趙旭東 黃永志 畢延震 董發(fā)明

（1. 河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，洛陽(yáng) 471023；2. 動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430064）

當(dāng)今，動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要應(yīng)用于動(dòng)物遺傳改良、培育動(dòng)物新品種、制造生物反應(yīng)器、建立疾病模型和器官移植等［1-4］，部分動(dòng)物轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化開(kāi)發(fā)。如在2015年美國(guó)FDA批準(zhǔn)了轉(zhuǎn)基因三文魚(yú)上市，成為世界上首個(gè)獲批可用作食材的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物［5］。目前，動(dòng)物轉(zhuǎn)基因遇到的瓶頸是外源基因表達(dá)沉默。其原因主要集中在以下兩個(gè)方面：染色體DNA水平上的位置效應(yīng)［6］和外源基因表觀修飾異常。近些年，隨著定點(diǎn)整合技術(shù)的飛速發(fā)展和友好位點(diǎn)的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用，克服外源基因表達(dá)沉默有了新的解決方案。為此，本文對(duì)動(dòng)物轉(zhuǎn)基因高效表達(dá)策略進(jìn)行了歸納和論述，以期對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研制和推廣有所裨益。

1 利用友好位點(diǎn)

當(dāng)前，基因編輯技術(shù)的發(fā)展使外源基因定點(diǎn)敲入變得相對(duì)簡(jiǎn)單且高效，但不能忽視的是外源基因依然面臨著敲入到何處的難題，這是因?yàn)榛蚯萌氲膮^(qū)域不同，將直接造成基因表達(dá)的效率差異。友好位點(diǎn)就是基因組中表達(dá)外源基因較為活躍的區(qū)域。因此，利用定點(diǎn)整合技術(shù)將外源基因插入至友好位點(diǎn)將是解決外源基因表達(dá)沉默的有效途徑。友好位點(diǎn)的探索、挖掘與驗(yàn)證工作，已歷經(jīng)了長(zhǎng)達(dá)20多年之久，在哺乳動(dòng)物中已成功鑒定出多個(gè)可行的友好位點(diǎn)。例如，Rosa26、Hipp11、chr1-attP等位點(diǎn)。

1.1 Rosa26位點(diǎn)

Rosa26位點(diǎn)是一種最常用的友好位點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用在以小鼠、大鼠、豬等為實(shí)驗(yàn)對(duì)象的研究之中［7-9］。 早 在 1991 年 Friedrich 和 Soeiano［10-11］使用逆轉(zhuǎn)錄捕獲技術(shù)在小鼠基因組中率先發(fā)現(xiàn)并鑒定出Rosa26位點(diǎn)。他們?cè)O(shè)計(jì)一個(gè)報(bào)告基因 β-geo（由β-半乳糖（β-gal）和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（neo）形成的融合基因），利用該報(bào)告基因載體共篩選出了29個(gè)陽(yáng)性單克隆ES細(xì)胞。后分析發(fā)現(xiàn)代號(hào)為ROSAβgeo26小鼠品系的純合子和雜合子小鼠均無(wú)任何異常表型，報(bào)告基因 β-geo在該品系小鼠所有細(xì)胞和成體組織中都呈高表達(dá)，且該位點(diǎn)有著極高的插入效率，Rosa26位點(diǎn)已廣泛的運(yùn)用在外源基因的定點(diǎn)整合中。Carreras等［12］將人的PCSK9基因插入至小鼠Rosa26位點(diǎn)，得到了高膽固醇血癥疾病的小鼠動(dòng)物模型。2007年，Irion等［13］首次在人的胚胎干細(xì)胞基因組中鑒定出Rosa26位點(diǎn)。2012年，Kobayashi等［14］在大鼠基因組中同樣發(fā)現(xiàn)了Rosa26位點(diǎn)。2014 年，Li等［15］利用同源比對(duì)的方法找到了豬源Rosa26 位點(diǎn)，通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸 酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALEN）技術(shù)將報(bào)告基因插入到該位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了綠色熒光蛋白在豬胎兒成纖維細(xì)胞（Porcine fetal fibroblast，PFF）內(nèi)的定點(diǎn)整合表達(dá)，并利用體細(xì)胞核移植技術(shù)得到了在Rosa26位點(diǎn)定點(diǎn)整合綠色熒光蛋白的仔豬，后經(jīng)熒光檢測(cè)證實(shí)敲入此位點(diǎn)的報(bào)告基因在豬全身各組織器官都能高表達(dá)，證明了豬源Rosa26位點(diǎn)同樣是利于外源基因表達(dá)的一個(gè)友好位點(diǎn)。目前，利用該位點(diǎn)已成功開(kāi)發(fā)了數(shù)種表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或細(xì)胞系。

