柴亞茹，丁一娟，周思鈺，楊文靜，閆寶琴，遠(yuǎn)俊虎，錢偉

（西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶 400715）

0 引言

【研究意義】核盤(pán)菌（Sclerotinia sclerotiorum）為隸屬于子囊菌門(mén)、核盤(pán)菌屬的一種植物病原真菌，其寄主廣泛，可以侵染包括油菜、馬鈴薯、棉花、番茄、大豆等多種重要的農(nóng)作物在內(nèi)的400 多種植物[1-3]，造成巨大的作物產(chǎn)量損失。目前對(duì)菌核病的防治主要依靠化學(xué)殺菌劑，但該方法成本高、影響環(huán)境，且易產(chǎn)生耐藥菌株導(dǎo)致防治效果不理想，因此創(chuàng)建高抗材料是菌核病防治的關(guān)鍵。近年來(lái)，寄主誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)（host-induced gene silencing，HIGS）在研究病原菌基因功能及增強(qiáng)寄主抗病性中起著越來(lái)越重要的作用[4]。因此，利用 HIGS 技術(shù)在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中沉默核盤(pán)菌銅鋅超氧化物歧化酶銅伴侶基因（copper chaperone for copper/zinc superoxide dismutase，SsCCS），獲得抗性穩(wěn)定持久的材料，可為油菜等作物的抗菌核病育種提供新方法，并為安全防控菌核病提供重要靶標(biāo)基因?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前創(chuàng)制菌核病抗病材料的方法主要包括以下幾種：一種方法是通過(guò)雜交、回交等傳統(tǒng)選育方式培育抗病品種，另一種方法是通過(guò)在植物體內(nèi)過(guò)表達(dá)抗病相關(guān)基因，從而增強(qiáng)植株的抗病性，以及通過(guò)細(xì)胞工程及誘變育種的方式進(jìn)行抗病品種的培育[5]。但抗病遺傳資源缺乏，以及核盤(pán)菌致病機(jī)理復(fù)雜，相關(guān)的抗病位點(diǎn)開(kāi)發(fā)以及抗病分子機(jī)制的研究受到限制，導(dǎo)致菌核病抗病育種進(jìn)程緩慢。近年來(lái)在真菌、細(xì)菌、病毒、植物、線蟲(chóng)、人中都發(fā)現(xiàn)基因沉默（RNAi）現(xiàn)象[6-8]，RNAi 是由雙鏈RNA（dsRNA）介導(dǎo)的、由特定酶參與的特異性基因沉默，它在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達(dá)。前人研究發(fā)現(xiàn)利用攜帶特定基因片段的不同病毒載體侵染本氏煙，可以導(dǎo)致特定靶基因的沉默，進(jìn)而發(fā)展了病毒介導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）技術(shù)[4]。寄主誘導(dǎo)的基因沉默（host-induced gene silencing，HIGS）技術(shù)是VIGS 的進(jìn)一步發(fā)展[9]，HIGS 通常以病原菌生長(zhǎng)發(fā)育、致病過(guò)程中的關(guān)鍵基因作為靶標(biāo)基因，通過(guò)將靶標(biāo)基因的反義發(fā)夾結(jié)構(gòu)或RNAi 結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染到寄主植物，產(chǎn)生靶標(biāo)基因的dsRNA，并經(jīng)植物細(xì)胞本身的Dicer 核酸酶加工形成19—25 nt 的siRNA。在病原菌侵染植物時(shí)，siRNA 通過(guò)囊泡從植物體運(yùn)輸?shù)讲≡蓴_病原菌靶基因的表達(dá)，從而減弱其致病能力，間接增強(qiáng)寄主植物的抗病性[10]。