魏芳芳?李文莉?甄麗敏?廖常斌?許瑞榮?吳茂盛

【摘要】目的 探討HBV前C（PC）區(qū)和基本核心啟動子（BCP）區(qū)與乙型肝炎患者病情進展的關系。方法 選擇37例慢性乙型肝炎患者（慢乙肝組）及27例乙型肝炎肝硬化患者（肝硬化組），分析2組患者的一般資料和臨床特征，對2組患者血清樣本進行A1762T/G1764A、G1896A基因突變檢測，比較組間差異。結果 肝硬化組患者的年齡大于慢乙肝組，ALT、HBV DNA水平低于慢乙肝組，層粘連蛋白水平高于慢乙肝組（P均< 0.05）。肝硬化組患者A1762T/G1764A雙位點突變發(fā)生率為78%，高于慢乙肝組的49%（P < 0.05）;肝硬化組G1896A突變發(fā)生率為48%，慢乙肝組為60%，2組比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。結論 乙肝肝硬化患者HBV PC/BCP區(qū)A1762T/G1764A突變率高于慢乙肝患者，A1762T/G1764A突變可能參與慢乙肝發(fā)展至肝硬化的過程。

【關鍵詞】慢性乙型肝炎;乙肝肝硬化;前C區(qū)突變;基本核心啟動子區(qū)突變

Preliminary analysis of correlation between gene mutation in pre-core and basic core promoter of hepatitis B virus and hepatitis B-induced liver cirrhosis Wei Fangfang， Li Wenli， Zhen Limin， Liao Changbin， Xu Ruirong， Wu Maosheng. Department of Infectious Disease， Guangdong Second Provincial General Hospital， Guangzhou 510317， China

Corresponding author， Wu Maosheng， E-mail： wu.maosheng@ 163. com

【Abstract】Objective To explore the correlation between the gene mutations in hepatitis B virus （HBV） pre-core （PC） and basic core promoter （BCP） and the progression of hepatitis B. Methods A total of 37 patients with chronic hepatitis B （CHB） and 27 patients with CHB-induced liver cirrhosis were recruited into the CHB and liver cirrhosis groups. Baseline data and clinical characteristics were analyzed in two groups. The gene mutations of A1762T/G1764A and G1896A in the serum samples were detected and compared between two groups. Results The age of liver cirrhosis patients was significantly older， the ALT and HBV DNA levels were considerably lower and the laminin level was significantly higher compared with those in the CHB group （all P < 0.05）. The incidence rate of of A1762T/G1764A double mutations in the liver cirrhosis group was 78%， significantly higher than 49% in CHB patients （P < 0.05）. The incidence rate of G1896A mutation did not significantly differ between the CHB and liver cirrhosis groups （60% vs. 48%， P > 0.05）. Conclusions The prevalence of A1762T/G1764A double mutations in the PC/BCP of patients with liver cirrhosis is significantly higher than that in CHB patients. A1762T/G1764A mutation probably participates in the progression from CHB into liver cirrhosis.

【Key words】Chronic hepatitis B;Hepatitis B-induced liver cirrhosis;Pre-core mutation;

Basic core promoter mutation

HBV前 C （PC）區(qū)和基本核心啟動子（BCP）區(qū)基因變異后病毒復制能力增強、機體免疫原性改變和致病性增強，影響機體的免疫應答情況，使HBV逃避宿主的免疫清除，導致持續(xù)感染并加重肝細胞損害[1]。PC/BCP區(qū)基因變異是導致HBV感染病情加重的重要原因。PC/BCP區(qū)最常見突變位點是G1896A、A1762T/G1764A，既往研究表明G1896A、A1762T/G1764A突變會加重乙型肝炎患者病情，導致重型肝炎、肝癌的發(fā)生[2]。然而，有關PC/BCP區(qū)突變與肝硬化相關性研究卻很少報道，本研究通過對慢性乙型肝炎（慢乙肝）與乙型肝炎肝硬化（乙肝肝硬化）患者G1896A、A1762T/G1764A發(fā)生率進行比較，進一步探索PC/BCP區(qū)突變在乙型肝炎病情進展中作用。

