曾小儀，龐 璐，陳韻如，田興軍

(南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

用于水培的旱柳插條(直徑1.0 cm，長(zhǎng)度15 cm)于2018年3月采自江蘇省宿遷市。50 μmol/L Cd處理旱柳，生長(zhǎng)會(huì)受到明顯抑制但不致死，在100 μmol/L Cd處理?xiàng)l件下生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，多數(shù)個(gè)體致死(未發(fā)表數(shù)據(jù))。因此，本實(shí)驗(yàn)處理設(shè)置為：0 μmol/L(Control，對(duì)照)，25 μmol/L(Cd25，低濃度Cd處理)，75 μmol/L(Cd75，高濃度Cd處理)。插條在Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：光照/黑暗時(shí)間為14/10 h，白天/黑夜的溫度為25/20 ℃。營(yíng)養(yǎng)液持續(xù)通氣，每隔5 d更換營(yíng)養(yǎng)液。插條用無(wú)Cd營(yíng)養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)3周后，向營(yíng)養(yǎng)液中加入一定濃度的CdCl2繼續(xù)培養(yǎng)5周。

1.2 植物生長(zhǎng)測(cè)定及樣品預(yù)處理

8周培養(yǎng)結(jié)束后，測(cè)量最長(zhǎng)莖長(zhǎng)和最長(zhǎng)根長(zhǎng)，稱(chēng)量新枝(新生枝葉)和根系鮮重。新枝和根系在70 ℃條件下烘干72 h后測(cè)干重。取新鮮根系置于20 mmol/L EDTA-Na2中浸泡20 min(以交換掉根系表面的Cd)，用超純水洗滌并晾干。新鮮葉片與根系在液氮中充分研磨成粉末后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 根系細(xì)胞壁的提取

參考Zhong等[22]的方法，并根據(jù)Zhu 等[23]和Chen等[24]的方法稍作改動(dòng)。以根系粉末(g)和提取液(mL)為1∶80的比例用75 %乙醇提取，提取液與根系材料在冰水浴條件下反應(yīng)20 min，離心(10 000 r/min, 20 min, 4 ℃)去除上清。獲得的沉淀依次加入丙酮，三氯甲烷∶ 甲醇(1∶1)和甲醇按照同樣的方法提取(所有提取液均4 ℃預(yù)冷)。提取完成后的細(xì)胞壁凍干后于4 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 植株及根系細(xì)胞壁Cd含量的測(cè)定

新鮮根系用EDTA-Na2溶液浸泡，超純水洗滌并晾干。新枝與根系于70 ℃下烘干72 h，磨碎。稱(chēng)取烘干研磨后的新枝、根系和1.3中提取的根系細(xì)胞壁各0.05 g，用HNO3/H2O2進(jìn)行消解(USEPA Method 3050B)，然后用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS; NexION300X, PerkinElmer)測(cè)定Cd含量[25]。

1.5 根系細(xì)胞壁多糖的提取及其含量的測(cè)定

參考Zhu等[8]和Dai等[12]的方法分離果膠和半纖維素。稱(chēng)取2 mg細(xì)胞壁，加入1 mL去離子水在沸水浴中提取1 h，離心(12 000 r/min, 20 min, 4 ℃)取上清，重復(fù)提取3次，合并上清，即果膠樣品液。提取果膠后的沉淀加入1 mL 4 %(w/v)KOH[含有0.02 %(w/v)KBH4]，25 ℃下反應(yīng)12 h，離心取上清，重復(fù)提取2次，合并上清，即HC1樣品液。提取HC1后的沉淀，用24 %的KOH[含有0.02 %(w/v)KBH4]提取，提取方法同HC1，即HC2樣品液。樣品液于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參考Zhu等[23]和Blumenkrantz等[26]描述的方法用果膠中的半乳糖醛酸含量來(lái)表征果膠含量。取200 μl果膠樣品，加入1 mL 98 %的H2SO4(含有0.0125 mol/L Na2B4O7·10H2O)，在沸水浴中反應(yīng)5 min。冷卻恢復(fù)至室溫后，向溶液中加入20 μl 0.15 %的間羥基聯(lián)苯(M-hydro-diphenyl)，25 ℃反應(yīng)20 min，測(cè)定520 nm處的吸光度。參考Yang等[27]和Zhu等[8]描述的方法用半纖維素中的葡萄糖含量來(lái)表征半纖維素含量。取200 μl半纖維素樣品，加入1 mL 98 % H2SO4和10 μl 80 %苯酚，在室溫下反應(yīng)15 min。然后在沸水浴中反應(yīng)15 min。冷卻恢復(fù)至室溫后，測(cè)定490 nm處的吸光度。