NOWARA 等[11]發(fā)現(xiàn)在大麥中表達(dá)大麥白粉病菌（Blumeria graminis）葡聚糖轉(zhuǎn)移酶效應(yīng)子的RNA 干擾分子會(huì)提高其抗性水平，據(jù)此首次提出了HIGS 的概念。此后，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用在各種作物與多種真菌互作研究中，如小麥葉銹病菌（Puccinia triticina）[12]、禾谷鐮孢（Fusarium graminearum）[13]以及黃萎病菌[14]。最近，有研究人員利用HIGS 技術(shù)在煙草中表達(dá)核盤(pán)菌Sschs的RNAi 結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因T1代煙草的菌核病抗性顯著增強(qiáng)[15]。但是利用HIGS 技術(shù)是否能獲得穩(wěn)定持久可遺傳的菌核病抗性還有待研究，且該技術(shù)在十字花科植物抗菌核病的研究還未見(jiàn)報(bào)道。研究表明，當(dāng)病原菌入侵宿主時(shí)，寄主植物最早啟動(dòng)的免疫防御依賴于活性氧（ROS）迸發(fā)[16]。過(guò)量的ROS 不僅會(huì)對(duì)植物細(xì)胞，也會(huì)對(duì)病原菌造成細(xì)胞膜DNA 及蛋白質(zhì)等的損害[17-18]。超氧化物歧化酶（SOD）是清除活性氧爆發(fā)的第一步，將歧化為H2O2和氧氣，進(jìn)而生物體將H2O2分解為無(wú)毒的水[19]。SOD 按其結(jié)合的金屬離子，可分為Fe-SOD、Mn-SOD、CuZn-SOD 以及Ni-SOD 4 種[20-21]，其中CuZn-SOD 主要存在于細(xì)胞質(zhì)以及線粒體內(nèi)外膜之間作為氧化物清除劑[22]。相關(guān)研究表明，核盤(pán)菌中編碼CuZn-SOD 的基因突變后，核盤(pán)菌抗氧化能力減弱，致病力顯著下降[19,23]。銅鋅超氧化物歧化酶銅伴侶是目前鑒定的分子量最大的一類銅伴侶蛋白質(zhì)，可通過(guò)N 端結(jié)構(gòu)域傳遞銅離子至CuZn-SOD 的銅離子結(jié)合位點(diǎn)，從而激活CuZn-SOD的酶活性[24-25]。LI 等[26]研究發(fā)現(xiàn)在稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）侵染條件下，水稻銅鋅超氧化物歧化酶銅伴侶CCSD缺失突變體導(dǎo)致CuZn-SOD酶活性顯著降低，水稻抗病性減弱。因此，銅鋅超氧化物歧化酶銅伴侶基因?qū)τ谏矬wCuZn-SOD 的酶活性激活及ROS 的清除能力至關(guān)重要?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】盡管現(xiàn)有菌核病抗病育種取得了一定進(jìn)展，但嚴(yán)重依賴抗病材料及抗病基因的挖掘，進(jìn)展緩慢，因而亟需發(fā)展新的抗病育種技術(shù)。本研究選擇核盤(pán)菌銅鋅超氧化物歧化酶銅伴侶基因SsCCS作為靶基因，構(gòu)建該基因的HIGS 載體并轉(zhuǎn)化擬南芥，通過(guò)菌核病抗性鑒定，驗(yàn)證HIGS 技術(shù)應(yīng)用于寄主菌核病抗性改良的可能性?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用HIGS技術(shù)在擬南芥中表達(dá)特異靶向核盤(pán)菌SsCCS的dsRNA，創(chuàng)建持久高抗菌核病的轉(zhuǎn)基因株系，為今后將HIGS 技術(shù)應(yīng)用到油菜等十字花科植物的菌核病抗性育種中打下基礎(chǔ)，并為安全防治菌核病提供靶基因。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017 年10 月至2019 年3 月在西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院完成。

