■劉莉莉 楊炳友

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040）

羊奶作為乳制品營(yíng)養(yǎng)豐富，消化吸收率高，是小孩、老人以及病人的重要營(yíng)養(yǎng)品，也是青壯年的保健品，然而我國(guó)畜牧業(yè)普遍存在產(chǎn)奶動(dòng)物奶產(chǎn)量低，奶中的乳蛋白含量和乳脂率不高等問(wèn)題，嚴(yán)重影響我國(guó)乳業(yè)的發(fā)展，故安全有效地增加產(chǎn)奶動(dòng)物的乳產(chǎn)量對(duì)于人們生活質(zhì)量的提高和我國(guó)乳業(yè)的發(fā)展有著重要意義。中藥源自天然，其資源豐富，可為泌乳動(dòng)物提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還可以發(fā)揮一定的藥理作用，其毒副作用小，用于增乳有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[1-2]。

漏蘆為菊科植物祁州漏蘆[Rhaponticum uniflo?rum (L.) DC.]的干燥根，具有清熱解毒、消癰、下乳、舒筋通脈的作用[3]。含有漏蘆的復(fù)方增乳中藥在臨床和畜牧業(yè)生產(chǎn)中具有一定的應(yīng)用[4-5]，但目前的研究多側(cè)重于其促進(jìn)產(chǎn)婦催乳及動(dòng)物泌乳的效果，而有關(guān)漏蘆對(duì)產(chǎn)奶動(dòng)物乳腺泌乳的調(diào)控機(jī)制研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道少。本實(shí)驗(yàn)探討漏蘆乙醇提取物對(duì)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞乳成分合成能力的影響以及其對(duì)乳成分合成代謝的影響，為中藥漏蘆對(duì)哺乳動(dòng)物泌乳調(diào)節(jié)機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

中藥漏蘆購(gòu)自黑龍江省藥材公司，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)于丹副教授鑒定為菊科藥用植物祁州漏蘆[Rhaponticum uniflorum (L.) DC.]的干燥根。奶山羊乳腺上皮細(xì)胞由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物化學(xué)教研室提供。優(yōu)質(zhì)胎牛血清、DMEM/F12 培養(yǎng)基，Gibco 公司生產(chǎn)；Lactose/D-Galactose (Rapid) Assay Kit，購(gòu)自Mega?zyme 公司；甘油三酯定量檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自普利萊基因技術(shù)公司；β-酪蛋白（CSN2）檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自Us?cn Life Science 公司；實(shí)時(shí)熒光試劑盒SYBR?Primx ExTaqTM，TaKaRa 公司生產(chǎn)；TRIzol，Invitrogen 公司生產(chǎn)；Prime ScriptTMRT reagent Kit，TaKaRa公司生產(chǎn)。

1.2 漏蘆乙醇提取物的制備

將祁州漏蘆切碎后，用90%乙醇回流提取2 h，共3次，合并濾液，經(jīng)減壓濃縮即得漏蘆乙醇提取物，得率為8.9%。使用前先用少量二甲基亞砜(DMSO)助溶，再用完全培養(yǎng)基配成實(shí)驗(yàn)所需濃度，過(guò)濾除雜除菌備用。

1.3 奶山羊乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)

采 用 生 長(zhǎng) 培 養(yǎng) 基（DMEM/F12 ＋10%FBS）于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞，每隔24 h更換培養(yǎng)基。

1.4 引物設(shè)計(jì)

使用Primer6.0 軟件設(shè)計(jì)各基因qRT-PCR 的上游、下游引物（見(jiàn)表1）。

表1 基因的qRT-PCR引物序列

1.5 漏蘆乙醇提取物對(duì)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞合成乳成分能力影響的檢測(cè)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的奶山羊乳腺上皮細(xì)胞接種于6 孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)，更換新鮮培養(yǎng)基，對(duì)照組細(xì)胞添加正常細(xì)胞培養(yǎng)基，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在添加正常細(xì)胞培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加不同劑量的漏蘆乙醇提取物（質(zhì)量濃度分別為25、50、100 μg/ml，藥物添加濃度根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)摸索而確定），每組5 個(gè)平行。漏蘆乙醇提取物作用奶山羊乳腺上皮細(xì)胞48 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，采用β-酪蛋白（CSN2）檢測(cè)試劑盒、Lactose/D-Galactose (Rapid) Assay Kit 和甘油三酯定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)乳腺上皮細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中β-酪蛋白、乳糖和甘油三酯含量。

