產(chǎn)L-蛋氨酸基因工程菌株的構(gòu)建

湯玥 何浩波 何凱 陳馨茹 胡翠英 姚雪梅 李良智

摘要：以野生型蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus）EN34為出發(fā)菌株，增強胱硫醚γ-合成酶基因（metI）表達，敲除或弱化腺苷蛋氨酸合成酶的編碼基因metK，分析這2個基因的改變對蛋氨酸產(chǎn)量的影響。從枯草芽孢桿菌基因組中擴增P43強啟動子，連接到pEB03質(zhì)粒，利用重組連接的方法，將metI從BacilluscereusEN34[JP2]擴增重組連接到質(zhì)粒，構(gòu)建成pEB03-P43-SD-metI，通過電擊轉(zhuǎn)化到BacilluscereusEN34，獲得BacilluscereusEN34（pEB03-P43-SD-metI）菌株。通過BacilluscereusEN34擴增metK基因，提取質(zhì)粒pKVM1以及重組連接等方法，構(gòu)建出pKVM1：：metK′敲除質(zhì)粒，[JP2]將質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到BacilluscereusEN34中進行metK交換，再篩選出單交換成功的菌株，最后獲得metK弱化成功BacilluscereusEN34Δ（metK）菌株。經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基硫源優(yōu)化分析得出，單獨增強metI表達不能提高蛋氨酸產(chǎn)量，產(chǎn)量與出發(fā)菌株基本一致;改變metK基因，能提高蛋氨酸產(chǎn)量，但不能完全刪除metK基因，否則將導(dǎo)致細胞死亡。硫源采用200μL/L甲基硫醇鈉和二甲基硫醚的混合物（體積比19∶1）、15g/L的Na2SO4，二者結(jié)合，BacilluscereusEN34Δ（metK）菌株蛋氨酸產(chǎn)量為440.66mg/L，是出發(fā)菌株的20倍。本研究為芽孢桿菌工程菌的構(gòu)建了提供一定的技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：L-蛋氨酸;基因工程;芽孢桿菌;metI基因;蛋氨酸產(chǎn)量

中圖分類號：S188文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2020）22-0037-07

作者簡介：湯玥（1999—），女，江蘇揚州人，主要從事發(fā)酵工程方面的研究。E-mail：1430701525@qq.com。

通信作者：胡翠英，碩士，高級實驗師，主要從事發(fā)酵工程方面的研究。E-mail：13151170848@163.com。

蛋氨酸作為必需氨基酸之一，是動物飼料中必不可少的添加劑。產(chǎn)乳牛食用保護性蛋氨酸[1-2]，可以改善肉牛瘤胃內(nèi)環(huán)境，提高產(chǎn)奶量[3-4];喂食產(chǎn)蛋雞或肉仔雞保護性蛋氨酸能提高產(chǎn)蛋能力和肉質(zhì)[5-6];長期添加OH-蛋氨酸能改善豬肉嫩度[7]?，F(xiàn)有全球制備蛋氨酸的方法主要是化學(xué)法[8]，發(fā)酵法制備蛋氨酸相對安全，但產(chǎn)量較低[9-11]。目前，筆者所在實驗室已篩選到1株蠟樣芽孢桿菌（BacilluscereusEN34），但由于代謝通路中復(fù)雜的調(diào)控機制，蛋氨酸產(chǎn)量難以提高。胱硫醚γ-合成酶是由metI基因（早期稱yjcI基因）編碼，它有2個功能[12-14]，一是為硫酸鹽存在時，催化H2S與琥珀酰高絲氨酸反應(yīng)形成L-高半胱氨酸;二是催化O-琥珀酰高絲氨酸生成胱硫醚。通過加強metI基因的表達，促進胞外S元素的消化吸收，可以提高蛋氨酸產(chǎn)量。S-腺苷甲硫氨酸（SAM）合成酶（由metK基因編碼）催化蛋氨酸變成SAM[15-16]，是蛋氨酸重要代謝途徑，阻斷或減弱此途徑，理想狀態(tài)下能有效截留L-蛋氨酸，從而提高蛋氨酸產(chǎn)量。目前，針對蠟樣芽孢桿菌這2個基因的改變研究較少，鑒于此，本研究以Bacillussp.EN34為出發(fā)菌株，通過基因工程的方法，增強胱硫醚γ-合成酶的表達量以及減弱或阻斷SAM合成酶，以提高蛋氨酸產(chǎn)量。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒蠟樣芽孢桿菌EN34（BacilluscereusEN34）為筆者所在實驗室篩選保存菌株。質(zhì)粒pEB03、pKVM1，以及感受態(tài)細胞S17-1均為筆者所在實驗室保存。

