何淑華，許 琦，林曉雁，盧朝成，傅江南，和 君

(1.暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心，廣東 廣州 510632；2.成都中牧生物藥業(yè)有限公司，四川 成都 610100)

消毒工作是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物工作的基礎(chǔ)保障。從業(yè)人員只有使用正確配比的消毒劑才能達(dá)到消毒效果，才能在生產(chǎn)、試驗(yàn)過(guò)程中把控實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量，規(guī)范實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的安全管理[1]。因此，消毒工作是控制環(huán)境中病原的關(guān)鍵。目前，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障環(huán)境中常見(jiàn)的消毒劑種類(lèi)包括含氯類(lèi)、過(guò)氧化物類(lèi)、醛類(lèi)、醇類(lèi)和季銨鹽類(lèi)消毒劑[2]。單一消毒劑易受微生物的種類(lèi)、使用濃度、環(huán)境中有機(jī)物等因素的影響而不能達(dá)到預(yù)期的效果，復(fù)合型消毒劑可避免此類(lèi)問(wèn)題達(dá)到好的殺滅效果[3-4]。本試驗(yàn)對(duì)一種新型三組方季銨鹽戊二醛消毒劑進(jìn)行殺菌效果評(píng)價(jià)，選用4種常用消毒劑進(jìn)行噴霧消毒對(duì)比試驗(yàn)[5]；與復(fù)合過(guò)氧乙酸進(jìn)行懸液定量殺菌對(duì)比試驗(yàn)。本試驗(yàn)結(jié)果對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施的消毒劑選擇及有效配比提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)組消毒液 復(fù)合過(guò)氧乙酸 (Compound peracetic acid disinfectant,CPAA)，有效成分：過(guò)氧乙酸30～60 g/L、過(guò)氧化氫220～280 g/L；季銨鹽戊二醛 (Quaternary ammonium salt glutaraldehyde disinfectant,QASG)，主要成分：苯扎氯銨16 g/L、癸甲溴銨24 g/L、戊二醛20 g/L，用前加無(wú)水碳酸鈉20 g/L進(jìn)行堿化；漂白水，主要成分：次氯酸鈉和氫氧化鈉；微酸性次氯酸，有效氯含量60～80 mg/L；乙醇，含量為(950±50) mL/L。以上產(chǎn)品均為市售產(chǎn)品。

1.1.2 菌種 大腸埃希菌 ATCC 8099、金黃色葡萄球菌 ATCC 6538、綠膿桿菌 ATCC 15442、白色念珠菌 ATCC 10231，均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基與試劑 胰蛋白胨大豆肉湯 (TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂 (TSA)、液體沙氏培養(yǎng)基，購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)，購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)硬水、胰蛋白胨生理鹽水溶液 (TPS)、3%牛血清白蛋白 (BSA)，參照 《消毒技術(shù)規(guī)范》[5](簡(jiǎn)稱(chēng)《規(guī)范》) 配制；復(fù)合過(guò)氧乙酸和季銨鹽戊二醛的中和劑參照文獻(xiàn)[6-7]。

1.2 方法

1.2.1 噴霧消毒試驗(yàn) 取普通環(huán)境實(shí)驗(yàn)室桌面自然菌接種于TSB，37 ℃培養(yǎng)18 h，稀釋麥?zhǔn)媳葷岫?(McF) 為0.5的菌懸液，104倍稀釋?zhuān)?.2 mL/皿涂布于TSA制成染菌皿 (染菌量250～300 CFU/皿)。5種消毒劑參照說(shuō)明書(shū)的最高消毒濃度 (復(fù)合過(guò)氧乙酸1∶24倍稀釋、季銨鹽戊二醛1∶100倍稀釋、漂白水6∶190倍稀釋、微酸性次氯酸原液、乙醇100∶26倍稀釋) 進(jìn)行噴霧試驗(yàn)，為確保噴霧消毒劑量的一致性，以固定噴頭、噴灑距離來(lái)實(shí)現(xiàn)。37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，計(jì)算菌落數(shù)，按下式計(jì)算殺滅率 (%)。

殺滅率= (試驗(yàn)組菌落數(shù)-陽(yáng)性對(duì)照菌落數(shù))/陽(yáng)性對(duì)照菌落數(shù)×100%

1.2.2 試驗(yàn)菌懸液的制備 參照 《規(guī)范》，復(fù)蘇菌種培養(yǎng)至3代，分別取E.coil、S.aureus、P.aeruginosa單菌落接種TSA斜面37 ℃培養(yǎng)24 h；C.albicans接種于PDA斜面26 ℃培養(yǎng)48 h。用TPS洗脫斜面培養(yǎng)物，使各菌為E.coil1.9 McF、S.aureus2.0 McF、P.aeruginosa2.1 McF、C.albicans6.9 McF。

