血清4型禽腺病毒對(duì)SPF雞的致病特性及其排毒規(guī)律

殷國(guó)政，王凱莉，劉 成，路建彪，吳 昊，李玉保，司振書

(聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 聊城 252059)

禽腺病毒(Fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)屬于腺病毒科(Adenoviridae)，禽腺病毒屬(Aviadenovirus)。根據(jù)限制性酶切圖譜和交叉中和試驗(yàn)將其分為5個(gè)種(FAdV-A～FAdV-E)和12個(gè)血清型(FAdV-1～8a，8b～FAdV-11)[1]，其中FAdV-4可引起雞心包積液-肝炎綜合征(Hydropericardium-hepatitis syndrome，HHS)。1987年巴基斯坦的安卡拉首次報(bào)道發(fā)生了該病，主要病變?yōu)閲?yán)重心包積液和肝臟多灶性壞死[2]。2015年以來(lái)HHS在我國(guó)河南、河北、山東、江蘇、安徽、廣東等地均有發(fā)生和流行，給養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-6]。HHS發(fā)病急，傳播速度快，死亡率高，可發(fā)生于肉雜雞、白羽肉雞、蛋雞和三黃雞等。為掌握HHS病原的主要致病特點(diǎn)，采用本實(shí)驗(yàn)室分離到的1株FAdV-4人工感染SPF雞，對(duì)病死雞各臟器進(jìn)行組織病理學(xué)觀察，應(yīng)用PCR方法對(duì)病毒在各組織器官中的分布以及排毒情況進(jìn)行了檢測(cè)，為有效防控該病的發(fā)生和流行提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒株、主要試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Ⅰ群FAdV-4聊城分離株SDLC 201601，由聊城大學(xué)畜禽疫病防控技術(shù)研究所分離、鑒定并保存。DNA提取試劑盒，購(gòu)自TaKaRa公司；PCR Mix等試劑，均購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。9日齡SPF雞胚，購(gòu)自山東省家禽研究所，自行孵化，隔離器飼養(yǎng)至21日齡。

1.2 引物的合成 根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]合成以下引物，H1：5′-TGGACATGGGGGCGACCT-3′；H2：5′-AAGGGATTGACGTTGTCCA-3′，對(duì)Ⅰ群FAdV-4的Hexon基因進(jìn)行擴(kuò)增，目的條帶為1 219 bp，引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 SPF雞的飼養(yǎng)與FAdV-4感染 將40只21日齡SPF雞隨機(jī)分成感染組(25只)、同居組(5只)和對(duì)照組(10只)。感染組腹腔注射病毒液(300 μL/只，約103.9EID50)；同居組不接種病毒，與感染組同居飼養(yǎng)；對(duì)照組腹腔注射生理鹽水(300 μL/只)。自由采食和飲水，每日觀察記錄雞群臨床癥狀及死亡情況。

1.4 感染組雞剖檢病變及其病理組織學(xué)變化 及時(shí)剖檢死亡雞只，觀察記錄各組織臟器眼觀病變。采集其肝臟、心臟、肺臟、腎臟等組織器官樣品，10%中性福爾馬林溶液固定，常規(guī)制作石蠟切片，H.E.染色，光學(xué)顯微鏡觀察病理組織學(xué)變化。

1.5 FAdV-4在感染組雞組織臟器中分布情況 分別取感染組5只病死雞的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胰腺、小腸、肌胃、腦、法氏囊等器官進(jìn)行研磨、離心，取上清，按DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取其總DNA，利用PCR方法檢測(cè)FAdV-4在各組織臟器中的分布情況。PCR反應(yīng)體系為25 μL：DNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，2×TaqPCR Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s，共34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6 感染組雞排毒情況檢測(cè) 分別在感染后3、5、7、14 d和21 d時(shí)，隨機(jī)采取5只感染組雞和對(duì)照組雞的喉頭和泄殖腔拭子，置1.5 mL離心管中，加入含雙抗的PBS 1 mL，將棉拭子頭部在管壁反復(fù)擠壓，棄去拭子，12 000 r/min離心10 min，取上清提取總DNA，利用PCR方法檢測(cè)各拭子中FAdV-4的Hexon基因，方法同1.5。