1.6 根系PME活性測(cè)定

參考Xu等[28]和Dai等[12]的方法測(cè)定PME活性，取0.2 g根系粉末加入1 mL PME提取液(含0.1 mol/L檸檬酸、0.2 mol/L Na2HPO4、1 mol/L NaCl，pH 5.0)，在4 ℃條件下提取1 h，離心(12 000 r/min, 10 min, 4 ℃)取上清，即PME樣品。然后向50 μl PME樣品中加入1 mL PME反應(yīng)液[含0.5 %(w/v)柑橘果膠，0.2 mol/L NaCl和0.015 %(w/v)甲基紅，pH 6.8]，在37 ℃下反應(yīng)2 h，測(cè)定525 nm處的吸光度。

1.7 氧化脅迫指標(biāo)的測(cè)定

CAT活性測(cè)定采用CAT檢測(cè)試劑盒(紫外比色法，Leagene, Beijing, China)，CAT樣品液與H2O2基液反應(yīng)，每隔1 min測(cè)定OD240的值，計(jì)算CAT活性。POD和SOD用磷酸緩沖液提取，其活性測(cè)定分別參考Liu等[31]和Aravind等[32]的方法。POD樣品液與愈創(chuàng)木酚溶液反應(yīng)，每隔1 min測(cè)定OD470的值，計(jì)算POD活性。通過(guò)氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法測(cè)定SOD活性，一個(gè)SOD活性單位表示為將NBT的還原抑制到對(duì)照的50 %時(shí)所需的酶量。GSH含量采用DTNB法于412 nm測(cè)定吸光度[33]。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用 IBM SPSS Statistics 20 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行方差分析(ANOVA)，然后進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)表示存在顯著差異。采用SigmaPlot 12.5繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd對(duì)旱柳生長(zhǎng)的影響

Cd處理使新枝的生物量和莖長(zhǎng)顯著減少(P<0.05，表1)。與對(duì)照相比，Cd25和Cd75處理的新枝鮮重分別減少23.22 %和65.26 %，新枝干重分別減少24.72 %和59.76 %，最長(zhǎng)莖長(zhǎng)分別減少19.25 %和48.52 %(P<0.05)。不同濃度Cd處理的根系生物量和長(zhǎng)度的變化與新枝不同(表1)。與對(duì)照相比，Cd25處理的根系鮮重和干重分別增加10.14 %和4.47 %，Cd75處理的根系鮮重和干重分別減少29.09 %和24.98 %(P<0.05)。此外，Cd25處理的最長(zhǎng)根長(zhǎng)與對(duì)照無(wú)顯著差異(P>0.05)，Cd75處理的最長(zhǎng)根長(zhǎng)比對(duì)照減少33.63 %(P<0.05)。

表1 不同處理對(duì)旱柳新枝和根系的生物量和長(zhǎng)度的影響

2.2 旱柳新枝、根系和根系細(xì)胞壁中Cd的含量

Cd處理濃度的增加使旱柳Cd積累量顯著增加(P<0.05，圖1-a)。與Cd25相比，Cd75處理的根系Cd積累量增加86.89 %，而新枝中的Cd含量減少25.41 %(P<0.05)。Cd25和Cd75處理的根系Cd含量分別占旱柳植株總Cd含量的68.45 %和84.46 %。與Cd25相比，Cd75處理的根系細(xì)胞壁Cd積累量增加13.42 %(P<0.05，圖1-b)。

圖1 旱柳新枝和根系(a)及根系細(xì)胞壁(b)的Cd含量Fig.1 Cd contents in shoots and roots (a) and root cell walls (b) of S. matsudana

2.3 植物根系細(xì)胞壁多糖對(duì)Cd的響應(yīng)