1.2 Hipp11位點(diǎn)

Hipp11 位點(diǎn)是由斯坦福大學(xué)的Hippenmeyer等［16］發(fā)現(xiàn)并命名，它位于小鼠基因組第11號(hào)染色體 Eif4enif1與 Drg1 基因之間，由于Eif4enif1、Drg1兩個(gè)基因的側(cè)翼序列區(qū)域具有廣泛的空間和時(shí)間表達(dá)序列標(biāo)簽（Expression sequence tag，EST）表達(dá)模式，能夠使整合在此的外源基因受指定啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)而穩(wěn)定高表達(dá)，且該位點(diǎn)的純合敲入小鼠可正常發(fā)育和繁殖，因此Hipp11是一個(gè)表達(dá)外源基因的友好位點(diǎn)。介于鼠源Hipp11位點(diǎn)具有安全性高，無(wú)基因沉默和廣泛表達(dá)活性的特點(diǎn)，阮進(jìn)學(xué)團(tuán)隊(duì)相信豬源Hipp11位點(diǎn)也極具潛力，2014年，Ruan等［17］使用同源比對(duì)方法在豬基因組中找到了豬源Hipp11位點(diǎn)，并利用TALENs和CRISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了基因打靶。不僅實(shí)現(xiàn)對(duì)豬源Hipp11位點(diǎn)的鑒定，更證明該位點(diǎn)為豬基因組上一個(gè)表達(dá)外源基因的友好位點(diǎn)，這為外源基因在豬基因組內(nèi)高效表達(dá)定點(diǎn)整合提供了新的選擇。

1.3 chr1-attP位點(diǎn)

眾所周知，鏈霉菌噬菌體φC31整合酶具有將attB位點(diǎn)與attP位點(diǎn)特異性結(jié)合的特點(diǎn)，該系統(tǒng)通過(guò)attB介導(dǎo)外源基因可以實(shí)現(xiàn)在attP位點(diǎn)的定點(diǎn)整合。研究表明多種真核動(dòng)物體內(nèi)都存在假attP位點(diǎn)［18-23］。在此基礎(chǔ)上，畢延震等［24-26］通過(guò)構(gòu)建內(nèi)含attB和增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因（Enhanced green fluorescent protein，EGFP）的報(bào)告載體與φC31整合酶表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞系，在豬基因組中找到4個(gè)假attP位點(diǎn)。隨后通過(guò)顯微注射φC31整合酶mRNA和EGFP報(bào)告載體至豬一細(xì)胞受精卵中，得到了轉(zhuǎn)基因仔豬。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因仔豬耳源組織成纖維細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)4個(gè)假attP位點(diǎn)中的chr1-attP位點(diǎn)對(duì)EGFP有較高水平的表達(dá)，從而確定chr1-attP位點(diǎn)是個(gè)利于外源基因高效表達(dá)的友好位點(diǎn)。