1.1.2主要試劑和儀器質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA產(chǎn)物純化試劑盒、基因組DNA小量抽提試劑盒（離心柱式）等均購自天根生化科技（北京）有限公司;DNAMarker250bpⅠ、Ⅱ、Ⅲ均購自上海捷瑞生物工程有限公司;EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;T4連接酶購自基因生物技術(shù)國際貿(mào)易（上海）有限公司;重組酶ClonExpressⅡ購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;氯霉素、氨芐青霉素、紅霉素等抗生素均購自生工生物工程（上海）股份有限公司，使用濃度分別為25、100、10μg/mL。氨基酸含量分析所用試劑、培養(yǎng)基成分均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。主要儀器有電泳儀（Subcell德國Eppendorf公司），凝膠成像分析儀（GelDocXR+美國Bio-Rad公司），全波長紫外分光光度計（NanoDrop2000美國ThermoElectron公司），細胞電穿孔儀（ECM630美國BTX公司），氨基酸分析儀（A300德國MembraPure公司），聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增儀（5332德國Eppendorf公司）等。

1.1.3培養(yǎng)基[JP2]LB培養(yǎng)基（1L）：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，pH值為7.0;種子液（1L）：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，pH值為7.2;發(fā)酵培養(yǎng)基（1L）：葡萄糖110g，尿素8g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.2g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.2g，MnSO4·H2O02g，（NH4）2SO42g，生物素5μg/100mL，硫胺素200μg/100mL，Na2SO415g，pH值為6.5。

1.2PCR引物設(shè)計

利用KEGGPathway網(wǎng)站與MEGA5分析metK和metI基因保守序列，利用NCBI數(shù)據(jù)庫設(shè)置3對引物（metIF/R、metK[STBX]1[STBZ]F/R、metK[STBX]2[STBZ]F/R），用于擴增EN34菌株相應(yīng)的基因，然后測序。根據(jù)測序結(jié)果，設(shè)置引物metI-F（含EcoRⅠ與P43部分序列）、metI-R（含BamHⅠ與部分pEB03上面的序列）、metKUF（含pKVM1質(zhì)粒上部分序列、EcoRⅠ序列）、metKUR（含metK下游部分序列）、metKDF（含metK前面部分序列）、metKDR（含pKVM1質(zhì)粒上部分序列、EcoRⅠ序列）。P43強啟動子來源于枯草芽孢桿菌，依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫，設(shè)置P43引物P43F（含HindⅢ序列）與P43R（含EcoRⅠ和SD序列）。擴增基因的引物名稱和具體引物序列見表1。

1.3metI基因加強表達

metI基因加強表達的操作流程如圖1所示。（1）獲得metI擴增產(chǎn)物。接種EN34菌株于種子液，30℃培養(yǎng)過夜，用液氮碾磨菌體，提取總DNA。用metIF/R引物擴增metI基因并測序。（2）構(gòu)建pEB03+P43+SD質(zhì)粒。獲取枯草芽孢桿菌基因組，用P43F/R引物（帶SD序列）擴增P43強啟動子，獲得P43-SD產(chǎn)物。用EcoRⅠ與HindⅢ雙酶切pEB03質(zhì)粒，連接P43-SD。轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物到S17-1感受態(tài)細胞，挑取轉(zhuǎn)化子，用引物P43F與P43R驗證，獲得含pEB03-P43-SD質(zhì)粒的S17-1。（3）pEB03-P43-SD-metI表達質(zhì)粒的構(gòu)建。用BamHⅠ酶切pEB03-P43-SD質(zhì)粒，將酶切產(chǎn)物用Exnase酶重組連接metI基因擴增產(chǎn)物（用metI-F/R擴增）。重組連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到S17-1感受態(tài)細胞，挑取轉(zhuǎn)化子，利用metI-F/R驗證metI基因序列，獲得含pEB03-P43-SD-metI質(zhì)粒S17-1細胞。（4）電擊轉(zhuǎn)化與驗證。將pEB03-P43-SD-metI質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化到Bacillussp.EN34感受態(tài)細胞中[17]。電擊轉(zhuǎn)化條件：電容25μF，電阻200Ω，脈沖電壓2500V/cm，約4.5ms/次脈沖。向電擊液中加入LB培養(yǎng)基，30℃靜置2h，涂布LB平板（含氯霉素），30℃培養(yǎng)24～36h;[JP2]用引物P43F/R驗證是否有P43強啟動子。將獲得的菌株命名為BacilluscereusEN34pEB03-P43-SD-metI。

