馬敬雪　黃丹　鞏奇明　盧俊玲　尤燕舞

【摘要】 目的 探討趨化因子fractalkine（FKN）對(duì)小鼠足細(xì)胞炎癥因子分泌的影響及機(jī)制、對(duì)nephrin表達(dá)的影響及其在足細(xì)胞凋亡中的可能機(jī)制。

方法 培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞，將細(xì)胞分為：①對(duì)照組;②rmFKN干預(yù)組;③rmFKN+SC514（抑制劑）組。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組中足細(xì)胞的凋亡率。用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)足細(xì)胞nephrin、白介素6（IL6）、腫瘤壞死因子α（TNFα）、細(xì)胞核內(nèi)核因子κB（NFκB）、Bax、Bcl2及細(xì)胞色素C（Cytochrome C，Cytc）蛋白表達(dá)水平。

結(jié)果 凋亡結(jié)果顯示，各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，與對(duì)照組相比，rmFKN+SC514組凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），rmFKN 組凋亡率升高，而rmFKN組與rmFKN+SC514組相比凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，rmFKN組nephrin的表達(dá)水平下調(diào)，rmFKN 組IL6、TNFα分泌增多，NFκB p65、Bax、Cytc表達(dá)水平上調(diào)，Bcl2表達(dá)水平下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與rmFKN組相比，rmFKN+SC514組IL6、TNFα蛋白分泌減少，NFκB p65表達(dá)水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

結(jié)論 ①rmFKN可抑制足細(xì)胞nephrin的表達(dá);②rmFKN可以促進(jìn)足細(xì)胞IL6、TNFα的產(chǎn)生和分泌，NFκB的活化可能是其潛在機(jī)制;③rmFKN促進(jìn)足細(xì)胞的凋亡，其作用可能通過NFκB信號(hào)通路調(diào)節(jié)Cytc的表達(dá)及Bax/Bcl2平衡有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 rmFKN;核因子κB;腫瘤壞死因子α;白介素6;nephrin;凋亡

中圖分類號(hào)：R692 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.3969/j.issn.10031383.2020.01.004

【Abstract】 Objective To investigate the effect of fractalkine（FKN） on the secretion of inflammatory factors，the expression of nephrin and the possible mechanism of apoptosis in podocyte.

Methods Podocytes were cultured and randomly divided into three groups：control group，rmFKN group and rmFKN+SC514 （Inhibitor of NFκB p65） group.Podocyte apoptosis was detected by flow cytometry.The expression of nephrin，interleukin6（IL6），tumor necrosis factorα（TNFα），nuclear kernel factorκB（NFκB），Bax，Bcl2，and Cytc were detected by western blot.

Results The results of flow cytometry showed that there was no significant difference in the apoptosis rate of rmFKN+SC514 group compared with the control group （P>0.05），and the apoptosis rate of rmFKN group was higher than that of rmFKN + SC514 group （P<0.05）.Western blot showed that compared with the control group，the expression level of nephrin decreased，the secretion of IL6 and TNFα increased，the expression level of NFκB p65，Bax and Cytc increased，and the expression level of Bcl2 decreased in rmFKN group （P<0.05）.Compared with the rmFKN group，the secretion of IL6，TNFα and the expression level of NFκ B p65 were decreased in the rmFKN+SC514 group （P<0.05）.

Conclusion ①FKN can inhibit the expression of nephrin;②FKN can promote the production and secretion of IL6 and TNFα in potocyte，which may be associated with activation of the NFκB signaling pathway;③FKN can promote the apoptosis of podocytes，which may be related to the regulation of Cytc expression and the balance of Bax/Bcl2 by activating NFκB signaling pathway.