Cd25和Cd75處理的根系細(xì)胞壁果膠含量相比對(duì)照分別增加64.71 %和242.10 %(P<0.05，圖2-a)。根系細(xì)胞壁半纖維素含量與果膠含量的變化不同。與對(duì)照相比，Cd25處理的HC1含量無(wú)顯著差異(P>0.05)，而Cd75處理的HC1升高79.97 %(P<0.05，圖2-c)。HC2含量在25 μmol/L Cd處理下達(dá)到最高，較對(duì)照高33.81 %，而Cd75處理的HC2含量顯著低于Cd25處理(P<0.05，圖2-d)。PME活性與果膠含量變化相似，Cd處理濃度的增加使PME活性增加(圖2-b)。與對(duì)照相比，Cd25和Cd75處理的PME活性分別增加33.65 %和70.51 %(P<0.05)。

果膠和半纖維素含量分別用半乳糖醛酸和葡萄糖含量表征，PME活性用反應(yīng)中單位時(shí)間內(nèi)H+的產(chǎn)量表征Pectin and hemicellulose contents were characterized by galacturonic acid and total sugar contents, respectively. PME activity was characterized by H+ yield per unit time in reactions

2.4 旱柳的氧化應(yīng)激對(duì)Cd脅迫的響應(yīng)

表2 不同處理對(duì)旱柳葉片和根系的氧化應(yīng)激產(chǎn)物和MDA)含量的影響Table 2 Effects of different treatments on the contents of oxidative stress products (H2O2, and MDA) in the leaves and roots of S. matsudana

與對(duì)照相比，Cd25與Cd75處理的葉片CAT活性分別降低了45.88 %和35.81 %，根系CAT活性分別降低了37.66 %和47.31 %(P<0.05，圖3-a)。Cd25處理的葉片POD活性較對(duì)照高59.28 %(P<0.05)，而在Cd75處理下與對(duì)照無(wú)顯著差異(P>0.05)。Cd25和Cd75處理的根系POD活性分別較對(duì)照高203.62 %和24.04 %(P<0.05，圖3-b)。Cd處理使葉片和根系的SOD活性均顯著提高，與對(duì)照相比，Cd25和Cd75處理的葉片SOD活性分別提高1.54 %和1.86 %，根系SOD活性分別提高3.03 %和2.73 %(圖3-c)。對(duì)于抗氧化劑GSH(圖3-d)，Cd25處理的葉片GSH含量較對(duì)照高75.77 %，Cd75處理下與對(duì)照無(wú)顯著差異(P>0.05)。而Cd25和Cd75處理的根系GSH含量與對(duì)照相比分別增加22.98 %和38.08 %(P<0.05)。

圖3 不同處理的旱柳葉片和根系的CAT(a)、POD(b)、SOD(c)活性以及GSH含量(d)Fig.3 CAT activity (a), POD activity (b), SOD activity (c) and GSH content (d) in leaves and roots of S. matsudana under different treatments

3 討 論

Cd被認(rèn)為是毒性最強(qiáng)的環(huán)境污染物之一，過(guò)量的Cd會(huì)嚴(yán)重抑制植物生長(zhǎng)和發(fā)育[34]。發(fā)現(xiàn)即使低濃度Cd也會(huì)顯著抑制旱柳新枝的生長(zhǎng)，高濃度Cd對(duì)新枝生長(zhǎng)造成了更嚴(yán)重的損害，表現(xiàn)為新枝生物量和莖長(zhǎng)的減少。這種生長(zhǎng)抑制的產(chǎn)生，一方面可能與Cd誘導(dǎo)細(xì)胞壁加厚有關(guān)，細(xì)胞壁加厚會(huì)降低細(xì)胞的延展性，導(dǎo)致細(xì)胞伸長(zhǎng)受阻[12]。另一方面可能與植物激素有關(guān)，Sun等[35]發(fā)現(xiàn)重金屬會(huì)干擾植物激素的極性運(yùn)輸，從而導(dǎo)致植物激素分布紊亂并抑制植物生長(zhǎng)。大多數(shù)情況下，由于土壤或水體污染，Cd通過(guò)根部進(jìn)入植物組織，因此根系的Cd耐性對(duì)于植物生長(zhǎng)尤為重要[36]。高濃度Cd顯著抑制了旱柳根系生長(zhǎng)，而低濃度Cd對(duì)根系生物量和根長(zhǎng)的影響不大。該結(jié)果與前人的研究類(lèi)似，Yang等[3]測(cè)試了39個(gè)柳樹(shù)品種對(duì)Cd的累積特性，表明一定濃度范圍的Cd不會(huì)影響甚至增加某些柳樹(shù)品種的地上部或根系的生物量，當(dāng)Cd濃度超出柳樹(shù)的耐受范圍，會(huì)導(dǎo)致生物量下降。