1.4 Pifs 501位點(diǎn)

Pifs 501位點(diǎn)是Ma等［27］于2018年分析鑒定出的1個(gè)豬源友好位點(diǎn)。先使用In Silico生物學(xué)方法在豬基因組中預(yù)測(cè)了多個(gè)備選位點(diǎn)，通過(guò)對(duì)其中評(píng)分較好的兩個(gè)位點(diǎn)Pifs 501和Pifs 302，使用CRISPR/Cas9介導(dǎo)位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，將EGFP插入其中，并與pRosa26位點(diǎn)橫向比對(duì)，結(jié)果顯示pRosa26和Pifs 501對(duì)外源基因的表達(dá)水平均遠(yuǎn)高于Pifs 302，盡管pRosa26對(duì)EGFP表達(dá)更高，然而Pifs 501同樣是一個(gè)有利于外源基因表達(dá)的豬源友好位點(diǎn)。

2 定點(diǎn)整合技術(shù)

要利用友好位點(diǎn)，就不得不提到定點(diǎn)整合技術(shù)。如果把友好位點(diǎn)比喻為“目的地”，那么定點(diǎn)整合技術(shù)就是到達(dá)目的地的“路徑”。當(dāng)前的定點(diǎn)整合技術(shù)主要有以下幾種：基因編輯技術(shù)、位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)和轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)。

2.1 基因編輯技術(shù)

時(shí)至今日，基因編輯技術(shù)已經(jīng)歷3次變革，鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）［28］是最早開(kāi)發(fā)使用的基因編輯系統(tǒng)。該系統(tǒng)由特異識(shí)別DNA的鋅指核酸序列和非特異性核酸切割酶組成［29］。Bibikova等［30］通過(guò)構(gòu)建ZFN靶位點(diǎn)載體和ZFN表達(dá)載體，并將其共轉(zhuǎn)然細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)了ZFNs能將基因組切割開(kāi)的基因編輯能力。Perez-Pinera等［31］在2011年通過(guò)ZFNs系統(tǒng)配合同源重組，成功地在Rosa26位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)外源基因的插入表達(dá)，證明了ZFNs系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)外源基因的定點(diǎn)整合。第二代基因編輯技術(shù)TALENs又名轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶［32］。2014 年，李小平［33］借助 TALENs基因編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)豬友好位點(diǎn)的精確敲入。相比于前代ZFNs，TALENs具有構(gòu)建更為簡(jiǎn)單、細(xì)胞毒性更小、切割效率更高等特點(diǎn)［34］。Wu 等［35］利用 TALENs將小鼠的SP110基因敲入至?；蚪M中，最終得到抗肺結(jié)核菌的轉(zhuǎn)基因牛抗病模型。第三代基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas系統(tǒng)是學(xué)者們?cè)谘芯考?xì)菌和古細(xì)菌的免疫機(jī)制中發(fā)現(xiàn)的［36-37］。以CRISPR/Cas9為例，早期的CRISPR系統(tǒng)需要crRNA（CRISPR-derived RNA）與tracrRNA（Trans-activating RNA）參與并結(jié)合Cas9蛋白表達(dá)以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的切割［38］。而后優(yōu)化的CRISPR/Cas9系統(tǒng)由一條單鏈sgRNA即可引導(dǎo)Cas9切割sgRNA靶位點(diǎn)區(qū)域，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組靶位點(diǎn)區(qū)域的定向編輯。相較于前兩代基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas系統(tǒng)更易于操作、構(gòu)建簡(jiǎn)單、效率更高。Yang等［39］在2013年使用該基因編輯技術(shù)，利用同源重組（Homologous recombination，HR）修復(fù)機(jī)制將報(bào)告基因插入至小鼠基因組中，實(shí)現(xiàn)了定點(diǎn)整合穩(wěn)定表達(dá)。阮進(jìn)學(xué)［40］同樣使用該基因編輯技術(shù)在細(xì)胞內(nèi)引起DNA雙鏈斷裂（Double strand break，DSB），利用同源重組介導(dǎo)外源基因，實(shí)現(xiàn)了大片段基因的插入。