2 結(jié)果

2.1 感染組雞發(fā)病死亡情況 感染后1～2 d，雞采食、活動(dòng)等未見異常；第3天時(shí)，感染組雞有2只精神萎靡、縮頸呆立、羽毛蓬亂，約2～3 h死亡；感染后4 d達(dá)到死亡高峰；同居組雞第4天時(shí)開始出現(xiàn)死亡，陸續(xù)共死亡3只；感染后11 d再無(wú)死亡，感染組和同居組死亡率均為60%。整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)，對(duì)照組無(wú)發(fā)病死亡。

2.2 感染組雞剖檢病變 死亡雞及時(shí)剖檢，結(jié)果顯示，心臟包膜內(nèi)有不同程度的積液，嚴(yán)重的積液可達(dá)10 mL以上，積液呈淡黃色，個(gè)別雞心包積液呈膠胨樣，心肌變軟，右心室肥大(中插彩版圖1A)；肝臟呈土黃色，腫大，質(zhì)地變脆，表面有點(diǎn)狀出血或淡黃色壞死灶(中插彩版圖1B)；腎臟腫脹，因尿酸鹽沉積呈花斑腎樣(中插彩版圖1C)；氣管發(fā)紅，有明顯的血絲和出血點(diǎn)(中插彩版圖1D)；胰腺有點(diǎn)狀出血(中插彩版圖1E)；脾臟腫脹，表面可見灰白色壞死灶(中插彩版圖1F)。對(duì)照組各臟器均未見明顯病變。表明FAdV-4感染除導(dǎo)致雞心包積液和肝臟損傷等特征性病變外，還對(duì)腎臟、脾臟、胰腺等多個(gè)器官造成損傷。

圖1 感染雞主要臟器組織剖檢病變Fig.1 The autopsy changes of main organs in infected chickensA:心包積液；B:肝臟腫大出血；C:腎臟尿酸鹽沉積；D:氣管出血；E:胰腺出血；F:脾臟腫脹A:Hydropericardium；B:Liver congestive and necrosis；C:Kidney urate deposition；D:Tracheorrhagia；E:Pancreaticrrhaia；F:Swollen spleen

2.3 感染組雞病理組織學(xué)變化 采集死亡雞只各組織臟器，進(jìn)行病理組織學(xué)檢測(cè)，結(jié)果顯示，感染組雞肝臟中央靜脈、肝竇擴(kuò)張，充滿紅細(xì)胞；肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞腫脹、壞死，可見碎裂的肝細(xì)胞核碎片；肝細(xì)胞核增大，可見嗜堿性核內(nèi)包涵體；同時(shí)可見存在大面積的肝細(xì)胞脂肪變性(中插彩版圖2A、2E)；心肌纖維腫脹，間隙增寬(中插彩版圖2B、2F)；肺組織內(nèi)多處可見巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管擴(kuò)張，充滿紅細(xì)胞(中插彩版圖2C、2G)；腎臟腎小管上皮細(xì)胞腫脹，管腔變窄；可見多處腎小管上皮細(xì)胞壞死，核濃縮、核碎裂(中插彩版圖2D、2H)。表明FAdV-4感染可在雞肝細(xì)胞內(nèi)形成特征性的核內(nèi)包涵體，同時(shí)對(duì)心肌纖維、腎小管上皮細(xì)胞等造成明顯的病理性損傷。

2.4 FAdV-4在感染組雞組織臟器中分布情況 取感染組病死雞各臟器組織，利用PCR方法檢測(cè)FAdV-4的組織分布情況。結(jié)果顯示，感染死亡雞的肝臟、心臟、脾臟、小腸、胰腺、腎臟、腦、法氏囊和肌胃等組織可不同程度檢出FAdV-4的DNA，其中肝臟、心臟、脾臟、胰腺和腎臟的陽(yáng)性率均為100%，小腸的檢出率為80%，腦、法氏囊和肌胃的檢出率為60%(表1)，各臟器總檢出率為84.4%(38/45)。表明該病毒能感染雞肝臟、心臟、脾臟等多種組織器官，并在其中進(jìn)行增殖，具有一定的泛嗜性。

表1 感染死亡雞各組織臟器Hexon基因PCR檢測(cè)Table 1 PCR detection of Hexon gene in organs of infected dead chickens

