-選擇素配體，誘導(dǎo)兔BMSCs巖藻糖基化，在注射BMSCs移植6周后檢查發(fā)現(xiàn)，小鼠的歸巢能力顯著增強(qiáng)。侯費祎等[15]將4′,6-二脒基-2-苯基吲哚標(biāo)記的BMSCs靜脈注射于顱骨缺損的大鼠體內(nèi)，同時予麝香酮灌胃干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，麝香酮可顯著增加骨組織缺損處的BMSCs數(shù)量，并呈濃度依賴性，提示麝香酮可促進(jìn)BMSCs在大鼠體內(nèi)的歸巢。由此表明，增加特定選擇素、整合素等基因和蛋白的表達(dá)，降低體內(nèi)相關(guān)抗體蛋白的分泌或進(jìn)行必要的蛋白“修飾”細(xì)胞后，可能會有效提高BMSCs與血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合率和歸巢率。越來越多的研究人員試圖用基因轉(zhuǎn)染修飾工程來解決這些問題。Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，紅色熒光蛋白轉(zhuǎn)染的BMSCs更容易定位于骨折部位，且股骨的力學(xué)性能得到顯著改善。

2.2細(xì)胞分泌 細(xì)胞因子在細(xì)胞增殖、分化、胚胎發(fā)育、細(xì)胞外基質(zhì)形成、骨的形成和重建等方面起著不可或缺的作用。BMSCs完成滾動接觸、附著、遷移和分化等過程需要一個可以保持自我更新和多向分化潛能的良好微環(huán)境。在特定微環(huán)境下，BMSCs自身可以表達(dá)很多細(xì)胞因子，并促進(jìn)一系列細(xì)胞因子釋放，通過自分泌及旁分泌的途徑促進(jìn)成骨細(xì)胞不斷增殖分化。Lu 等[17]發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子-α增強(qiáng)核因子、胞外信號調(diào)節(jié)激酶活化后，呈劑量依賴性地提高血管細(xì)胞黏附分子1的表達(dá)水平，促進(jìn)人臍帶BMSCs緊密黏附于靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。而轉(zhuǎn)化生長因子和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)在成骨及成軟骨方面起著重要作用，常曉朋等[18]研究顯示，經(jīng)慢病毒包裝的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的BMSCs、BMP-2及轉(zhuǎn)化生長因子-β2的表達(dá)水平顯著升高。同時，在微環(huán)境的形成過程中，還有其他細(xì)胞因子的參與。于佳等[19]研究表明，在卵巢早衰模型大鼠體內(nèi)注射BMSCs后15 d，大鼠體內(nèi)胰島素樣生長因子1受體核酸和蛋白表達(dá)水平均顯著升高，與空白對照組相比，可顯著促進(jìn)局部骨折愈合及恢復(fù)。另一方面，當(dāng)BMSCs 凋亡或代謝后不再駐留時，仍然可以通過損傷組織周圍被激活的干細(xì)胞，激活和啟動宿主自身的再生過程，繼續(xù)修復(fù)受損組織[20]，這一作用的相關(guān)機(jī)制目前仍未明確。近年來，越來越多的研究關(guān)注BMSCs的“營養(yǎng)”生物學(xué)活性在組織再生過程中的作用。BMSCs移植后，損傷組織分泌可溶性細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白以及一系列的營養(yǎng)因子，通過“細(xì)胞-細(xì)胞”直接接觸的形式介導(dǎo)BMSCs和受損組織相鄰細(xì)胞緊密接觸，激活損傷周圍的干細(xì)胞，參與到骨折愈合的過程，并且在急性損傷期，BMSCs可能主要通過其“營養(yǎng)功能”促進(jìn)組織再生[21]。由此可見，移植至宿體的BMSCs的分泌功能及其對自身干細(xì)胞的激活功能在OPF治療中也發(fā)揮著重要的作用，研究具體的分泌機(jī)制可能會帶來新的突破口。