雖然CRISPR/Cas9利用同源重組介導(dǎo)能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因的插入，但是由于同源重組的效率極低，嚴(yán)重影響了定點(diǎn)整合的敲入效率。當(dāng)然，同源重組只是DNA發(fā)生雙鏈斷裂之后其中一種修復(fù)途徑，非同源末端鏈接（Non-homologous end joining，NHEJ）［41-42］修復(fù)也是其中一種。由NHEJ介導(dǎo)同樣可以實(shí)現(xiàn)外源基因的插入，美中不足的是盡管NHEJ在插入效率上遠(yuǎn)高于HR，但它屬于一種易錯(cuò)修復(fù)，會(huì)造成插入的外源基因出現(xiàn)缺失，因此當(dāng)需要精確、高保真的定點(diǎn)整合外源基因時(shí)，NHEJ也非最佳的選擇。Nakade等［43］和 Sakuma等［44］提出利用微同源的末端鏈接（Microhomology-mediated end joining，MMEJ）介導(dǎo)的外源基因插入，并將這種方法稱為精確整合到靶染色體系統(tǒng)（Precise integration into target chromosome，PITCh）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，無(wú)論是利用TALENs構(gòu)建的TAL-PITCh系統(tǒng)或是利用CRISPR/Cas構(gòu)建的CRIS-PITCh系統(tǒng)都具備高效的外源基因插入能力。隨后Sakuma團(tuán)隊(duì)［45-47］又在多種動(dòng)物或細(xì)胞上證明，MMEJ具有高保真和高效率的敲入特性，是介導(dǎo)外源基因敲入的良好方法。

2.2 位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)

相較于當(dāng)前使用的基因編輯技術(shù)去實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)插入，早期的定點(diǎn)整合主要是通過(guò)位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的。比較有代表性的是Cre/Loxp、Flp/FRT和φC31。Cre/Loxp重組系統(tǒng)［48］由Loxp序列和Cre重組酶組成。Flp/FRT重組系統(tǒng)［49］由FRT序列和Flp重組酶組成。φC31系統(tǒng)［50］源于鏈霉菌噬菌體，由識(shí)別序列attB、attP和φC31重組酶組成。Cacciatore等［51］在綜述位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)時(shí)詳細(xì)列舉介紹了這3個(gè)系統(tǒng)。Cartwright等［52］利用Cre/Loxp系統(tǒng)成功構(gòu)建了表達(dá)多種功能蛋白的小鼠模型。Bischof等［53］利用φC31特異性重組系統(tǒng)構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因果蠅，實(shí)現(xiàn)了大片段cDNA的插入。不過(guò)這3種技術(shù)均有不足，Cre/LoxP和Flp/FRT均需要在宿主基因組內(nèi)“預(yù)植”識(shí)別位點(diǎn)，這本身就增加了操作難度。φC31整合酶的識(shí)別位點(diǎn)不是“唯一”的，可能帶來(lái)多位點(diǎn)整合，同樣為后續(xù)研究增加了復(fù)雜性。

2.3 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)

轉(zhuǎn)座子（Transposon）也稱轉(zhuǎn)座元件，是一類可以在基因組中某一位點(diǎn)轉(zhuǎn)移或自我復(fù)制到另一個(gè)位點(diǎn)從而改變它們?cè)诨蚪M中原有位置或增加其拷貝數(shù)的遺傳因子。轉(zhuǎn)座是一種特殊的遺傳重組，目前轉(zhuǎn)座子按其轉(zhuǎn)座的方式可以分為兩大類：一類直接以DNA到DNA的形式在轉(zhuǎn)座酶的參與下進(jìn)行“剪切-粘貼”式轉(zhuǎn)座，稱為DNA轉(zhuǎn)座子；另一類則以RNA為中介，在反轉(zhuǎn)錄酶參與下完成“復(fù)制-粘貼”式轉(zhuǎn)座，稱為反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。