1.6 漏蘆乙醇提取物對(duì)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞乳成分合成代謝影響的檢測(cè)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的奶山羊乳腺上皮細(xì)胞接種于6 孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)，更換新鮮培養(yǎng)基，對(duì)照組細(xì)胞添加正常細(xì)胞培養(yǎng)基，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在添加正常細(xì)胞培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加不同劑量的漏蘆乙醇提取物（質(zhì)量濃度分別為25、50、100 μg/ml），每組5 個(gè)平行。漏蘆乙醇提取物作用奶山羊乳腺上皮細(xì)胞48 h，收集乳腺上皮細(xì)胞，Trizol法提取乳腺上皮細(xì)胞中RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，利用qRT-PCR 技術(shù)檢測(cè)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞乳糖合成相關(guān)酶：己糖激酶Ⅱ（HKⅡ）和β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（β-1,4-GT）基因的mRNA表達(dá)水平；檢測(cè)乳蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)蛋白：E74-樣轉(zhuǎn)錄因子5（ELF5）、核糖體S6 激酶1（S6K1）基因的mRNA 表達(dá)水平；檢測(cè)甘油三酯合成關(guān)鍵酶：甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶（GPAT）、酰基甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶6（AG?PAT6）和二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶-1（DGAT1）基因的mRNA 表達(dá)水平[6]。各基因的qRT-PCR 結(jié)果采用2-ΔΔCT相對(duì)定量的方法（β-actin 基因?yàn)閰⒄栈颍┯?jì)算目的基因的mRNA表達(dá)豐度。

1.7 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（mean±SD）表示；采用SPSS 19.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 漏蘆乙醇提取物對(duì)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞合成乳成分能力的影響

采用25、50、100 μg/ml的漏蘆乙醇提取物處理奶山羊乳腺上皮細(xì)胞48 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，利用β-酪蛋白、乳糖和甘油三酯檢測(cè)試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)液中乳糖、β-酪蛋白和甘油三酯含量。結(jié)果如圖1～圖3 所示，與對(duì)照組相比，25、50、100 μg/ml的漏蘆乙醇提取物以濃度依賴的方式顯著提高奶山羊乳腺上皮細(xì)胞合成分泌主要乳成分β-酪蛋白、甘油三酯及乳糖的能力(P＜0.05)。

圖1 漏蘆乙醇提取物對(duì)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中β-酪蛋白含量的影響

2.2 漏蘆乙醇提取物對(duì)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞乳成分合成代謝的影響

采用25、50、100 μg/ml的漏蘆乙醇提取物處理奶山羊乳腺上皮細(xì)胞48 h，提取總RNA，熒光定量RTPCR 檢測(cè)乳蛋白、甘油三酯和乳糖合成相關(guān)酶和蛋白因子mRNA 的表達(dá)變化。結(jié)果如圖4～圖6 顯示，與對(duì)照組相比，25、50、100 μg/ml 的漏蘆乙醇提取物能以濃度依賴的方式顯著提高乳蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)蛋白ELF5、S6K1 基因的mRNA 表達(dá)水平（P＜0.05）（見(jiàn)圖4）。

圖2 漏蘆乙醇提取物對(duì)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中甘油三酯含量的影響

圖3 漏蘆乙醇提取物對(duì)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中乳糖含量的影響

圖4 漏蘆乙醇提取物對(duì)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白合成相關(guān)蛋白ELF5和S6K1基因mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，25、50、100 μg/ml 的漏蘆乙醇提取物能以濃度依賴的方式顯著上調(diào)甘油三酯合成關(guān)鍵酶GPAT、AGPAT6 和DGAT1 基因的mRNA 表達(dá)水平（P＜0.05）（見(jiàn)圖5）。

與對(duì)照組相比，25、50、100 μg/ml 的漏蘆乙醇提取物能以濃度依賴的方式顯著上調(diào)乳腺上皮細(xì)胞乳糖合成相關(guān)酶HKⅡ、β-1,4-GT基因的mRNA表達(dá)水平（P＜0.05）（見(jiàn)圖6）。

圖5 漏蘆乙醇提取物對(duì)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞甘油三酯合成關(guān)鍵酶GPAT、AGPAT6和DGAT1基因mRNA表達(dá)的影響