1.2.3 活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù) 參照 《規(guī)范》將E.coil、S.aureus、P.aeruginosa在TSA中37 ℃培養(yǎng)48 h，C.albicans在PDA中26 ℃培養(yǎng)72 h，計(jì)算菌濃度 (CFU/mL)。

1.2.4 中和劑鑒定試驗(yàn) 以E.coil和C.albicans為試驗(yàn)菌，室溫下按中和劑懸液定量鑒定試驗(yàn)設(shè)計(jì)6組，參照《規(guī)范》進(jìn)行試驗(yàn)：第1組 (消毒液+菌懸液)；第2組 (消毒液+菌懸液+中和劑)；第3組 (中和劑+標(biāo)準(zhǔn)硬水+菌懸液)；第4組 (中和產(chǎn)物+菌懸液)；第5組 (TPS+標(biāo)準(zhǔn)硬水+菌懸液)；第6組 (TPS+中和劑+標(biāo)準(zhǔn)硬水)。試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算各組的菌落數(shù)，按下式計(jì)算第3、4、5組間菌落數(shù)誤差率。

Pz=(∑︱X-Xi︱)÷(∑Xi)×100%

Pz：組間菌落數(shù)誤差率；X：3組間菌落平均數(shù)；Xi：各組菌落平均數(shù)

1.2.5 懸液定量殺菌試驗(yàn) 參照《規(guī)范》，室溫下比較復(fù)合過(guò)氧乙酸和季銨鹽戊二醛不同濃度下對(duì)E.coil、S.aureus、P.aeruginosa和C.albicans的定量殺菌效果。消毒液的稀釋度為 1∶100、1∶500和1∶1 000，消毒液與標(biāo)準(zhǔn)硬水以 1.25∶100、1.25∶500 和 1.25∶1 000 配制。0.5 mL 菌懸液和 0.5 mL 3%BSA 混勻后加入 4 mL 配制濃度的消毒液，混勻30 min 后，取 0.5 mL 試驗(yàn)菌、消毒混合液加入4.5 mL中和劑中，混勻作用10 min，取 1 mL 該樣液計(jì)算菌落數(shù)，試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次；同時(shí)設(shè)立對(duì)照組。計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)值 (KL)。

KL=lg(T0)-lg(Tx)

KL：殺滅對(duì)數(shù)值；T0：陽(yáng)性對(duì)照組平均活菌濃度；Tx：試驗(yàn)組平均活菌濃度

1.2.6 pH測(cè)定 參照《規(guī)范》“pH測(cè)定法”測(cè)定復(fù)合過(guò)氧乙酸及季銨鹽戊二醛的不同稀釋度的pH。

2 結(jié)果

2.1 噴霧消毒 噴霧試驗(yàn)結(jié)果顯示(見(jiàn)中插彩版圖1)，季銨鹽戊二醛 1∶100倍稀釋和復(fù)合過(guò)氧乙酸 1∶24倍稀釋的殺滅率均為100%，漂白水 6∶190倍稀釋、微酸性次氯酸原液、乙醇 100∶26倍稀釋的殺滅率分別為59%、37%和50%。

圖1 5種消毒劑噴霧后表面菌落的生長(zhǎng)情況Fig.1 Growth of surface colonies after spraying five disinfectantsA：陽(yáng)性對(duì)照；B：漂白水；C：季銨鹽戊二醛；D：微酸性次氯酸；E：乙醇；F：復(fù)合過(guò)氧乙酸A:Positive control;B:Bleach;C:QASG;D:Slightly acidic hypochlorous acid;E:Ethanol;F:CPAA

2.2 中和劑鑒定 參照《規(guī)范》和趙斌秀等[8]發(fā)表的中和劑合格標(biāo)準(zhǔn)，1組無(wú)菌生長(zhǎng)，2組比1、3、4、5組菌數(shù)量顯著減少，3、4、5組間菌落數(shù)誤差率不超過(guò)15%，6組無(wú)菌生長(zhǎng)，中和劑鑒定合格，結(jié)果見(jiàn)表1。所用中和劑均能有效中和消毒液，且中和劑、中和產(chǎn)物對(duì)E.coil和C.albicans均無(wú)影響。

表1 中和劑鑒定試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of neutralization identification test (n=3)

