浙東地區(qū)耐多藥結(jié)核分枝桿菌耐藥特性及分子機(jī)制研究

石慶新 陸如岳 於青峰 涂茜 李蒿蒿 蔡鶯鶯 周秋菊 周凱 王冬蓮

[摘要] 目的 對(duì)浙東地區(qū)耐多藥結(jié)核分枝桿菌（MDR-TB）耐藥性及分子機(jī)制進(jìn)行研究，為治療耐多藥結(jié)核病提供理論依據(jù)。 方法 收集2018年1月～2019年12月浙江東部9家結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院臨床分離的結(jié)核分枝桿菌。采用比例法檢測(cè)異煙肼（INH）、利福平（RIF）、氧氟沙星（OFL）、鏈霉素（SM）、乙胺丁醇（EMB）、阿米卡星（AK）、對(duì)氨基水楊酸（PAS）、卷曲霉素（CM）和丙硫異煙胺（TH）對(duì)MDR-TB的耐藥性。通過基因芯片方法檢測(cè)耐多藥結(jié)核分枝桿菌rpoB、katG、inhA突變位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增OFL耐藥的MDR-TB的gyr耐藥基因并測(cè)序。 結(jié)果 耐多藥結(jié)核分枝桿菌對(duì)OFL、SM、EMB、AK、PSA、CM、TH、INH和RIF耐藥率分別為38.1%、54.8%、28.6%、11.9%、8.3%、9.5%、13.1%、100.0%和100.0%。耐多藥結(jié)核分枝桿菌的突變位點(diǎn)為rpoB 511（9例）、rpoB 513（3例）、rpoB 516（3例）、rpoB 526（25例）、rpoB 531（38例）、rpoB 533（2例），KatG 315（71例），inhA-15（4例），KatG 315與inhA-15同時(shí)突變（9例）。檢測(cè)到26株gyrA基因和2株gyrB基因發(fā)生突變，突變類型為Thr478Asn、Asn477Thr、Ala90Val、Ser91Pro、Asp94Ala、Asp94His、Asp94Asn和Asp94Gly。 結(jié)論 耐多藥結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥以rpoB基因531位點(diǎn)突變?yōu)橹?異煙肼耐藥以KatG基因315位點(diǎn)突變?yōu)橹?MDR-TB對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制以gyrA基因Ala90Val、Ser91Pro、Asp94Gly突變類型為主。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)核分枝桿菌;耐多藥;基因芯片;基因突變

[中圖分類號(hào)] R52? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2020）34-0005-04

[Abstract] Objective To study the drug resistance and molecular mechanism of multi-drug resistant mycobacterium tuberculosis（MDR-TB） in eastern Zhejiang province， and to provide theoretical basis for the treatment of MDR-TB. Methods Mycobacteria tuberculosis that were clinically isolated in 9 designated tuberculosis hospitals in eastern Zhejiang province from January 2018 to December 2019 were collected. The drug resistance of MDR-TB to isoniazid（INH）， rifampicin（RIF）， ofloxacin（OFL）， streptomycin（SM）， ethambutanol（EMB）， amikacin（AK）， para-aminosalicylic acid（PAS）， capreomycin（CM） and propyl thionisocyanamine（TH） was detected by the ratio method. The rpoB， katG and inhA mutation sites of MDR-TB were detected by the gene chip method. The gyr resistance gene of OFL-resistant MDR-TB was amplified by PCR and sequenced. Results The drug resistance rates of MDR-TB to OFL， SM， EMB， AK， PSA， CM， TH， INH and RIF were 38.1%， 54.8%， 28.6%， 11.9%， 8.3%， 9.5%， 13.1%， 100.0% and 100.0%， respectively. The mutational sites of MDR-MTB were rpoB 511（9 cases）， rpoB 513（3 cases）， rpoB 516（3 cases）， rpoB 526（25 cases）， rpoB 531（38 cases）， rpoB 533（2 cases）， KatG 315（71 cases）， inhA-15（4 cases）， KatG 315 and inhA-15 simultaneously（9 cases）. Mutations were detected in 26 gyrA genes and 2 gyrB genes， and the mutation types were Thr478Asn， Asn477Thr， Ala90Val， Ser91Pro， Asp94Ala， Asp94His， Asp94Asn and Asp94Gly. Conclusion The major mutation site of genes in MDR-TB resistant to rifampicin is rpoB 531. The major mutation site of genes in MDR-TB resistant to isoniazid is KatG 315. The resistance mechanism of MDRTB to quinolones is mainly gyrA gene Ala90Val， Ser91Pro and Asp94Gly mutations.