1.1 供試材料

本試驗(yàn)所用擬南芥哥倫比亞生態(tài)野生型Col-0，核盤(pán)菌菌株1980 均由重慶市油菜工程技術(shù)研究中心提供?；虺聊磉_(dá)載體pCIT 由西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院余洋老師惠贈(zèng)，擬南芥紅光表達(dá)載體pBin35SRed3 由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)張椿雨教授惠贈(zèng)[27]，用于基因克隆的T 載體p GEM?-T Easy Vector 購(gòu)于Promega 公司（美國(guó)）。大腸桿菌菌株DH5α，農(nóng)桿菌菌株GV3101 購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司（TransGen Biotech）。

核盤(pán)菌菌株1980 保存于馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）中。

1.2 生物信息學(xué)分析

從核盤(pán)菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.broadinstitute org/ annotation/genome/Scleraotinia sclerotiorum/Uenomeslndex html）提取SsCCS的編碼序列及氨基酸序列，通過(guò)ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)SsCCS 蛋白的分子量及等電點(diǎn)（PI），將其氨基酸序列在NCBI 上進(jìn)行同源比對(duì)（Blast），利用 MEGA6.0構(gòu)建SsCCS的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3 HIGS 沉默表達(dá)載體的構(gòu)建

利用BioEdit 軟件將SsCCS與核盤(pán)菌以及擬南芥基因組序列進(jìn)行比對(duì)，選擇SsCCS的特異片段作為RNA 干擾片段，利用Primer Premier 5 設(shè)計(jì)特異引物，并引入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)（表1）。以核盤(pán)菌野生菌株1980 的cDNA 為模板，以SsCCS-SF/SsCCS-SR 及SsCCS-AF/SsCCS-AR 分別進(jìn)行擴(kuò)增，并將膠回收的目的片段連接到pGEMT-Easy 載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，挑選陽(yáng)性單克隆送Invitrogen 公司測(cè)序。提取測(cè)序正確T 克隆質(zhì)粒T-SsCCS-S 及T-SsCCS-A，首先采用限制性內(nèi)切酶EcoRI/EcoRV 雙酶切T-SsCCS-S，將該正向片段連入pCIT，獲得中間載體p-ccs-1。隨后采用PstI/BamHI 雙酶切T-SsCCS-A，將該片段反向連入p-ccs-1，獲得SsCCS的干擾載體p-ccs。隨后，用EcoRI 和XhoI 分別雙酶切p-ccs 及植物轉(zhuǎn)化載體pBin35SRed3 的質(zhì)粒，將p-ccs 載體中的主體結(jié)構(gòu)“正向序列-內(nèi)含子-反向序列”連接到pBin35SRed3 的CaMV35S 啟動(dòng)子與Nos 終止子之間，獲得沉默SsCCS的HIGS 載體R-ccs。將重組質(zhì)粒R-ccs 轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101，挑選陽(yáng)性單克隆的菌液加入50%的甘油1﹕1 等體積混合于2 mL 離心管中，保存于-80℃。

表1 SsCCS 載體構(gòu)建所用引物序列Table 1 Sequence information of primers used for vector construction of SsCCS

1.4 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化及鑒定

將擬南芥哥倫比亞生態(tài)型（Col-0）直播于營(yíng)養(yǎng)土中，在22℃，16 h 光照、22℃，8 h 黑暗培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)40 d 左右，去掉已經(jīng)結(jié)莢的和開(kāi)放的花朵后，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花序法[28]將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化擬南芥。收獲侵染后的T0代擬南芥種子，選擇發(fā)紅色熒光種子進(jìn)行播種，獲得T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥。選取轉(zhuǎn)基因擬南芥幼葉于研缽中，用液氮進(jìn)行研磨，用CTAB 法提取DNA，利用引物RVF/RVR（表1）對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行PCR 鑒定，篩選陽(yáng)性植株。

1.5 菌核病抗性鑒定

在PDA 平板上活化核盤(pán)菌野生型菌株1980，用直徑2 mm 的打孔器取生長(zhǎng)2 d 的邊緣菌絲用于接種。將2 mm 的菌絲塊接種于擬南芥葉片上，帶菌面緊貼葉片。接種后，將接種葉片置于可控溫控濕環(huán)境內(nèi)，溫度設(shè)置為22℃，相對(duì)濕度保持在85%左右。接種24 h 后統(tǒng)計(jì)病斑的長(zhǎng)徑和短徑，利用公式S=π×a×b/4計(jì)算病斑面積（其中a 代表病斑長(zhǎng)軸長(zhǎng)度，b 代表病斑短軸長(zhǎng)度）[29]，并利用SAS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。試驗(yàn)重復(fù)3 次，每次3—5 片葉片。