2.3 懸液定量殺菌 由表2所示，復(fù)合過(guò)氧乙酸1∶1 000 倍稀釋對(duì)E.coil、S.aureus、P.aeruginosa的殺滅對(duì)數(shù)值均>7；季銨鹽戊二醛 1∶1 000 倍稀釋對(duì)S.aureus的殺滅對(duì)數(shù)值>7，1∶500倍稀釋對(duì)E.coil殺滅對(duì)數(shù)值>7，1∶100 倍稀釋對(duì)P.aeruginosa的殺滅對(duì)數(shù)值>7；復(fù)合過(guò)氧乙酸和季銨鹽戊二醛 1∶500 倍稀釋對(duì)C.albicans的殺滅對(duì)數(shù)值均>6。參照 《規(guī)范》 要求，細(xì)菌繁殖體的殺滅對(duì)數(shù)值≥5、真菌的殺滅對(duì)數(shù)值≥4，判定為消毒合格。因此，季銨鹽戊二醛 1∶100 倍稀釋?zhuān)瑥?fù)合過(guò)氧乙酸 1∶500 倍稀釋對(duì)所測(cè)菌株殺滅效果均可達(dá)100%，消毒合格。

表2 懸液定量殺菌試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of suspension quantitative sterilization test

2.4 pH測(cè)定 由表3所示，季銨鹽戊二醛原液呈酸性，使用前每升原液需加入20 g無(wú)水碳酸鈉進(jìn)行堿化，使pH達(dá)到9.7～10.0，該液的工作濃度pH在7.4～9.8；復(fù)合過(guò)氧乙酸原液呈酸性，工作濃度的pH范圍在2.6～3.5。

表3 不同稀釋度消毒液的pHTable 3 pH of disinfectant with different dilution

3 討論

動(dòng)物設(shè)施中，人源、動(dòng)物源、物源使用不規(guī)范或管理不當(dāng)均可造成外源物的污染。因此，嚴(yán)格做好消毒工作是保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施潔凈，獲得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可靠的關(guān)鍵。本試驗(yàn)選用常用的復(fù)合過(guò)氧乙酸、漂白水、微酸性次氯酸、乙醇消毒液，與季銨鹽戊二醛進(jìn)行噴霧消毒對(duì)比試驗(yàn)。結(jié)果顯示，復(fù)合過(guò)氧乙酸1∶24倍稀釋和季銨鹽戊二醛1∶100倍稀釋的殺滅率均為100%。進(jìn)一步以復(fù)合過(guò)氧乙酸和季銨鹽戊二醛進(jìn)行定量殺菌效果比較。結(jié)果顯示，季銨鹽戊二醛1∶100倍稀釋和復(fù)合過(guò)氧乙酸1∶500倍稀釋對(duì)各試驗(yàn)菌殺滅效率高達(dá)100%。

圖2 懸液定量殺菌試驗(yàn)菌落生長(zhǎng)情況Fig.2 Colony growth in suspension quantitative sterilization testP：陽(yáng)性對(duì)照組；A、B、C：分別為復(fù)合過(guò)氧乙酸1∶100、1∶500、1∶1 000的稀釋液試驗(yàn)組；D、E、F：分別為季銨鹽戊二醛1∶100、1∶500、1∶1 000的稀釋液試驗(yàn)組P:Positive control group;A,B,C:CPAA’s dilution test groups 1∶100,1∶500,1∶1 000;D,E,F:QASG’s dilution test groups 1∶100,1∶500,1∶1 000

復(fù)合型季銨鹽戊二醛由苯扎氯銨、癸甲溴銨和戊二醛三方組成。戊二醛屬于醛類(lèi)高效消毒劑，可抑制RNA、DNA和蛋白質(zhì)合成，殺滅各種微生物；苯扎氯銨、癸甲溴銨是常用的單、雙鏈季銨鹽類(lèi)陽(yáng)離子表面活性劑，具有良好的殺菌作用[9]。復(fù)合型季銨鹽戊二醛降低了單一組分的用量，同時(shí)達(dá)到提高消毒效果、提升穩(wěn)定性、減少副作用的目的[10]。同時(shí)，這類(lèi)消毒劑在酸性條件下穩(wěn)定儲(chǔ)存，在堿性條件下殺滅效果好[3-4]，符合理想的化學(xué)消毒劑殺菌譜廣、高效、低毒、低腐蝕、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。

本試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室條件下，檢測(cè)了季銨鹽戊二醛的殺滅效果，殺滅率依次為：金黃色葡萄球菌>大腸埃希菌>銅綠假單胞菌，與魏嵐[11]的研究結(jié)果一致，殺滅效果符合實(shí)驗(yàn)室殺滅微生物試驗(yàn)的消毒要求[5]。本試驗(yàn)為各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施消毒液的選擇提供依據(jù)，并為有針對(duì)性殺滅病原體提供參考。