隨著研究的深入，科研人員還創(chuàng)造了轉(zhuǎn)座子與基因編輯結(jié)合的系統(tǒng)。2017年8月，Peters等［54］發(fā)現(xiàn)了一類編碼在Tn7-like轉(zhuǎn)座子中的CRISPR/Cas系統(tǒng)。在此基礎(chǔ)上，2019年6月，美國(guó)麻省理工學(xué)院的張鋒研究組［55］證實(shí)了藍(lán)細(xì)菌中CRISPR-associated transposase（CAST））系統(tǒng)具有RNA引導(dǎo)轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行目的DNA插入的能力；同一時(shí)間美國(guó)哥倫比亞大學(xué)的Klompe等［56］也證明了霍亂弧菌中的一種Tn7-like轉(zhuǎn)座子相關(guān)CRISPR/Cas（Cascade）系統(tǒng)的基因編輯能力。兩個(gè)系統(tǒng)分別基于V-K CRISPR/Cas和 I-F CRISPR/Cas系統(tǒng)，都能實(shí)現(xiàn)不產(chǎn)生DSB的情況下將外源DNA片段定向插入到細(xì)菌基因組DNA中。兩個(gè)系統(tǒng)雖然都不夠完善，但是相比于利用同源重組的編輯方式在安全性和效率上都具備天然的優(yōu)勢(shì)，也為基因編輯定點(diǎn)整合至基因組DNA提供了新的研究方向。

總的來(lái)說(shuō)，雖然幾大系統(tǒng)都可以實(shí)現(xiàn)外源基因的定點(diǎn)敲入，但各系統(tǒng)還是存在著不同的優(yōu)點(diǎn)和缺陷。就基因編輯技術(shù)而言，它的優(yōu)勢(shì)是可用靶點(diǎn)眾多，且構(gòu)建簡(jiǎn)單。例如CRISPR/Cas9系統(tǒng)依靠 PAM 序列和 sgRNA 就可實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)的識(shí)別；劣勢(shì)是雖然能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因的定點(diǎn)整合，但是目前多是利用HR的DNA修復(fù)方式完成，由于HR效率過(guò)低，給陽(yáng)性克隆的篩選帶來(lái)了很大的難度。科研人員在后續(xù)的研究中為克服HR的低效問(wèn)題陸續(xù)提出了非同源末端鏈接（NHEJ）、微同源介導(dǎo)的末端鏈接（MMEJ）、獨(dú)立的同源性靶向整合（Homology-independent targeted integration，HITI）［57］、同源介導(dǎo)的末端鏈接（Homology-mediated end joining，HMEJ）［58］等方式，但這些介導(dǎo)插入方式仍然存在著外源基因插入效率不夠高或是插入DNA序列保真性較差等不足。位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)和轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)雖然存在著可用靶點(diǎn)少的問(wèn)題，但其在插入效率上要明顯高于HR、MMEJ或NHEJ，故這些系統(tǒng)有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

通過(guò)基因編輯技術(shù)與位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)或轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)之間的結(jié)合使用，先利用基因編輯技術(shù)將位點(diǎn)特異性系統(tǒng)或是轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)識(shí)別序列攜帶報(bào)告基因一同插入至友好位點(diǎn)內(nèi)，后使用位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)或是轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，則會(huì)較好地實(shí)現(xiàn)外源基因高效、高保真度的定點(diǎn)敲入。Zhu等［59］等就是先利用TALENs將內(nèi)含φC31-attP、報(bào)告基因、Bxb1-attP序列的表達(dá)盒插入至人源細(xì)胞Hipp11位點(diǎn)處，又利用雙噬菌體重組酶表達(dá)載體和φC31-attB、外源基因、Bxb1-attB序列的表達(dá)載體，通過(guò)位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)將新的外源基因插入在位于Hipp11位點(diǎn)內(nèi)的φC31-attP、Bxb1-attP序列中，得到表達(dá)該基因的細(xì)胞系，成功構(gòu)建了一個(gè)疾病細(xì)胞系模型。這種策略先利用基因編輯技術(shù)彌補(bǔ)位點(diǎn)特異重組系統(tǒng)插入位點(diǎn)單一和敲入?yún)^(qū)域少的短板，后使用位點(diǎn)特異重組或是轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)解決基因編輯效率低下的問(wèn)題，從而實(shí)現(xiàn)在友好位點(diǎn)反復(fù)插入其他功能基因的目的。de Leon等［60］利用CRISPR/Cas9使用與Zhu課題組相同的雙整合酶盒式交換系統(tǒng)（Dual integrase cassette exchange，DICE），通過(guò)先CRISPR后DICE得到了表達(dá)RyR1基因的細(xì)胞系疾病模型，同樣證明了該系統(tǒng)的高效敲入性和在精確編輯上的巨大潛力。