1.6 H2O2檢測(cè)

聯(lián)苯胺（3,3'-diaminobenz-idine-HCl，DAB）染色檢測(cè)法參照GUAN 等的方法[30]。將接種6、12、24 h后的擬南芥葉片立即置于1 mg·mL-1的DAB 溶液（pH 3.8）中，染色6 h 后于沸騰的95%乙醇中脫色10 min，冷卻后，于無(wú)水乙醇中室溫保存并拍照。

1.7 qRT-PCR

取T3代純合轉(zhuǎn)基因擬南芥接種核盤(pán)菌后6 h 的葉片及病斑組織，采用TRIzol?法提取總RNA，采用Bio RAD 的i ScriptTMcDNA Synthesis Kit 試劑盒將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用Bio RAD 的 i TaqTMUniversal SYBR?Green Supermix 試劑盒，利用引物RT-SsccsF/RT-SsccsR（表1），在CFX96TMReal-Time PCR儀上進(jìn)行熒光定量擴(kuò)增，檢測(cè)SsCCS的表達(dá)情況。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，40 個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本重復(fù)3 次，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因表達(dá)量[31]。

2 結(jié)果

2.1 SsCCS 的生物信息學(xué)分析

核盤(pán)菌中編碼SsCCS的基因編號(hào)為SS1G_00102，該基因全長(zhǎng)為1 010 bp，編碼序列長(zhǎng)759 bp，共編碼253 個(gè)氨基酸，該蛋白分子質(zhì)量為27 176.96 Da，等電點(diǎn)（PI）為5.04。利用MEGA6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1），結(jié)果顯示與SsCCS同源關(guān)系近的基因均為編碼超氧化物歧化酶銅伴侶基因，其中與灰霉病菌（Botrytis cinerea）BcCCS（EDN25358）基因親緣關(guān)系最近，氨基酸同源性達(dá)到87%，與擬南芥AtCCS（AT1G12520.1）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.2 HIGS 沉默表達(dá)載體的構(gòu)建

克隆SsCCS的314 bp 特異片段，構(gòu)建HIGS 沉默表達(dá)載體，載體構(gòu)建示意圖如圖2-A 所示。以野生菌株1980 的cDNA 為模板，分別用特異引物SsCCS-SF/ SsCCS-SR、SsCCS-AF/SsCCS-AR 擴(kuò)增SsCCS的特異干擾片段CCSs 及CCSa，片段大小為314 bp（圖2-B）。將SsCCS的正向和反向特異干擾片段分別連入pCIT載體的內(nèi)含子兩端，采用引物PIF/PIR 對(duì)p-ccs 的重組菌液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示共獲得8 個(gè)片段大小約1 200 bp 的陽(yáng)性克隆（圖2-C），表明SsCCS干擾載體p-ccs構(gòu)建成功。提取該質(zhì)粒，將“CCSs -intron- CCSa”片段插入植物表達(dá)載體pBin35SRed3 的EcoRI 和XhoI 兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，獲得HIGS 載體R-ccs。隨后，采用EcoRI/XhoI 進(jìn)行雙酶切檢測(cè)R-ccs，酶切片段大小約為1 200 bp（圖2-D），表明植物HIGS 沉默表達(dá)載體R-ccs 構(gòu)建成功。將R-ccs 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，采用引物組合RVF/SsCCS-SR 進(jìn)行檢測(cè)（圖2-E），結(jié)果顯示12 個(gè)重組菌液均在314 bp 左右有特異性條帶，表明成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，可用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化。

圖1 SsCCS 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig. 1 The phylogenetic tree of SsCCS

圖2 SsCCS HIGS 載體的構(gòu)建Fig. 2 Construction of HIGS vector of SsCCS

2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選及抗病性鑒定

利用浸花序法轉(zhuǎn)化擬南芥，收獲T0代擬南芥的種子。篩選其中具有紅色熒光的種子，共獲得17 株T1代轉(zhuǎn)基因植株。提取葉片DNA，利用引物RVF/RVR進(jìn)行PCR 檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)17 株T1代轉(zhuǎn)基因植株均在1 200 bp 左右有特異性條帶（圖3），表明17 株均為陽(yáng)性苗。