【Key words】 fractalkine;NFκB;TNFα;IL6;nephrin; apoptosis

足細(xì)胞是高度分化的腎小球臟層上皮細(xì)胞，包裹在腎小球毛細(xì)血管周圍，對(duì)維持腎小球的結(jié)構(gòu)和功能起著重要作用。足細(xì)胞的破壞可能導(dǎo)致腎小球?yàn)V過功能受損[1]。研究表明足細(xì)胞的損傷或丟失是各種形式的腎小球疾病和慢性腎臟疾病最常見的早期臨床表現(xiàn)[2]，所以深入研究足細(xì)胞損傷及凋亡機(jī)制對(duì)腎小球疾病的預(yù)防、診斷與治療十分重要。趨化因子fractalkine（FKN），又被稱作CX3CL1，是CX3C類趨化因子超家族中唯一的成員[3]。FKN在動(dòng)脈粥樣硬化[4]、腫瘤[5～6]、腎臟疾病包括狼瘡性腎炎[7～8]等多種疾病中發(fā)揮著重要作用，但是FKN在足細(xì)胞損傷及凋亡中的作用尚不清楚。該研究以小鼠足細(xì)胞為研究對(duì)象，探討FKN對(duì)足細(xì)胞核因子κB（NFκB）活化、其特異性蛋白nephrin表達(dá)及凋亡的影響，以初步證實(shí)FKN在足細(xì)胞損傷及凋亡中的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠足細(xì)胞株（MPC5）購(gòu)于上海復(fù)旦大學(xué)細(xì)胞中心，凍存于右江民族醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco生物公司），重組小鼠rmFKN（R&D，美國(guó)），SC514（Selleck，美國(guó)），凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自于美國(guó)BD公司，兔抗IL6、TNFα一抗兔抗（Santa Cruz Biotechnology，美國(guó)），NFκB p65一抗（Cell Signaling Technology，美國(guó)），兔抗nephrin一抗（Abcam，美國(guó)），鼠抗GAPDH一抗（Proteintech，美國(guó)），兔抗Bax一抗、兔抗Bcl2一抗購(gòu)自于Abcame公司;鼠抗Cytc一抗購(gòu)于碧云天。羊抗鼠、羊抗兔IgG 抗體（二抗）（碧云天，中國(guó)）。蛋白酶抑制劑混合物（康為世紀(jì)，北京），BCA蛋白定量試劑盒（碧云天，中國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 足細(xì)胞培養(yǎng)

足細(xì)胞按照參考文獻(xiàn)培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化[9]。細(xì)胞在10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，于37℃，5% CO2環(huán)境中傳代培養(yǎng)。2～3天換液1次。細(xì)胞融合至80%左右消化傳代，14天左右分化成熟后用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 rmFKN處理及分組

細(xì)胞傳代后，以1×105個(gè)細(xì)胞種于6孔板中，待各組細(xì)胞融合至60%～70%后用含1%胎牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)液同步化24 h將細(xì)胞分為3組，每組3個(gè)復(fù)孔。①對(duì)照組：足細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。②rmFKN組：在足細(xì)胞培養(yǎng)液中加入rmFKN，終濃度為10 ng/mL[10]，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。③rmFKN+SC514組：在足細(xì)胞培養(yǎng)液中加入SC514，終濃度為30 μM[11]，作用1 h后加入rmFKN，終濃度為10 ng/mL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)

干預(yù)足細(xì)胞適當(dāng)時(shí)間后收集各組足細(xì)胞，提取總蛋白。以二喹啉甲酸法測(cè)定蛋白濃度，取30～50 μg蛋白加入5×SDS上樣緩沖液煮沸變性后，于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，300 mA恒流濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉液室溫封閉1 h，分別加入一抗稀釋液稀釋的nephrin（1∶500）、NFκB p65（1∶500）、IL6（1∶500）、TNFα（1∶500）、Bax（1∶500）、Bcl2（1∶500）、Cytc（1∶500）、GAPDH（1∶2000）抗體，4℃孵育過夜，洗滌3次，加入相應(yīng)的抗兔或鼠IgGHRP二抗，室溫孵育1 h，洗滌3次，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）顯影，利用Image J軟件進(jìn)行半定量分析，以目的條帶與同個(gè)樣品GAPDH灰度值的比值表示相對(duì)光密度值。重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

足細(xì)胞按照前面分組培養(yǎng)48 h后收集各孔上清液于離心管中備用，然后再將各組細(xì)胞用4℃ PBS 清洗 2 次，胰酶消化后與前述上清液共同制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，取 100 μL 細(xì)胞懸液加入 5 μL AnnexinVFITC 和 5 μL PI 溶液混勻，室溫避光孵育 15 min，加入 400 μL PBS，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)。服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間采用單因素方差分析。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3次。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 rmFKN對(duì)各組足細(xì)胞nephrin蛋白表達(dá)的影響

用rmFKN干預(yù)足細(xì)胞后，用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞nephrin表達(dá)水平。結(jié)果表明，rmFKN可誘導(dǎo)足細(xì)胞的nephrin表達(dá)下調(diào)，nephrin與內(nèi)參GAPDH灰度值之比（0.89±0.04）與正常對(duì)照組的灰度值之比（1.44±0.02）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖 1。