1.4metK基因敲除

metK基因敲除流程見圖2。（1）擴增EN34菌株中metK。因metK較長，分成2部分擴增，中間重疊。利用引物metK1F/R、metK2F/R擴增metK基因，測序。（2）分別擴增metK上下游部分序列，如圖2中metKU（格子）與metKD（點）片段，引物為metKUF/R、metKDF/R。（3）pKVM1：：metK′的構(gòu)建。重組連接pKVM1的EcoRⅠ酶切產(chǎn)物與metK上下游部分序列。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到S17-1感受態(tài)細胞中。挑取在氨芐LB平板上長出的菌落。以metKUF/R為引物驗證是否含有metK′基因。（4）pKVM1：：metK′質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化EN34菌株。方法同“1.3”節(jié)。涂布平板[含安芐（Amp）、異丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）];30℃培養(yǎng)24～36h;挑出藍色菌株到新的LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)。（5）單交換轉(zhuǎn)化子。將培養(yǎng)液接種至LB培養(yǎng)基（含Amp、SAM、IPTG和X-gal）中，30℃培養(yǎng)6～12h，轉(zhuǎn)接至新鮮LB培養(yǎng)基中，42℃培養(yǎng)6～12h，系列稀釋（10-4和10-5）至含葡萄糖的營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基平板（含氨芐、SAM、IPTG和X-gal），42℃過夜培養(yǎng)，挑取轉(zhuǎn)化子，非藍色菌落，在42℃LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h，以metKUF與metKDR為引物驗證單交換轉(zhuǎn)化子。（6）雙交換轉(zhuǎn)化子。挑取轉(zhuǎn)化子至LB液體培養(yǎng)基（含SAM）中，30℃（無抗性）培養(yǎng)并轉(zhuǎn)接兩代，稀釋涂LB平板，30℃培養(yǎng)，挑取轉(zhuǎn)化子，并進行分子驗證（雙交換）。將獲得的菌株命名為BacilluscereusEN34Δ（metK）。

1.5蛋氨酸產(chǎn)量分析

分別接種BacilluscereusEN34、BacilluscereusEN34（pEB03-P43-SD-metI）、BacilluscereusEN34Δ（metK）到種子液，過夜培養(yǎng)，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，向培養(yǎng)BacilluscereusEN34Δ（metK）的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入10mg/LSAM，下同。30℃200r/min搖床培養(yǎng)72h。發(fā)酵液10000r/min離心10min，取400μL上清液樣品，加入100μL10%的磺基水楊酸，2～8℃靜置60min。14500r/min離心5min，用0.22μm針式過濾器過濾，得到的樣品用氨基酸分析儀分析。每種菌平行3次試驗。

1.6優(yōu)化培養(yǎng)基成分

BacilluscereusEN34（pEB03-P43-SD-metI）增加metI表達，metI催化反應(yīng)之一是加速Na2SO4向蛋氨酸的轉(zhuǎn)化，針對此菌的優(yōu)化項是改變培養(yǎng)基中Na2SO4的含量。發(fā)酵培養(yǎng)基中其他成分不變，Na2SO4濃度梯度為5、10、15、20、25、30、35、45g/L。