2.3BMSCs治療骨折的相關(guān)信號通路 骨折發(fā)生時局部多細(xì)胞因子可通過激活相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而發(fā)揮生物學(xué)活性。Wnt信號通路是目前骨代謝相關(guān)疾病的研究熱點，當(dāng)條件性剔除破骨細(xì)胞中的β聯(lián)蛋白基因時，會顯著降低骨量，而條件性激活β聯(lián)蛋白的表達(dá)后，則出現(xiàn)了骨量增多，表明Wnt/β聯(lián)蛋白信號通路的激活可促進(jìn)成骨生成，抑制骨吸收，從而促進(jìn)骨折愈合[22]。相反，Yuan等[23]的實驗研究表明，過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPAR)γ是BMSCs向成骨細(xì)胞分化過程中不可或缺的轉(zhuǎn)錄雙系調(diào)節(jié)因子，PPARγ表達(dá)減少可增強(qiáng)BMSCs成骨分化作用，抑制軟骨分化，表明抑制PPAR信號途徑的進(jìn)一步激活可促進(jìn)骨折的愈合。研究顯示，CXC趨化因子受體[chemokine(C-X-C motif) receptor，CXCR]陽性細(xì)胞可以通過骨髓釋放遷移到受損組織外周血中，且在基質(zhì)細(xì)胞衍生因子趨化作用下表現(xiàn)為濃度升高，而加入中和抗體CXCR后，BMSCs的遷移率降至48%，表明通過激活CXCR/基質(zhì)細(xì)胞衍生因子信號途徑可促進(jìn)遷移和歸巢[24]。另外，多信號通路之間也有相互促進(jìn)-抑制作用，從而在骨折治療過程中聯(lián)合發(fā)揮不同的生物學(xué)活性作用。Yuan等[23]的動物體內(nèi)實驗顯示，激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號途徑可同時有效抑制PPAR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，最終加速骨折的愈合進(jìn)程。研究不同信號途徑在骨折愈合過程中的正負(fù)向、上下游相關(guān)關(guān)系及其發(fā)揮作用的具體位點，有利于研究藥物治療骨折的結(jié)合靶位點及具體機(jī)制。

2.4免疫調(diào)節(jié) 當(dāng)干細(xì)胞進(jìn)入人體后，可減輕宿主-細(xì)胞的免疫相互反應(yīng)，會更加有效地發(fā)揮BMSCs的功能。BMSCs不表達(dá)CD80、CD86和CD40，進(jìn)一步抑制單核細(xì)胞和CD34+造血祖細(xì)胞分化，不能激活宿主淋巴細(xì)胞[25-28]；通過蛋白切割作用抑制自然殺傷細(xì)胞p30和g2d基因的表達(dá)，抑制自然殺傷細(xì)胞活化，從而在體內(nèi)體現(xiàn)為低免疫原性的優(yōu)點，且該特點不隨著BMSCs的分化而顯著改變，但會誘導(dǎo)免疫耐受[29]。研究證實，當(dāng)BMSCs和自然殺傷細(xì)胞在體外共培養(yǎng)時，可有效抑制自然殺傷細(xì)胞活化、干擾素的產(chǎn)生及細(xì)胞毒性作用；當(dāng)BMSCs與抗原特異性T細(xì)胞共同孵育時，也能抑制抗原特異性T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞毒性作用[30]。

2.5基因調(diào)節(jié) 細(xì)胞分化受多種細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和微RNA(microRNA，miRNA)的調(diào)節(jié)控制，miRNA可間接或靶點直接調(diào)節(jié)細(xì)胞因子活性、信號通路等環(huán)節(jié)，實現(xiàn)針對性治療。目前逐漸開展miRNA在OPF方面的研究，但具體機(jī)制仍未明確，且研究較少。miRNA是一種小的非編碼RNA，能抑制轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)或降解其靶點。孫毅等[31]研究顯示，利用小鼠BMSCs與miR-187-5p基因轉(zhuǎn)染，過表達(dá) miR-187-5p可提高堿性磷酸酶、膠原纖維蛋白-1、BMP-4、骨鈣素和骨橋蛋白等成骨分化相關(guān)基因核酸的表達(dá)水平，促進(jìn)BMSCs向成骨分化；而敲低miR-187-5p基因可顯著降低堿性磷酸酶等成骨分化相關(guān)基因核酸的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)，抑制BMSCs向成骨細(xì)胞的分化增殖。