對象與方法

一、研究對象

選擇2015年9月至2016年3月在我院住院治療的37例慢乙肝患者（慢乙肝組）和27例乙肝肝硬化（肝硬化組）患者，其診斷均符合《2012亞太肝病研究學會共識聲明：慢性乙型肝炎的治療》的相關標準。全部患者HBV DNA均為超過105

IU/ml，既往均未接受過核苷（酸）類似物、IFN抗病毒或免疫調節(jié)治療。排除標準：妊娠期或哺乳期婦女，重疊甲型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎或HIV感染患者，合并自身性免疫性疾病患者，腫瘤患者，合并酒精性肝病患者，合并脂肪肝患者，有其他嚴重全身性疾病患者。所有患者均對研究知情并簽署知情同意書。

二、方 法

使用日本強生公司AU640型全自動生化儀檢測生化指標。正常參考值范圍：ALT 0 ～ 50 U/L，

AST 0 ～ 50 U/L，總膽紅素0 ～ 20 μmol/L，凝血酶原活動度（PTA）75% ～ 100%，甲胎蛋白0 ～ 7 μg/L，

透明質酸0 ～ 100 μg/L，層粘連蛋白0 ～ 130 μg/L，

Ⅲ型前膠原0 ～ 130 μg/L，Ⅳ型膠原 0 ～ 85 μg/L。

HBV DNA采用熒光定量PCR法，由湖南圣湘生物科技有限公司提供試劑盒，檢測下限102 IU/ml。

HBV基因突變采用擴增阻滯突變系統(tǒng)技術（ARMS）聯(lián)合PCR檢測BCP區(qū)A1762T/G1764A雙位點變異及PC區(qū)G1896A變異，試劑盒由武漢百態(tài)基因有限公司提供，所有實驗步驟均嚴格按照試劑盒說明書操作。分析2組患者的一般資料及臨床特征，比較A1762T/G1764A及G1896A突變檢測結果的組間差異。

三、統(tǒng)計學處理

應用SPSS 13.0進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用t檢驗;不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）表示，組間比較采用秩和檢驗。計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、慢乙肝組和肝硬化組的一般資料及臨床特征比較

肝硬化組患者的年齡大于慢乙肝組，ALT、HBV DNA水平低于慢乙肝組，層粘連蛋白水平高于慢乙肝組（P均 < 0.05），見表1。

二、慢乙肝組和肝硬化組患者的A1762T/G1764A、G1896A突變檢測結果比較

肝硬化組患者A1762T/G1764A雙位點突變發(fā)生率高于慢乙肝組（P < 0.05），2組的G1896A突變發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），見表2。

討論

原發(fā)性肝癌在我國常見惡性腫瘤中高居第四位，其在腫瘤致死病因中也位列第三，HBV感染是導致肝癌最主要因素。肝癌發(fā)生機制有關病毒方面的因素包括：病毒基因型、病毒載量、病毒基因突變等[3-4]。

G1896A、A1762T/G1764A是HBV PC/BCP區(qū)中最常見的基因變異類型，其變異可使HBeAg的產量減少，引起HBV的免疫逃逸，使HBV在體內長期持續(xù)活躍復制，并加重肝炎病情[5]。既往研究指出，PC/BCP區(qū)基因突變與肝癌發(fā)生密切相關。與慢乙肝患者相比，肝癌患者G1896A、A1762T/G1764A突變率明顯增高[6]。然而，目前較少研究者關注G1896A、A1762T/G1764A突變與肝炎肝硬化間關系。為此，本研究通過比較慢乙肝組與肝硬化組患者PC/BCP突變發(fā)生率，初步探索PC/BCP區(qū)基因突變在乙肝患者病情進展中的作用。