BacilluscereusEN34Δ（metK）蛋氨酸相對產(chǎn)量較高，對培養(yǎng)條件也做了2種硫源的優(yōu)化。發(fā)酵培養(yǎng)基中其他成分不變，Na2SO4濃度梯度為5、10、15、20、25g/L。向發(fā)酵培養(yǎng)基中梯度添加甲基硫醇鈉和二甲基硫醚的混合物，二者體積比為19∶1，替換發(fā)酵培養(yǎng)基中Na2SO4?；旌衔锏奶砑訚舛确謩e為200、250、300、350、400μL/L。

最后，在最優(yōu)條件下，同時培養(yǎng)3種菌株。

2結(jié)果與分析

2.1質(zhì)粒pEB03-P43-SD-metI構(gòu)建

以BacilluscereusEN34基因組為模板，擴增metI，電泳分析得出，片段大小為1113bp。以枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板，擴增P43強啟動子，經(jīng)10%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明，擴增片段大小約為450bp（含SD序列）。用T4連接酶連接pEB03質(zhì)粒酶切產(chǎn)物與P43-SD，對連接成功的菌株提取質(zhì)粒pEB03-P43-SD，重組連接此質(zhì)粒酶切產(chǎn)物與metI片段，轉(zhuǎn)化S17-1感受態(tài)細胞后挑取菌落，培養(yǎng)，電泳分析結(jié)果（圖3）表明，在選取的13個菌株中，有2個菌株（8號和11號）中獲得metI序列，片段大小與預(yù)期一致，約1000bp。證明質(zhì)粒pEB03-P43-SD-metI構(gòu)建成功。

2.2電擊轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pEB03-P43-SD-metI

將質(zhì)粒pEB03-P43-SD-metI電擊轉(zhuǎn)化到BacilluscereusEN34感受態(tài)細胞后，挑取獲得的菌株，利用PCR法驗證是否有P43強啟動子（大約400bp）。經(jīng)電泳分析，獲得8株轉(zhuǎn)化成功的菌株，為與出發(fā)菌株對照，分析了檢驗轉(zhuǎn)化成功的1株菌株、出發(fā)菌株、質(zhì)粒pEB03-P43-SD-metIP43序列擴增電泳圖，結(jié)果見圖4。由圖4可知，出發(fā)菌株沒有擴增出P43序列，而轉(zhuǎn)化成功的菌株與質(zhì)粒pEB03-P43-SD-metI的P43擴增成功，在約450bp處均有明顯的條帶。

2.3構(gòu)建質(zhì)粒pKVM1：：metK′

以BacilluscereusEN34基因組為模板，metK1F/R、metK2F/R為引物擴增出metK基因完整序列，經(jīng)測序分析，全長約1095bp。用引物metKUF/R、metKDF/R擴增相應(yīng)片段，2個片段大小均約為300bp。2個片段重組連接后命名為metK′，大小約為600bp。將pKVM1酶切產(chǎn)物與2個片段重組連接，形成pKVM1：：metK′，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞S17-1。經(jīng)驗證，質(zhì)粒pKVM1：：metK′中含有metK′，說明質(zhì)粒構(gòu)建成功，見圖5中8號樣品電泳結(jié)果。

2.4改變BacilluscereusEN34metK基因

提取質(zhì)粒pKVM1：：metK′，電擊轉(zhuǎn)化到BacilluscereusEN34感受態(tài)細胞中。電轉(zhuǎn)化后涂布含有Amp、IPTG、X-gal的平板中。質(zhì)粒pKVM1上含有β-半乳糖苷酶基因，并含有Amp抗性，因此電轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)化子在X-gal存在的情況下能夠顯藍色。挑選5株藍色轉(zhuǎn)化子進行單交換培養(yǎng)，挑取白色菌落。質(zhì)粒pKVM1上帶有的Amp抗性，即使發(fā)生單交換，其Amp抗性仍存在（BacilluscereusEN34原始菌無Amp抗性）。如果質(zhì)粒與基因組沒有發(fā)生重組，菌落顯示藍色，只有白色菌落有可能發(fā)生同源重組[18]。進行雙交換試驗，沒有菌株生長在LB平板上，說明發(fā)生雙交換，SAM無法合成，即使補充適量SAM，菌體也會死亡，所以最終只能獲得單交換的菌株，單交換僅僅是弱化了metK基因[19]。