3 BMSCs移植治療OPF的可行性

BMSCs數(shù)量的減少或功能的缺損可直接引起骨質(zhì)疏松，容易進(jìn)一步導(dǎo)致OPF。因此，系統(tǒng)或局部移植正常功能的BMSCs對治療OPF具有一定的療效。大量動物實驗研究證實，BMSCs移植可促進(jìn)成骨分化，增加局部骨量，促進(jìn)骨折愈合[32-35]。目前干細(xì)胞移植治療研究集中在動物體內(nèi)實驗，主要包括單純BMSCs移植、修飾后移植和新型復(fù)合材料移植。Tewari等[36]將BMSCs移植入大鼠體內(nèi)3 h后，改善了局部鈣結(jié)合能力。高翔等[37]通過肌內(nèi)注射地塞米松建立大鼠骨質(zhì)疏松性骨缺損模型，BMSCs移植術(shù)后4周可分離得到BMSCs，且顯微計算機(jī)斷層掃描檢測結(jié)果表明，BMSCs細(xì)胞治療能促進(jìn)激素型OPF的愈合。另一方面，大量實驗研究均在不斷地探索并驗證通過基因組織工程學(xué)技術(shù)修飾BMSCs可不同程度地提高OPF的治療效果，而BMP-2互補(bǔ)DNA及其相應(yīng)的重組體蛋白具有克服調(diào)節(jié)屏障的優(yōu)勢，顯示出一定的安全性和生物學(xué)作用[38]，為OPF的治療提供了新的可能。Xu等[39]發(fā)現(xiàn)，基因修飾后的BMSCs與細(xì)胞外基質(zhì)混懸液可抑制脂肪細(xì)胞分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子PPAR的表達(dá)，顯著增強(qiáng)成骨分化能力，改善骨質(zhì)疏松。邢德國[40]將BMP-2和胰島素樣生長因子1共轉(zhuǎn)染的BMSCs注射于糖尿病大鼠骨折局部，結(jié)果骨密度以及骨痂最大橫截面積顯著改善，成熟軟骨細(xì)胞分化和成骨細(xì)胞增殖顯著提高。

隨著研究技術(shù)及機(jī)制的不斷深入，越來越多的移植方式被發(fā)明。構(gòu)建復(fù)合材料對移植治療骨折也有顯著療效，Li等[41]證實，Si@SiO2納米復(fù)合材料(160 μg/mL，pH 7.4，37.0 ℃)的干預(yù)可以上調(diào)CXCR-4 核酸的表達(dá)水平，提高BMSCs的遷移數(shù)量，降低活性氧化物的表達(dá)，保護(hù)BMSCs免受H2O2誘導(dǎo)的成骨分化的抑制作用，促進(jìn)大鼠股骨開放性骨折的體內(nèi)愈合。Hu等[42]研究表明，合成銀納米粒子在濃度為4 μmol的特定濃度時，可誘導(dǎo)溴脫氧尿嘧啶核苷濃度增加，促進(jìn)小鼠BMSCs增殖，利于骨折愈合。

4 小 結(jié)

骨是一種動態(tài)組織，通過成骨細(xì)胞介導(dǎo)骨形成的平衡作用維持其對機(jī)體的支撐作用。BMSCs可通過多種機(jī)制有效治療骨損傷，具有廣闊的應(yīng)用前景。但是BMSCs移植治療OPF還處在動物實驗階段，存在統(tǒng)一移植量、移植純度和歸巢率優(yōu)化、移植細(xì)胞代數(shù)和治療時間窗等問題。近年來，BMSCs相關(guān)的臨床試驗不斷增加。在將來，OPF患者可能會取其親代(兒子或?qū)O子)的BMSCs進(jìn)行體外增殖，以促進(jìn)骨折愈合，具有操作簡單、創(chuàng)傷小、可重復(fù)注射、免疫原性弱以及可實施性的優(yōu)點，但仍需進(jìn)一步的臨床試驗提供理論支持。同時，在手術(shù)內(nèi)固定穩(wěn)定的情況下，聯(lián)合BMSCs移植可能更有利于骨折愈合，可能會為OPF的治療帶來更有效的臨床效果。