3 優(yōu)化順式作用元件

順式作用元件是廣泛存在于基因旁側(cè)序列中，能影響直接基因表達(dá)的序列。通過(guò)優(yōu)化外源基因的順式作用元件能夠提高外源基因的表達(dá)效率，此方法主要體現(xiàn)在對(duì)表達(dá)載體的優(yōu)化，包括優(yōu)化啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、添加內(nèi)含子、使用染色質(zhì)開(kāi)放元件、添加核基質(zhì)附著區(qū)等。

3.1 啟動(dòng)子、增強(qiáng)子

啟動(dòng)子是RNA聚合酶進(jìn)行高效準(zhǔn)確轉(zhuǎn)錄所必須的，通常來(lái)說(shuō)增強(qiáng)子包含在啟動(dòng)子之中?，F(xiàn)如今發(fā)現(xiàn)的啟動(dòng)子種類有很多，像CMV、β-肌動(dòng)蛋白、c-fos、U6等。如要實(shí)現(xiàn)外源基因的特異性表達(dá)，應(yīng)選擇組織特異性或時(shí)空特異性的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子。Ostroweki等［61］為了實(shí)現(xiàn)標(biāo)簽基因在呼吸系統(tǒng)中的特異性表達(dá)，選用了纖毛特異性啟動(dòng)子作為其表達(dá)元件，最終實(shí)現(xiàn)綠色熒光蛋白的特異性表達(dá)。Bi等［62］對(duì)比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)c-fos啟動(dòng)子對(duì)綠色熒光蛋白較CMV啟動(dòng)子有更高表達(dá)效能。趙芳等［63］使用肌肉特異性啟動(dòng)子SP和CMV雙啟動(dòng)子，成功地在肌肉組織中特異表達(dá)EGFP。Colella等［64］為實(shí)現(xiàn)在特異性多區(qū)域或組織器官中的表達(dá)，研究設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了一種串聯(lián)啟動(dòng)子，這種啟動(dòng)子是通過(guò)對(duì)肝細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和神經(jīng)元中的具有活性的特定組織調(diào)控元件進(jìn)行組合得到的，這種串聯(lián)啟動(dòng)子可實(shí)現(xiàn)標(biāo)簽蛋白在肝臟和肌肉中高效表達(dá)。

3.2 內(nèi)含子

內(nèi)含子對(duì)基因表達(dá)同樣有重要的影響。事實(shí)上在選取目的基因時(shí)，使用基因組DNA或使用添加內(nèi)含子的cDNA，能顯著提高該基因的表達(dá)。Brinster等［65］采用cDNA構(gòu)建的載體在轉(zhuǎn)基因鼠中未能激活該基因。研究發(fā)現(xiàn)β-球蛋白基因在小鼠中表達(dá)時(shí)，第2內(nèi)含子對(duì)于該基因的表達(dá)是必需的，從而發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子在外源基因的表達(dá)中具有相當(dāng)重要的作用。Lu等［66］通過(guò)開(kāi)發(fā)一種小內(nèi)含子質(zhì)粒表達(dá)載體系統(tǒng)，載體元件的一個(gè)通用型5'UTR中內(nèi)含一小型工程內(nèi)含子，該系統(tǒng)不僅克服了基因沉默，較使用典型小圓環(huán)DNA質(zhì)粒載體相比同一外源基因的表達(dá)量提高了10倍。Gallegos等［67］系統(tǒng)敘述了內(nèi)含子增強(qiáng)基因表達(dá)的一系列現(xiàn)象。Jaeger等［68］設(shè)計(jì)網(wǎng)絡(luò)工具Intronserter，利用該工具可以在cDNA作為外源基因序列中設(shè)計(jì)添加內(nèi)含子，實(shí)驗(yàn)證明改造后外源基因的表達(dá)量提高數(shù)倍之多。