以metKUF/R為引物，不同菌株的電泳結(jié)果如圖5所示。選取的5株菌中均含有重組后的metK′基因（約600bp）和約1700bp較弱的metK完整基因，比7號泳道中BacilluscereusEN34擴增的片段稍大，應(yīng)該是metK-metK′結(jié)構(gòu)。電泳圖中2～6號菌株中出現(xiàn)更大的片段，應(yīng)該有質(zhì)粒插入到metK基因中，質(zhì)粒大小約為11000bp。

2.5蛋氨酸產(chǎn)量分析

將BacilluscereusEN34（pEB03-P43-SD-metI）、BacilluscereusEN34Δ（metK）、BacilluscereusEN34均接種到完全培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)后接種到發(fā)酵培養(yǎng)基。培養(yǎng)72h后，利用氨基酸分析儀分析發(fā)酵液中蛋氨酸產(chǎn)量（圖6）。BacilluscereusEN34發(fā)酵液中蛋氨酸產(chǎn)量平均值為38.89mg/L，BacilluscereusEN34（pEB03-P43-SD-metI）產(chǎn)量平均值為29.46mg/L。說明雖然metI基因增加了拷貝數(shù)，但蛋氨酸產(chǎn)量并沒有提高。原因可能是發(fā)酵培養(yǎng)基中硫源的量不足，也可能是拷貝數(shù)增加了，但表達量還未提高。BacilluscereusEN34Δ（metK）產(chǎn)量平均值為79.58mg/L。

2.6培養(yǎng)條件優(yōu)化

針對BacilluscereusEN34（pEB03-P43-SD-metI）菌株，梯度添加不同濃度的Na2SO4后，蛋氨酸產(chǎn)量有明顯上升（圖7），當Na2SO4添加量達到15g/L時，蛋氨酸產(chǎn)量達到最大值。由數(shù)據(jù)計算結(jié)果可知，此時蛋氨酸產(chǎn)量達26.53mg/L，與“2.5”節(jié)中結(jié)果一致。說明增加有強啟動子P43的表達質(zhì)粒，沒有強化硫酸鈉的代謝通路，須要進一步加強表達整個通路中的其他酶。Na2SO4濃度高于15g/L時蛋氨酸產(chǎn)量變化不大，因此Na2SO4最佳添加量為15g/L。圖8展現(xiàn)的是Na2SO4對BacilluscereusEN34Δ（metK）菌株的影響，當Na2SO4添加濃度達到15g/L時，蛋氨酸產(chǎn)量達到最大值，為151.8mg/L。

如圖9所示，梯度添加甲基硫醇鈉和二甲基硫醚混合物，添加量從0到200μL/L，蛋氨酸產(chǎn)量迅速增加。添加量從200到350μL/L，蛋氨酸產(chǎn)量上升幅度極小，因此此混合物添加量選擇200μL/L，此時蛋氨酸產(chǎn)量為159.5mg/L。甲基硫醇鈉的利用，需要一定比例的二甲基硫醚配合才能發(fā)揮它的作用。甲基硫醇鈉在發(fā)酵過程中，主要提供硫源和甲基源[20]。

在優(yōu)化試驗中，將2類硫源都加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，即200μL甲基硫醇鈉和二甲基硫醚的混合物、15g/L的Na2SO4。蛋氨酸產(chǎn)量如圖10所示，[JP2]BacilluscereusEN34出發(fā)菌株的產(chǎn)量為22.24mg/L，metK基因表達弱化的菌株產(chǎn)量為440.66mg/L，相當于出發(fā)菌株的20倍。進一步說明metK基因缺失或表達弱化阻止了蛋氨酸向S-腺苷蛋氨酸的轉(zhuǎn)變，增加了蛋氨酸產(chǎn)量。而BacilluscereusEN34（pEB03-P43-SD-metI）菌株蛋氨酸[JP2]產(chǎn)量反而更低，進一步證明metI單獨增強，不會提高蛋氨酸產(chǎn)量。