圖3 T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR 鑒定Fig. 3 PCR identification of transformed A. thaliana lines of T1 generation

表2 轉(zhuǎn)基因擬南芥分離比及接種核盤(pán)菌后病斑統(tǒng)計(jì)Table 2 Segregation and lesion analyses of transgenic and wild type A. thaliana lines after inoculated with S. sclerotiorum

接種核盤(pán)菌24 h 后，發(fā)現(xiàn)T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥單株的病斑面積均小于野生型，其中有4 個(gè)T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的病斑平均面積分別為0.69、0.71、0.89、0.82 cm2，而野生型擬南芥的病斑面積為1.46 cm2（表2）。隨后，收獲T1代的轉(zhuǎn)基因種子，并對(duì)所有種子進(jìn)行篩選，從符合紅色﹕暗色分離比例為3﹕1 的單株 自交種中，隨機(jī)挑選并種植了4 個(gè)T2代株系。對(duì)T2代進(jìn)行菌核病抗性評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，3 個(gè)T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的菌核病抗性顯著強(qiáng)于野生型，其病斑平均面積分別為0.79、0.48、0.55 cm2，野生型病斑面積為1.02 cm2（表2）。從T2代株系中，對(duì)抗性表現(xiàn)穩(wěn)定全部發(fā)紅光的株系繼續(xù)培養(yǎng)至穩(wěn)定純合的T3代，菌核病抗性鑒定顯示，接種24 h 后，3 個(gè)轉(zhuǎn)基因T3株系上的病斑明顯小于野生型，3 個(gè)株系的病斑平均面積為0.26、0.38、0.27 cm2，野生型病斑面積為0.69 cm2，轉(zhuǎn)基因株系相對(duì)于野生型擬南芥病斑面積減小約46%—61%（圖4）。該結(jié)果表明，在擬南芥中表達(dá)SsCCS的dsRNA 能顯著增強(qiáng)擬南芥的菌核病抗性。

圖4 T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥株系抗病性鑒定Fig. 4 Resistance identification of T3 generation transgenic A. thaliana lines

圖5 擬南芥野生型及轉(zhuǎn)基因株系的DAB 染色Fig. 5 DAB staining assay of wild type and transgenic A. thaliana lines

2.4 H2O2的積累情況

利用DAB 染色檢測(cè)了HIGS-CCS轉(zhuǎn)基因擬南芥在接種核盤(pán)菌過(guò)程中H2O2的積累情況，以此來(lái)反應(yīng)在侵染過(guò)程中植株的ROS 發(fā)生水平。結(jié)果顯示，在接種后6、12、24 h，轉(zhuǎn)基因株系的染色區(qū)域明顯小于野生型，在6 h 時(shí)已表現(xiàn)出明顯差異（圖5）。該結(jié)果表明， 核盤(pán)菌在侵染轉(zhuǎn)基因擬南芥過(guò)程中的致病力顯著小于侵染野生型，側(cè)面反映HIGS-CCS轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗性增強(qiáng)。

2.5 SsCCS 表達(dá)量分析

提取轉(zhuǎn)基因株系及野生型接種核盤(pán)菌6 h 后的葉片及病斑組織的RNA，通過(guò)qRT-PCR 分析核盤(pán)菌在侵染轉(zhuǎn)基因擬南芥過(guò)程中相對(duì)于侵染野生型核盤(pán)菌SsCCS的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)核盤(pán)菌在侵染轉(zhuǎn)基因擬南芥過(guò)程中，SsCCS的表達(dá)量相對(duì)于侵染野生型擬南芥下降了98%（圖6）。該結(jié)果表明，在核盤(pán)菌侵染過(guò)程中，HIGS-CCS轉(zhuǎn)基因擬南芥成功干擾了核盤(pán)菌SsCCS的表達(dá)。