3.3 染色質(zhì)開(kāi)放元件

染色質(zhì)開(kāi)放元件（Ubiquitous chromatin opening elements，UCOE）是內(nèi)嵌于甲基化的CpG島且內(nèi)含雙向啟動(dòng)子的基因片段，當(dāng)它連接在載體啟動(dòng)子上游時(shí)，既具有染色質(zhì)重塑功能，還有抵抗基因沉默的作用［69］。Boscolo等［70］發(fā)現(xiàn)源于人的HNRNPA2B1/CBX3基因座上的UCOE可以提高CHO細(xì)胞中重組蛋白的表達(dá)水平3-10倍。高會(huì)貞等［71］利用HNRNPA2B1/CBX3同源比對(duì)得到多個(gè)豬源UCOE序列，通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選出了一個(gè)豬源UCOE能使報(bào)告基因綠色熒光蛋白GFP穩(wěn)定高效表達(dá)，也進(jìn)一步證明了UCOE具有提高外源基因表達(dá)的作用。

3.4 核基質(zhì)附著區(qū)

核 基 質(zhì) 附 著 區(qū)（Matrix attachment regions，MARs）又稱核骨架附著區(qū)，指的是染色體上專一的與核骨架結(jié)合的DNA序列。該序列AT含量豐富，且內(nèi)含拓?fù)洚悩?gòu)酶H保守序列。研究表明在載體元件中添加MAR能夠顯著地消除轉(zhuǎn)基因沉默，消除異染色質(zhì)對(duì)外源基因表達(dá)的影響。李琴等［72］在2017年利用重組CHO細(xì)胞探究載體內(nèi)是否含有MAR對(duì)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的影響，結(jié)果顯示使用CMV啟動(dòng)子配合β-珠蛋白MAR比無(wú)MAR配合的轉(zhuǎn)基因表達(dá)提高了2.14倍。

3.5 優(yōu)化標(biāo)記基因

為高效地篩選表達(dá)外源基因的陽(yáng)性克隆細(xì)胞，常會(huì)使用標(biāo)記基因與之共同表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)弱化抗性標(biāo)記基因的表達(dá)可以降低篩選濃度，減少對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速率的影響，從而獲得細(xì)胞上更高水平的重組蛋白表達(dá)。當(dāng)前弱化抗性標(biāo)記基因的方法主要是突變篩選標(biāo)記基因降低其活性表達(dá)。劉蘇等［73］將表達(dá)載體上的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（NPT）序列中的一個(gè)天冬氨酸突變?yōu)楦拾彼幔囼?yàn)結(jié)果表明突變型NPT對(duì)抗生素G418抗性減弱，其突變型細(xì)胞的EGFP表達(dá)量顯著高于野生型。

3.6 其他

除了上述幾種優(yōu)化順式作用元件的方法，還有一些研究思路同樣能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因的高效表達(dá)。Deykin等［74］測(cè)試了在轉(zhuǎn)基因序列邊界加上轉(zhuǎn)錄終止序列（Transcription terminator sequences，TTS）是否對(duì)轉(zhuǎn)基因表達(dá)有影響。他構(gòu)建了以山羊β-酪蛋白基因啟動(dòng)子表達(dá)Fluc報(bào)告基因的雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體，對(duì)照組啟動(dòng)子上游無(wú)調(diào)控元件，實(shí)驗(yàn)組在啟動(dòng)子上游插入染色質(zhì)絕緣子（HS4）或兩個(gè)雙向TTS，結(jié)果使報(bào)告基因的表達(dá)量提高約10倍，證明了在啟動(dòng)子上游加入TTS能夠促進(jìn)外源基因的表達(dá)。