根系被認(rèn)為是大多數(shù)植物積累重金屬的主要部位[5]。旱柳根系Cd含量遠(yuǎn)大于新枝，根系細(xì)胞壁中積累了較大比例的Cd。大量研究表明：根系細(xì)胞壁在根系積累重金屬的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12-13,23-24,37]。細(xì)胞壁對(duì)金屬離子的結(jié)合能力高度依賴(lài)于基質(zhì)多糖的含量和結(jié)構(gòu)，在重金屬脅迫下，植物可通過(guò)主動(dòng)調(diào)節(jié)細(xì)胞壁多糖重塑，進(jìn)而改變細(xì)胞壁結(jié)合金屬陽(yáng)離子的能力[11]。Cd脅迫下旱柳根系細(xì)胞壁的果膠含量和PME活性顯著提高。果膠結(jié)合Cd的能力取決于果膠的含量和甲酯化程度[11,38]。PME能降低果膠的甲酯化程度，增加羧基的量，從而增加Cd的結(jié)合位點(diǎn)[7]。與Douchiche等[37]和Xu等[28]的結(jié)果類(lèi)似，表明Cd不僅刺激了旱柳根系果膠含量的增加，也提高了帶有更多負(fù)電基團(tuán)的低甲酯化果膠的比例，從而增加了Cd結(jié)合位點(diǎn)。

除果膠外，細(xì)胞壁中的半纖維素作為一種支鏈多糖，含有大量負(fù)電基團(tuán)，對(duì)細(xì)胞壁積累重金屬也有很大的貢獻(xiàn)。Yang等[27]的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞壁半纖維素顯著促進(jìn)擬南芥對(duì)鋁的積累，當(dāng)去除半纖維素，細(xì)胞壁對(duì)鋁的積累量急劇下降。Zhu等[8]發(fā)現(xiàn)擬南芥根系中大多數(shù)Cd固定在HC1中，外源NAA顯著增加了HC1的含量及其對(duì)Cd的結(jié)合能力。Dai等[12]和Xu等[28]均發(fā)現(xiàn)不同植物的細(xì)胞壁半纖維素在重金屬積累過(guò)程中發(fā)揮重要作用，表現(xiàn)為在重金屬脅迫下半纖維素含量提高。與前人的研究一致，一定濃度的Cd處理提高了HC1和HC2的含量。低濃度Cd處理的HC1含量與對(duì)照相比無(wú)顯著差異，HC2的含量卻顯著高于對(duì)照。而高濃度Cd處理的HC1的含量顯著升高，HC2的含量與對(duì)照相比無(wú)顯著差異。半纖維素的結(jié)構(gòu)鏈主要由木聚糖，木葡聚糖和甘露聚糖組成，在雙子葉植物中木聚糖是主要成分[10]。推測(cè)Cd脅迫下半纖維素的合成可能存在對(duì)底物的分配，低濃度Cd處理中HC2對(duì)于結(jié)合Cd發(fā)揮主要作用，細(xì)胞傾向于合成更多的HC2。高濃度Cd處理中HC1發(fā)揮主要作用，因此，更多的底物用于合成HC1，但這需要后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明：旱柳主要通過(guò)根系積累Cd，其中根系細(xì)胞壁多糖在Cd的累積過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在Cd脅迫下，旱柳通過(guò)主動(dòng)調(diào)節(jié)根系細(xì)胞壁多糖的含量和結(jié)構(gòu)的改變(果膠、低甲酯化果膠和半纖維素含量的提高)，提高了細(xì)胞壁中的Cd積累。此外，旱柳具有一定的Cd耐性，但過(guò)量的Cd會(huì)破壞旱柳的氧化還原平衡，引起代謝紊亂和生長(zhǎng)抑制，表現(xiàn)為葉片和根系的氧化脅迫產(chǎn)物增多，抗氧化酶活性和抗氧化劑含量的改變以及生物量的抑制。因此，本研究揭示了旱柳根系細(xì)胞壁多糖對(duì)旱柳富集Cd的重要性，以及高濃度Cd對(duì)旱柳生理過(guò)程的損害。