2.5 感染組雞排毒情況結(jié)果 利用PCR方法檢測(cè)感染組雞通過(guò)口腔、泄殖腔排毒情況。結(jié)果顯示，感染組雞感染后3 d時(shí)，泄殖腔棉拭子檢測(cè)陽(yáng)性，感染后5 d時(shí)，檢測(cè)陽(yáng)性率最高，達(dá)到60%；感染后7 d和14 d時(shí)，感染組雞喉頭棉拭子檢測(cè)陽(yáng)性，陽(yáng)性率分別為40%和20%；感染后21 d時(shí)，喉頭和泄殖腔棉拭子檢測(cè)均為陰性。對(duì)照組各階段喉頭和泄殖腔棉拭子檢測(cè)均為陰性(表2)。表明FAdV-4感染雞可以通過(guò)泄殖腔和口腔進(jìn)行排毒，其中泄殖腔排毒為主要方式。

表2 感染組雞FAdV-4排毒情況檢測(cè)Table 2 Detection of FAdV-4 detoxification of infected group chickens (陽(yáng)性數(shù)/檢測(cè)數(shù))

3 討論

雞心包積液-肝炎綜合征由FAdV-4引起,主要分布在亞洲、阿拉伯和拉丁美洲國(guó)家[8]。禽腺病毒無(wú)囊膜，為雙股DNA病毒[9]。2015年，由FAdV-4引起的雞心包積液綜合征在我國(guó)多地暴發(fā)[4,10-11]，肉雜雞、白羽肉雞、商品蛋雞及種雞均可發(fā)病，尤其對(duì)2～4周齡的肉雜雞危害較為嚴(yán)重，發(fā)病率高，死亡快，發(fā)病雞群往往未見明顯臨床癥狀時(shí)死亡率突然升高，個(gè)別雞群日死亡率可高達(dá)10%左右，整個(gè)發(fā)病周期死亡率可達(dá)60%以上。對(duì)于該病毒水平傳播能力未見報(bào)道，本試驗(yàn)通過(guò)設(shè)置未感染同居組，對(duì)其水平傳播能力進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，感染后3 d，感染組開始死亡，同居組雞出現(xiàn)死亡只比感染組雞延后1 d，感染組與同居組致死率均為60%，表明該毒株具有較高的致病性和致死率，該病毒可水平傳播，且傳播速度較快。有研究表明，滅活疫苗能有效保護(hù)SPF雞免受該病毒的感染[12]，但目前仍無(wú)理想的商品化疫苗控制該病的發(fā)生和流行，該試驗(yàn)毒株是否具有較強(qiáng)的抗原性，能否作為疫苗株，有待于進(jìn)一步研究。

剖檢FAdV-4感染死亡雞只，可見心包積液，肝臟腫大壞死，腎臟腫脹，花斑腎，與Zhao等[13]報(bào)道基本一致，但FAdV-4感染導(dǎo)致胰腺出血以及氣管環(huán)出血未見報(bào)道，分析原因可能是毒株不同所致。感染組死亡雞各臟器FAdV-4 DNA的PCR總陽(yáng)性率為84.4%，肝臟、心臟、脾臟、小腸等臟器均檢出該病毒的存在，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致[11-13]，但在感染雞腦組織中檢測(cè)FAdV-4陽(yáng)性未見報(bào)道。說(shuō)明該病毒可在多臟器進(jìn)行增殖，具有一定的泛嗜性，可引起全身性感染，這應(yīng)該是其致病性強(qiáng)、致死率高的原因之一。該病毒可在多組織器官進(jìn)行擴(kuò)散和蔓延，其感染不同器官、細(xì)胞的機(jī)制如何，在各臟器中主要感染哪些細(xì)胞，在不同臟器中的病毒載量有無(wú)差別，哪些臟器中的含量較高等問(wèn)題，還有待進(jìn)一步研究。排毒情況監(jiān)測(cè)表明，感染后3 d即可通過(guò)泄殖腔進(jìn)行排毒，感染后7 d和14 d口腔和泄殖腔均可排毒。說(shuō)明該病毒侵襲力強(qiáng)，可在雞體內(nèi)快速增殖并排毒。從持續(xù)排毒時(shí)間和排毒率來(lái)看，泄殖腔排毒是其最主要的排毒方式，尤其在感染早期，因此針對(duì)該病的預(yù)防做好排泄物的消毒處理尤為重要。