轉(zhuǎn)基因表達(dá)沉默是普遍存在的現(xiàn)象，常規(guī)質(zhì)粒載體并不能解決這一問(wèn)題。有報(bào)道稱，某些高含量的An/Tn片段可以消除表達(dá)系統(tǒng)中的基因沉默，為此Lu等［75］通過(guò)在質(zhì)粒骨架中設(shè)計(jì)加入An/Tn序列組（優(yōu)化An/Tn數(shù)量不改變編碼氨基酸），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明加入An/Tn序列后，不僅阻止了外源基因的轉(zhuǎn)錄沉默，得到的表達(dá)載體具有在小鼠肝臟中持續(xù)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的特性。

從生物安全的角度看，僅僅實(shí)現(xiàn)外源基因高效表達(dá)是不夠的，還應(yīng)該注意衍生的問(wèn)題，特別是外源基因整合過(guò)程中可能引入選擇標(biāo)記，選擇標(biāo)記的殘留可能造成生物安全隱患，所以在設(shè)計(jì)外源基因高效表達(dá)方案時(shí)，還應(yīng)同時(shí)考慮如何處理標(biāo)記，確保最終產(chǎn)品滿足安全要求。例如，王志蕊［76］提出的使用Cre/Loxp可以做到基因組的無(wú)選擇標(biāo)記基因修飾，實(shí)現(xiàn)對(duì)選擇標(biāo)記基因完全刪除。此外，Kim等［77］提出并證明使用微同源末端連接（Microhomologymediated end joining，MMEJ）技術(shù)同樣可以實(shí)現(xiàn)對(duì)選擇標(biāo)記的無(wú)痕刪除。

相信隨著對(duì)基因沉默機(jī)理的深入揭示、友好位點(diǎn)的不斷挖掘和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的改良和創(chuàng)新，通過(guò)以基因編輯技術(shù)為主的多系統(tǒng)靈活運(yùn)用，必將把動(dòng)物轉(zhuǎn)基因研究推向新的高度，更好地用于動(dòng)物育種和生產(chǎn)。

4 總結(jié)與展望

總的來(lái)說(shuō)，為了提高外源基因的表達(dá)效率，當(dāng)前的策略是通過(guò)利用友好位點(diǎn)和優(yōu)化順式作用元件等靈活疊加使用實(shí)現(xiàn)的。這種策略不僅克服了單一定點(diǎn)整合技術(shù)的局限性，更發(fā)揮了各技術(shù)的集成優(yōu)勢(shì)。但就近幾年的實(shí)踐來(lái)看，仍然有幾個(gè)問(wèn)題是要下力氣解決的。

一是定點(diǎn)整合的效率不夠高。雖然動(dòng)物轉(zhuǎn)基因得益于基因編輯技術(shù)的發(fā)展，廣泛的定點(diǎn)整合已成為可能，但定點(diǎn)整合的效率依然處于較低水平。究其根源：其一，定點(diǎn)整合首先依賴于DNA的雙鏈斷裂；其二，在出現(xiàn)DSB之后，切口附近需要足夠的模板DNA引發(fā)整合。未來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題的思路應(yīng)該是增大DSB的產(chǎn)生概率或是使用更有效的整合方式介導(dǎo)外源基因的插入，比如開(kāi)發(fā)切割效率更高的工具酶或是找到合適的方法使DSB附近招募整合更多的模板DNA，提高引發(fā)整合的概率。

二是可用的友好位點(diǎn)數(shù)量較少。對(duì)基因工程動(dòng)物育種來(lái)說(shuō)，目前僅有Rosa26、Hipp11等少數(shù)幾個(gè)友好位點(diǎn)。從長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展看，友好位點(diǎn)的數(shù)量不足，不可避免會(huì)引起知識(shí)產(chǎn)權(quán)的沖突。另外，為追求更高效的友好位點(diǎn)，仍然需要在動(dòng)物基因組內(nèi)做深入的挖掘工作。