[Key words] Mycobacterium tuberculosis; MDR; Gene chip; Genetic mutation

耐多藥結(jié)核分枝桿菌（Multidrug resistant Mycobacterium tuberculosis，MDR-TB）對(duì)異煙肼和利福平同時(shí)耐藥[1]，其對(duì)一線藥物通常協(xié)同耐藥，常表現(xiàn)為多重耐藥，在臨床上耐多藥結(jié)核分枝桿菌治愈率低。中國是MDR-TB全球流行最嚴(yán)重的國家之一[2]。我國新疆地區(qū)MDR-TB患者治療2年的累積病死率高達(dá)45.9%[3]。因此MDR-TB預(yù)防和治療形勢(shì)非常嚴(yán)峻，已成為我國結(jié)核病防控的最大難題。為了解浙東地區(qū)MDR-TB耐多藥現(xiàn)狀，現(xiàn)對(duì)2018年和2019年臨床分離得到的MDR-TB藥物敏感性和分子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，為臨床治療耐多藥結(jié)核病方案提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株? 從2018年1月～2019年12月浙江東部9家結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院[臺(tái)州恩澤醫(yī)療中心（集團(tuán)）恩澤醫(yī)院、溫嶺市第一人民醫(yī)院、臺(tái)州市立醫(yī)院、臺(tái)州市第一人民醫(yī)院、仙居縣人民醫(yī)院、三門縣人民醫(yī)院、臨海市第一人民醫(yī)院、玉環(huán)市第一人民醫(yī)院和天臺(tái)縣人民醫(yī)院]收集臨床分離的1064株結(jié)核分枝桿菌。納入標(biāo)準(zhǔn)：來自以上幾家醫(yī)院的初診和復(fù)診結(jié)核患者首次分離出結(jié)核分枝桿菌（剔除重復(fù)分離的菌株），其中耐多藥結(jié)核分枝桿菌84株（7.9%）。

1.1.2 試劑與儀器? 固體比例法培養(yǎng)基噻吩-2-羧酸肼（Thiophene-2-carboxylic acid hydrazine，TCH）、對(duì)硝基苯甲酸（P-nitrobenzoic acid，PNB）、鏈霉素（Streptomycin，SM）、利福平（Rifampicin，RFP）、異煙肼（Isoniazid，INH））、乙胺丁醇（Ethambutol，EMB）、阿米卡星（Amikacin，AK）、氧氟沙星（Ofloxacin，OFL）、對(duì)氨基水楊酸（P-aminosalicylic acid，PAS）、丙硫異煙胺（Propylthioisonicotinamide，PTO）、卷曲霉素（Capreomycin，CM），均購于珠海貝索生物技術(shù)有限公司。液體培養(yǎng)試劑（美國BD公司）、分枝桿菌耐藥基因芯片檢測(cè)試劑（成都博奧生物科技有限公司）。MGIT960結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)儀（美國BD公司）、BIO-RAD T100TMPCR擴(kuò)增儀（美國Bio-Rad公司）、Extratocr 36DNA提取儀、BioMixerTMⅡ芯片雜交和LuxScan-10K/B 微陣列芯片掃描儀（北京博奧生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 設(shè)計(jì)引物? 根據(jù)參考文獻(xiàn)[4-5]設(shè)計(jì)引物，gyrA：P1 5'-CCGGATCGAACCGGTTGACAT-3'，P2 5'-GGGCT TCGGTGTACCTCAT-3';gyrB：P1 5'-AACACCGAGGT CAAATGGTT-3'，P2 5'-CTGAATGCCGTCTTCCTTG TTGT-3'。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 藥敏試驗(yàn)? 嚴(yán)格按照《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》使用液體藥敏培養(yǎng)法檢測(cè)1064株結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平和異煙肼敏感性。采用比例法對(duì)耐多藥結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行INH、RIF、SM、EMB、AK、OFL、PAS、TH、CM的藥敏試驗(yàn)和結(jié)果判讀。