本研究顯示，肝硬化組患者A1762T/G1764A突變率高于慢乙肝組患者，提示A1762T/G1764A突變參與慢乙肝發(fā)展至肝硬化過程，可能機制有：①免疫耐受因子HBeAg合成和分泌的減少，導致免疫逃逸，進而影響細胞毒性T淋巴細胞介導的肝細胞殺傷;②影響肝細胞內核心顆粒的轉運和包裝，大量衣殼蛋白在細胞內蓄積，由胞核型轉化為胞漿分布，可能增強細胞毒性T淋巴細胞的細胞毒活性，激發(fā)細胞因子釋放或抗體依賴性細胞毒活性;③改變被感染肝細胞表面HLA分子提呈的病毒衣殼蛋白組成，進而激發(fā)一系列的T淋巴細胞反應致肝細胞損傷加重[7]。既往研究顯示，A1762T/G1764A基因突變僅增加了肝硬化發(fā)生率，與肝癌發(fā)生無關[8]。本研究顯示肝硬化組患者A1762T/G1764A突變發(fā)生率高于慢乙肝組，A1762T/G1764A是否通過增加肝硬化發(fā)生率從而導致肝癌發(fā)生仍需進一步研究驗證。本研究亦提示，A1762T/G1764A基因突變與肝癌相關性的研究應在排除肝硬化混雜因素下進行。

G1896A可通過誘導終止密碼子產生從而減少HBeAg產生，盡管HBeAg產生減少，但HBV仍在活躍復制，進而加重慢乙肝患者病情[9]。既往研究顯示，肝癌患者G1896A突變發(fā)生率升高[6]。然而本研究顯示肝硬化組患者G1896A突變發(fā)生率與慢乙肝組比較差異無統(tǒng)計學意義，提示G1896A可能直接與肝癌發(fā)病機制相關，有關機制需要進一步研究證實，未來仍需要加大樣本量驗證。

綜上所述，乙肝肝硬化患者HBV PC/BCP區(qū)A1762T/G1764A突變率高于慢乙肝患者，A1762T/G1764A突變可能參與慢乙肝發(fā)展至肝硬化過程，具體機制仍需要進一步研究。本研究存在的不足之處：第一，樣本量偏小，未來仍需較大樣本進一步證實;第二，未對病毒進行基因型檢測，無法去除基因型混雜因素影響。

參 考 文 獻

[1] Chachá SGF， Gomes-Gouvêa MS， Malta FM， Ferreira SDC， Villanova MG， Souza FF， Teixeira AC， Passos ADDC， Pinho JRR， Martinelli ALC. Basal core promoter and precore mutations among hepatitis B virus circulating in Brazil and its association with severe forms of hepatic diseases. Mem Inst Oswaldo Cruz， 2017， 112（9）：626-631.

[2] Meier-Stephenson V， Bremner WTR， Dalton CS， van Marle G， Coffin CS， Patel TR. Comprehensive analysis of hepatitis B virus promoter region mutations. Viruses， 2018， 10（11）：603.

[3] Mukaida N， Nakamoto Y. Emergence of immunotherapy as a novel way to treat hepatocellular carcinoma. World J Gast-roenterol， 2018， 24（17）：1839-1858.

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[5] Hu F， Bi S， Yan H， Shi Y， Sheng J. Associations between hepatitis B virus basal core promoter/pre-core region mutations and the risk of acute-on-chronic liver failure： a meta-analysis. Virol J， 2015， 12：87.

[6] Wei F， Zheng Q， Li M， Wu M. The association between hepatitis B mutants and hepatocellular carcinoma： a meta-analysis. Medicine （Baltimore）， 2017， 96（19）：e6835.

[7] Tseng TC， Liu CJ， Yang HC， Chen CL， Yang WT， Tsai CS， Kuo SF， Verbree FC， Su TH， Wang CC， Liu CH， Chen PJ， Chen DS， Kao JH. Higher proportion of viral basal core promoter mutant increases the risk of liver cirrhosis in hepatitis B carriers. Gut， 2015，64（2）：292-302.

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[9] Kim H， Lee SA， Do SY， Kim BJ. Precore/core region mutations of hepatitis B virus related to clinical severity. World J Gastr-oenterol， 2016，22（17）：4287-4296.

（收稿日期：2019-10-25）

（本文編輯：林燕薇）