2.2 Western blot檢測(cè)各組足細(xì)胞IL6、TNFα的表達(dá)

用rmFKN干預(yù)足細(xì)胞后，用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞IL6、TNFα蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果表明，rmFKN可誘導(dǎo)足細(xì)胞中的IL6、TNFα表達(dá)上調(diào)，rmFKN 組、對(duì)照組IL6與內(nèi)參GAPDH的灰度值之比分別為（0.85±0.04）、（0.42±0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;rmFKN 組、對(duì)照組TNFα與內(nèi)參GAPDH的灰度值之比分別為分別為（0.95±0.04）、（0.49±0.03），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。然而，rmFKN+SC514組IL6、TNFα表達(dá)下調(diào)，灰度值之比分別為（0.46±0.05）、（0.51±0.04），與rmFKN組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖2。

2.3 Western blot檢測(cè)各組足細(xì)胞核內(nèi)NFκB p65水平

Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，rmFKN可誘導(dǎo)足細(xì)胞NFκB p65表達(dá)上調(diào)，NFκB p65與內(nèi)參GAPDH的灰度值之比（0.90±0.03），與對(duì)照組（0.52±0.01）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。然而， rmFKN+SC514 組NFκB p65（0.60±0.03）的表達(dá)下調(diào)，與rmFKN組灰度值之比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖 3。

2.4 FKN通過活化NFκB促進(jìn)足細(xì)胞凋亡

凋亡結(jié)果顯示，各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，rmFKN+SC514組的凋亡率（2.76±0.09）%與對(duì)照組（2.80±0.13）%比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。而rmFKN 組凋亡率為（6.75±0.28）%，與對(duì)照組及rmFKN +SC514組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖 4。

2.5 rmFKN對(duì)足細(xì)胞Cytc、Bax及Bcl2表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)顯示，rmFKN干預(yù)足細(xì)胞后，rmFKN組Cytc及Bax表達(dá)上調(diào)，與內(nèi)參GAPDH的灰度值之比分別為（0.71±0.05）及（0.99±0.01），與正常對(duì)照組（0.23±0.03）及（0.37±0.01）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。然而rmFKN組的Bcl2表達(dá)下調(diào)，與內(nèi)參GAPDH的灰度值之比為（0.24±0.00），與正常對(duì)照組（1.01±0.02）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。對(duì)照組與rmFKN+SC514組相比，Cytc、Bax及Bcl2表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖 5。

3 討論

足細(xì)胞是腎小球的特化上皮細(xì)胞，已知是腎小球疾病損傷的關(guān)鍵部位[12]。其數(shù)量減少或功能障礙將導(dǎo)致腎小球?yàn)V過功能損傷和相關(guān)腎臟疾病的發(fā)生。因此，足細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是腎小球疾病發(fā)展的一個(gè)十分重要的早期標(biāo)志。炎癥是機(jī)體對(duì)于損傷因子的自我防御反應(yīng)，其過程包括局部組織變質(zhì)、血管內(nèi)液體成分和細(xì)胞成分滲出以及組織細(xì)胞的增生。其中涉及多種細(xì)胞及因子參與。炎癥過程非常復(fù)雜，在大多數(shù)慢性疾病中起著重要作用，并且對(duì)人體、組織、細(xì)胞帶來巨大損害。研究發(fā)現(xiàn)，各種炎癥因子在足細(xì)胞的聚集是引起足細(xì)胞損傷的重要因素之一[12～15]。

Fractalkine（FKN）是CX3C類趨化因子超家族中唯一的成員，參與了趨化、細(xì)胞黏附、細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)、炎癥免疫應(yīng)答等[16]。近年研究發(fā)現(xiàn)FKN參與了包括腎缺血再灌注損傷、腎間質(zhì)纖維化、新月體腎炎的發(fā)生與發(fā)展[17～18]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)FKN在狼瘡腎炎患者外周血及脂多糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷模型中的表達(dá)明顯增高[7，11]。但是其具體機(jī)制特別是在誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷中的機(jī)制仍不明確。IL6及TNFα是兩種重要的炎癥介質(zhì)。鄭柳穎等[19]研究發(fā)現(xiàn)FKN可以誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞分泌TNFα，從而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，rmFKN刺激足細(xì)胞后明顯上調(diào)IL6及TNFα蛋白的表達(dá)，提示刺激炎癥反應(yīng)可能是FKN促進(jìn)足細(xì)胞損傷的機(jī)制之一。我們課題組最新的研究發(fā)現(xiàn)，利用脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞損傷后FKN表達(dá)明顯升高，且與足細(xì)胞增殖、凋亡等密切相關(guān)[20]。但是FKN參與足細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究。在本實(shí)驗(yàn)中我們通過使用rmFKN干預(yù)足細(xì)胞后，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞的凋亡率明顯升高。這說明FKN可能在足細(xì)胞中發(fā)揮著促進(jìn)凋亡并導(dǎo)致腎小球疾病發(fā)生的生物學(xué)活性。