1.2.3 耐多藥基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)? （1）核酸提?。杭尤?0 μL DNA提取液至提取EP管中，再加入20 μL 1.0麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙海湃牒怂崽崛x振蕩提取10 min，95℃金屬浴5 min，低溫12 000 r/min離心1 min。（2）核酸擴(kuò)增：將每個(gè)標(biāo)本提取的核酸進(jìn)行3管擴(kuò)增反應(yīng)，分別在每管加入1、2、3號(hào)擴(kuò)增試劑18 μL和2 μL的DNA模板。放入PCR儀中擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：37℃ 10 min;94℃ 10 min、94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 40 s進(jìn)行35個(gè)循環(huán);94℃ 30 s、72℃ 60 s進(jìn)行10個(gè)循環(huán);72℃ 420 s。（3）核酸雜交掃描：雜交的混合液95℃ 5 min，冰水浴5 min。吸出 13.5 μL混合液加入雜交芯片樣品孔中，置于50℃ BioMixerTMⅡ芯片雜交儀中雜交120 min。雜交結(jié)束后，洗滌芯片并甩干，放入LuxScan-10K/B微陣列芯片掃描儀讀取結(jié)果。（4）擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序：PCR擴(kuò)增體系：1 μL上下游引物（10 μmoL/L）、1 μL模板DNA（100 mg/L）、1.5 μL MgCl2（25 mmol/L）、2.5 μL10×ABI Buffer、0.125 μL ABI AmpliTaq（5 U/μL）、2 μL dNTP（2.5 mmol/L）、15.875 μL去離子水，合計(jì)共25 μL。擴(kuò)增條件：90℃預(yù)變性5 min;95℃ 30 s、60℃ 30 s、72 ℃ 45 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后放入ABl3730測(cè)序儀進(jìn)行雙向DNA序列測(cè)定，使用美國ABl3730自動(dòng)測(cè)序儀采用Sanger測(cè)序法對(duì)擴(kuò)增gyrA和gyrB基因片段進(jìn)行測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel 2010錄入檢測(cè)數(shù)據(jù)，通過Backlink轉(zhuǎn)換成Whonet文件，導(dǎo)入Whonet5.6軟件采用數(shù)值比例法對(duì)耐藥數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 初治組和復(fù)治組耐多藥患者對(duì)不同藥物的耐藥情況比較

對(duì)1064株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行耐多藥篩選，檢出84株耐多藥結(jié)核分枝桿菌，陽性率為7.9%;其中初治耐多藥結(jié)核分枝桿菌為14株（16.7%），復(fù)治耐多藥結(jié)核分枝桿菌為70株（83.3%）。84株耐多藥結(jié)核分枝桿菌對(duì)OFL的耐藥菌株有32株（38.1%）。見表1。

2.2 MDR-TB的katG、inhA和rpoB基因突變位點(diǎn)分布

基因芯片法檢測(cè)耐多藥結(jié)核分枝桿菌對(duì)INH藥物突變位點(diǎn)有3種類型，以katG 315位點(diǎn)為主，對(duì)RIF藥物常見的突變位點(diǎn)6種類型進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)rpoB 511、rpoB 513、rpoB 516、rpoB 526、rpoB 531、rpoB 533突變位點(diǎn)均有檢出。見表2、封三圖1。

2.3 喹諾酮耐藥gyr基因突變

對(duì)32株OFL耐藥的MDR-TB進(jìn)行g(shù)yr基因測(cè)序結(jié)果，檢到28株耐藥菌株發(fā)生了突變，其突變率為87.5%（28/32），其中g(shù)yrA基因Asp94Gly突變8株、Ser91Pro突變7例、Ala90Val突變6例、Asp94His突變2例、Asp94Ala突變2例、Asp94Asn突變1例;發(fā)現(xiàn)有2例gyrB基因發(fā)生突變，突變率為6.3%。見表3、封三圖2。

3 討論

目前，中國是世界結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，活動(dòng)性肺結(jié)核和耐多藥結(jié)核病患者例數(shù)均排在全球第三位。了解我國結(jié)核分枝桿菌耐多藥及突變位點(diǎn)的情況，對(duì)預(yù)防控制我國結(jié)核病的流行和傳播有非常重要的作用。申秀麗等[6]報(bào)道青海省耐多藥比例為30.93%，高于2010年全國第五次流行病學(xué)調(diào)查耐多藥比例的6.8%。本研究結(jié)果顯示，耐多藥結(jié)核分枝桿菌比例為7.9%，與余旭良等[7]報(bào)道的浙江衢州地區(qū)的耐多藥比例接近。本研究結(jié)果顯示，浙江省東部地區(qū)結(jié)核分枝桿菌的耐多藥比例接近全國平均水平，低于西部省份。可能由于中國東部沿海地區(qū)經(jīng)濟(jì)比較發(fā)達(dá)，新設(shè)備和新技術(shù)更易推廣，可縮短檢測(cè)時(shí)間，臨床醫(yī)生較早可根據(jù)檢測(cè)藥敏報(bào)告及時(shí)調(diào)整用藥方案，減少耐多藥結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生;同時(shí)人們受到的教育文化程度高，有較好的健康理念，也可減少結(jié)核病傳播。