3討論

BacilluscereusEN34是在實驗室篩選獲得的一株野生型菌株，產(chǎn)少量蛋氨酸。蛋氨酸代謝通路復(fù)雜，存在較多反饋抑制，為提高蛋氨酸產(chǎn)量，本試驗從2個方向分析，改變metI、metK2個基因?qū)Φ鞍彼岙a(chǎn)量的影響[21]。加強MetI催化向蛋氨酸的反應(yīng)，減弱或阻止metK催化蛋氨酸向SAM的轉(zhuǎn)化。加強metI，采用導(dǎo)入表達質(zhì)粒pEB03，連接強啟動子P43。P43來源于枯草芽孢桿菌，與BacilluscereusEN34同屬于芽孢桿菌，易于強化所連接基因的表達。馬磊等增強啟動子P43構(gòu)建了pYG43穿梭表達載體，成功提高了宿主體內(nèi)堿性纖維素酶活性的5～7倍[22]。本次試驗，如果pEB03-P43-SD-metI轉(zhuǎn)化到BacilluscereusEN34中能提高蛋氨酸產(chǎn)量，后期可設(shè)計試驗重組質(zhì)粒上的P43強啟動子到BacilluscereusEN34基因組metI基因前面，再去除質(zhì)粒。此次試驗是對加強metI基因?qū)Φ鞍彼岙a(chǎn)量的影響探索。但本試驗結(jié)果說明，單獨加強metI的表達，不能提高蛋氨酸產(chǎn)量。減弱或阻止metK的表達，采用改變metK基因，試驗順利構(gòu)建成穿梭性質(zhì)粒pKVM1：：metK′載體，并轉(zhuǎn)化到BacilluscereusEN34。雙交換未獲得，這與文獻[19]中報道的一致，雙交換徹底破壞了metK，無法合成SAM，導(dǎo)致細胞無法生長。試驗中為彌補這一現(xiàn)象，培養(yǎng)基中補充適量的SAM，但菌體仍然無法生長。說明metK的表達只能弱化，不能刪除。metK′與metK的重組，導(dǎo)致metK基因序列發(fā)生改變，對于其表達產(chǎn)物也會產(chǎn)生影響，理解為弱化表達，試驗結(jié)果表明metK的弱化有利于蛋氨酸的積累。

甲基硫醇鈉和二甲基硫醚都是還原性硫源，可以在代謝通路中直接轉(zhuǎn)為O-乙酰高絲氨酸，通過O-乙酰高絲氨酸巰基酶（MetY）催化O-乙酰高絲氨酸生成蛋氨酸[20]。Na2SO4進入細胞后經(jīng)一系列反應(yīng)[21]，生成H2S，再經(jīng)metI催化與琥珀酰高絲氨酸反應(yīng)形成L-高半胱氨酸，最終轉(zhuǎn)為蛋氨酸。相當于前者是直接硫源，后者是間接硫源。試驗結(jié)果表明，2種硫源同時加入，有利于提高蛋氨酸產(chǎn)量。

4結(jié)論

本試驗通過構(gòu)建表達載體質(zhì)粒pEB03-P43-SD-metI、穿梭質(zhì)粒pKVM1：：metK′，電轉(zhuǎn)化等流程，成功將metI基因與強啟動子P43連接到表達質(zhì)粒pEB03中，并轉(zhuǎn)化到BacilluscereusEN34，使metI表達加強;另成功將metK部分基因插入到穿梭質(zhì)粒pKVM1中，轉(zhuǎn)化到BacilluscereusEN34發(fā)生重組，弱化metK的表達。通過優(yōu)化培養(yǎng)基硫源，得出最佳硫源為2種：200μL/L甲基硫醇鈉和二甲基硫醚的混合物、15g/L的Na2SO4。試驗也確定單獨增強metI基因不能提高蛋氨酸產(chǎn)量，而改變metK基因可以增加蛋氨酸產(chǎn)量，但不能完全去除metK基因，會導(dǎo)致菌株死亡。本試驗結(jié)果可以為后期繼續(xù)改造芽孢桿菌與提高蛋氨酸產(chǎn)量提供技術(shù)支持和數(shù)據(jù)參考。

參考文獻：

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