為了進(jìn)一步揭示rmFKN誘導(dǎo)IL6及TNFα分泌的機(jī)制，我們把目標(biāo)聚焦到NFκB。NFκB在靜息狀態(tài)下以無活性的形式存在于胞漿中，當(dāng)受到外界刺激時(shí)磷酸化的NFκB轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核并誘發(fā)多種生物學(xué)反應(yīng)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，rmFKN可以激活NFκB并促進(jìn)NFκB p65的核轉(zhuǎn)移。NFκB與IL6及TNFα等炎癥因子的產(chǎn)生與分泌關(guān)系密切。既往研究發(fā)現(xiàn)高糖、脂多糖等可以激活NFκB后上調(diào)IL6及TNFα的表達(dá)[22～23]。我們使用NFκB的抑制劑SC514預(yù)處理足細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SC514預(yù)處理明顯抑制rmFKN誘導(dǎo)的IL6及TNFα產(chǎn)生。此外，SC514與rmFKN共同孵育足細(xì)胞后，其凋亡率明顯下降，表明rmFKN可能通過活化NFκB通路促進(jìn)足細(xì)胞炎癥反應(yīng)及凋亡。

Nephrin是定位于裂孔膜的足細(xì)胞特異性分子。多項(xiàng)研究表明nephrin在多種原發(fā)性和繼發(fā)性腎小球疾病中表達(dá)降低或分布異常，進(jìn)而導(dǎo)致腎小球?yàn)V過功能改變而出現(xiàn)蛋白尿[24～25]。FKN是否會(huì)影響nephrin的表達(dá)，至今未見報(bào)道。在本研究中，我們用rmFKN刺激足細(xì)胞后進(jìn)一步觀察nephrin表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，rmFKN能抑制nephrin的表達(dá)。這可能是FKN參與足細(xì)胞損傷的機(jī)制之一。

細(xì)胞凋亡受多種途徑調(diào)控，其中線粒體途徑是調(diào)控凋亡的重要途徑之一。 Cytc是氧化呼吸鏈中基本成分之一，在線粒體凋亡途徑中起著至關(guān)重要的作用[26]。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激后，由線粒體釋放到胞質(zhì)中的Cytc可以介導(dǎo)Caspase的激活，進(jìn)而發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與凋亡的發(fā)生[27]。有研究表明，Bax/Bcl2比例增加可以導(dǎo)致Cytc從線粒體釋放到細(xì)胞基質(zhì)中[28]，Bcl2家族蛋白包括促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl2位于線粒體外膜[29]，這些蛋白的動(dòng)態(tài)平衡決定著細(xì)胞生存[30]。為了探究Cytc及Bax/Bcl2平衡的變化是否參與了FKN介導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡，在我們的研究中，用rmFKN干預(yù)足細(xì)胞后，用Western blot檢測(cè)了Cytc的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rmFKN組中Cytc及Bax的表達(dá)量明顯上調(diào)，Bcl2的表達(dá)量明顯下調(diào)，Bax/Bcl2的比例升高，說明FKN介導(dǎo)足細(xì)胞凋亡可能與Cytc及Bax/Bcl2平衡變化相關(guān)。鑒于前面FKN與NFκB之間的相互關(guān)系在足細(xì)胞凋亡中的作用，我們進(jìn)一步驗(yàn)證了NFκB與Cytc、Bax及Bcl2之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，用rmFKN與SC415共同孵育足細(xì)胞后Cytc及Bax表達(dá)水平明顯下調(diào)，Bcl2的表達(dá)水平明顯上調(diào)，Bax/Bcl2的比例降低。綜上所述，F(xiàn)KN可能是通過NFκB信號(hào)通路調(diào)節(jié)Cytc的表達(dá)及Bax/Bcl2平衡進(jìn)而參與足細(xì)胞凋亡的調(diào)控。

總之，本研究證實(shí)FKN可以抑制足細(xì)胞nephrin蛋白的表達(dá)，可能通過激活NFκB信號(hào)通路參與足細(xì)胞凋亡的過程，并初步揭示了FKN在調(diào)控足細(xì)胞炎癥反應(yīng)及凋亡中的作用，對(duì)于更深入地了解FKN在足細(xì)胞損傷及凋亡中的機(jī)制有著重要意義。通過抑制FKN/NFκB信號(hào)通路的激活，可以減輕炎癥反應(yīng)，抑制足細(xì)胞的凋亡，為由足細(xì)胞功能障礙導(dǎo)致的疾病的防治提供新的干預(yù)靶點(diǎn)。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2019-11-16 修回日期：2019-12-31）

（編輯：王琳葵 梁明佩）