RIF耐藥菌株的突變位置發(fā)生在rpoB81bp耐藥決定區(qū)（編碼密碼子507～533位），以531、526、516位點(diǎn)突變?yōu)橹鳌１狙芯繖z測(cè)耐多藥結(jié)核分枝桿菌對(duì)RIF主要突變位點(diǎn)為rpoB 531（53.3%）、526（29.7%）。國內(nèi)外研究表明，結(jié)核分枝桿菌RIF耐藥基因位點(diǎn)及突變率在不同地區(qū)存在一定的差異性[8-11]。這些位點(diǎn)的突變僅改變了自身氨基酸，使細(xì)菌部分結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響藥物與細(xì)菌結(jié)合，并未對(duì)自己造成損害。臨床檢測(cè)這些位點(diǎn)的突變，能夠快速有效地篩選出RIF耐藥的結(jié)核分枝桿菌。

本研究在INH耐藥菌株中檢測(cè)到katG和inhA兩個(gè)基因都發(fā)生了突變，產(chǎn)生三種的突變類型katG 315、inhA-15、katG 315和inhA-15兩位點(diǎn)同時(shí)突變，以katG 315為主要突變類型。與許榕青等[12]研究INH耐藥突變類型基本一致;同其他報(bào)道[13-14]有明顯差異，在這些研究中僅檢出一種或兩種突變類型。INH對(duì)結(jié)核分枝桿菌的耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，主要與烯酰脂酰載體蛋白還原酶inh A、katG酶、還原型輔酶脫氫酶NADH、烷基氫過氧化物還原酶oxyR、β-酮?；；\(yùn)載蛋白合成酶kasA和多基因的多位點(diǎn)突變有關(guān)[15]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[16]，約70%INH耐藥發(fā)生在katG 315的突變位點(diǎn)，315位點(diǎn)的氨基酸發(fā)生改變，katG基因編碼katG酶活性下降或喪失，結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生耐藥。inhA基因位點(diǎn)突變約占異煙肼耐藥菌株的5%～35%[17]。inhA基因編碼產(chǎn)生烯酰脂酰載體蛋白還原酶，編碼區(qū)-15位點(diǎn)發(fā)生突變，異煙肼與NADH酶的復(fù)合物的親合力減弱，僅inhA基因突變會(huì)引起異煙肼的低濃度耐藥，當(dāng)katG基因和inhA啟動(dòng)子區(qū)同時(shí)突變時(shí)，結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼耐藥性增強(qiáng)，提示兩者突變對(duì)耐藥有協(xié)同作用[15]。

氟喹諾酮類抗菌藥物是治療耐多藥肺結(jié)核核心藥物，如果出現(xiàn)耐藥將會(huì)影響結(jié)核病二線藥物給藥方案。耐多藥結(jié)核分枝桿菌對(duì)喹諾酮耐藥分子機(jī)制主要是gyr基因中耐藥決定區(qū)發(fā)生突變。本研究對(duì)32株OFL耐藥的MDRTB進(jìn)行g(shù)yr基因測(cè)序，檢測(cè)到28株（87.5%）耐藥菌株發(fā)生突變，與Rodwell等[18]報(bào)道結(jié)果相近。結(jié)核分枝桿菌喹諾酮藥物gyrA耐藥決定區(qū)突變位點(diǎn)在88～94位密碼子，最常見為94位密碼子Asp，可由Ala、His、Asn、Gly和Tyr等5種氨基酸替換Asp[19]。本研究也檢測(cè)到94位密碼子Asp被前四種氨基酸替換。Ala90Val、Ser91Pro和Asp94Gly密碼子突變是本地區(qū)gyrA主要突變類型。實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)到2株耐藥菌發(fā)生gyrB突變，gyrB突變發(fā)生率比gryA低得多，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[20]。相關(guān)研究表明，gyrB基因突變使喹諾酮藥物耐藥基因檢出率增加12.5%[21]。故gyrB基因的突變?cè)卩Z酮類藥物耐藥中不可忽略。

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（收稿日期：2020-09-01）