圖6 核盤(pán)菌菌株1980 接種野生型及轉(zhuǎn)基因擬南芥株系6 h后SsCCS 的相對(duì)表達(dá)量Fig. 6 Relative expression level of SsCCS at 6 h after the wild type and transgenic A. thaliana lines inoculated with S. sclerotiorum strain 1980

3 討論

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究證明HIGS 技術(shù)是一種控制病原菌的有效方法，已在多種作物中獲得了HIGS轉(zhuǎn)基因材料，增強(qiáng)了病原菌抗性，比如小麥-條銹菌[32]、棉花-黃萎病菌[33]、番茄-灰霉病菌[34]等。小RNAs 從植物細(xì)胞進(jìn)入真菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移途徑尚不十分明確，目前大多數(shù)的HIGS 研究都集中在專性營(yíng)養(yǎng)型寄生真菌中，真菌與寄主互作過(guò)程中伴隨小RNA 的交換[35]。核盤(pán)菌長(zhǎng)久以來(lái)被認(rèn)為是一種典型腐生性真菌，通過(guò)殺死寄主植物細(xì)胞，從死亡組織中獲得營(yíng)養(yǎng)[36]。但最近的研究發(fā)現(xiàn)核盤(pán)菌與植物的互作非常復(fù)雜，在其侵染早期存在一段短暫的活體營(yíng)養(yǎng)時(shí)期[37]，這為利用HIGS 技術(shù)防治核盤(pán)菌帶來(lái)了可能。ANDRADE 等嘗試在煙草中沉默核盤(pán)菌Sschs，發(fā)現(xiàn)T1代轉(zhuǎn)基因煙草的菌核病抗性顯著增強(qiáng)[15]，但是由于HIGS 受到宿主植物與病原菌的限制，不同病原菌的致病基因或寄主植物的選擇可能對(duì)于沉默效果有較大的影響[38-39]。本研究中，將含有核盤(pán)菌SsCCS的RNAi 結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)入擬南芥中，獲得了HIGS-CCS轉(zhuǎn)基因擬南芥，抗性鑒定發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的T1、T2及T3代的菌核病抗性相對(duì)野生型都顯著增強(qiáng)，證明獲得了持久穩(wěn)定抗菌核病的擬南芥。

CuZn-SOD 在生物體的ROS 平衡調(diào)控中起著重要的作用，核盤(pán)菌中敲除CuZn-SOD 后，致病力顯著下降[23]，而CCS對(duì)于CuZn-SOD 功能的正常行使起到關(guān)鍵作用[40]。有研究顯示在灰霉病菌中沉默BcCCS，灰霉菌的致病力減弱[41]。本研究通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)發(fā)現(xiàn)，SsCCS與灰霉病菌BcCCS親緣關(guān)系最近，因此推測(cè)SsCCS在核盤(pán)菌與宿主植物互作過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，干擾該基因的表達(dá)可能會(huì)增強(qiáng)寄主的抗病能力。而HIGS-CCS轉(zhuǎn)基因擬南芥中的SsCCS表達(dá)受到顯著抑制，核盤(pán)菌在侵染轉(zhuǎn)基因擬南芥過(guò)程中的致病力顯著下降，證實(shí)了SsCCS是核盤(pán)菌致病力的關(guān)鍵基因。

擬南芥是分子生物學(xué)研究的模式植物，與油菜、蘿卜、卷心菜等農(nóng)作物同屬于十字花科，具有較近的親緣關(guān)系[42]。在擬南芥中進(jìn)行SsCCS的HIGS，成功獲得了菌核病抗性顯著增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株，研究結(jié)果為HIGS 在油菜等十字花科植物的菌核病抗病育種中的應(yīng)用提供了支撐，同時(shí)有助于利用HIGS 技術(shù)快速挖掘核盤(pán)菌致病相關(guān)基因，促進(jìn)核盤(pán)菌致病機(jī)理的研究。

4 結(jié)論

利用HIGS 方法可有效干擾核盤(pán)菌SsCCS的表達(dá)，并能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的菌核病抗性，研究結(jié)果為安全防控菌核病提供了一個(gè)重要的靶標(biāo)基因。