圖6 漏蘆乙醇提取物對(duì)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞乳糖合成相關(guān)酶HKⅡ和β-1,4-GT基因mRNA表達(dá)的影響

本研究表明漏蘆乙醇提取物能提高乳腺上皮細(xì)胞乳糖成分合成代謝相關(guān)酶（HKⅡ、β-1,4-GT）、甘油三酯合成關(guān)鍵酶（GPAT、AGPAT6 和DGAT1）和乳蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)蛋白（ELF5 和S6K1）的基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞乳糖、乳脂和乳蛋白的合成。

3 討論

哺乳動(dòng)物的乳汁主要含有乳蛋白、乳脂和乳糖等營(yíng)養(yǎng)成分，可為人類提供營(yíng)養(yǎng)和能量。研究發(fā)現(xiàn)一些中藥能加強(qiáng)乳腺代謝話動(dòng)，改善乳成分含量，提高乳品質(zhì)。毛智斌等[7]發(fā)現(xiàn)葎草黃酮能上調(diào)奶牛乳腺上皮細(xì)胞β-酪蛋白的表達(dá)量。Wan等[8]表明王不留行催乳活性物質(zhì)能提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞的活力和增殖能力，并能明顯促進(jìn)乳腺細(xì)胞β-酪蛋白的表達(dá)和乳糖的分泌。鄭濤等[9]給母鼠灌胃通草提取液，證實(shí)乳腺上皮細(xì)胞中β-酪蛋白及乳清蛋白mRNA 的表達(dá)顯著提高。本研究采用漏蘆乙醇提取物（25、50、100 μg/ml）作用奶山羊乳腺上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)漏蘆乙醇提取物能以濃度依賴的方式顯著提高乳腺上皮細(xì)胞合成分泌β-酪蛋白、甘油三酯及乳糖，表明漏蘆也能促進(jìn)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞乳成分的合成。

乳腺內(nèi)乳蛋白、乳脂及乳糖的生物合成過(guò)程需要多種酶、功能蛋白以及泌乳信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)分子的參與[10]。哺乳動(dòng)物乳腺乳蛋白的合成與JAK2/STAT5和mTOR 途徑密切相關(guān)。JAK2-STAT5a 是在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)乳蛋白合成的重要信號(hào)通路[11]，mTOR-S6K1是在翻譯水平調(diào)節(jié)乳蛋白合成的重要信號(hào)通路[12]，兩個(gè)通路共同發(fā)揮作用促進(jìn)乳蛋白的合成。ELF5是可以輔助STAT5 調(diào)控乳蛋白合成的潛在細(xì)胞因子，在泌乳期表達(dá)顯著上調(diào)，影響泌乳過(guò)程關(guān)鍵基因的表達(dá)[13]。ELF5 的表達(dá)也受到了STAT5 的調(diào)控，并能增加STAT5 的活性，調(diào)節(jié)乳腺上皮細(xì)胞的分化促進(jìn)泌乳[14]。mTOR 能夠促進(jìn)S6K1 磷酸化，增強(qiáng)含嘧啶基因mRNA的翻譯，進(jìn)而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成[15]。王不留行增乳活性成分能促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞ELF5基因的表達(dá)[16]。孟海洋等[17]研究發(fā)現(xiàn)王不留行能上調(diào)奶牛乳腺上皮細(xì)胞p-STAT5、p-mTOR 和S6K1 蛋白的表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明漏蘆乙醇提取物能促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)蛋白ELF5 和S6K1 基因的mRNA表達(dá)水平，推測(cè)漏蘆提取物在乳蛋白合成過(guò)程中可能通過(guò)提高ELF5 的表達(dá)，進(jìn)一步增強(qiáng)STAT5的活性，并且漏蘆提取物可能經(jīng)過(guò)一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活p-mTOR，進(jìn)而激活其下游的S6K1，從而促進(jìn)乳蛋白質(zhì)的合成。

甘油三酯（TAG）是乳脂中最主要的脂類物質(zhì)（大于95%），TAG在乳腺上皮細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成，來(lái)自從頭合成途徑的脂酰輔酶A和外源攝取的FA被酯化到甘油-3-磷酸骨架上形成TAG[18]。GPAT、AGPAT6、LPIN1、DGAT1等參與催化甘油三酯的合成[19]，這些酶也是乳腺中參與脂肪合成的關(guān)鍵酶[20]。GPAT能催化甘油-3-磷酸sn-1 位點(diǎn)的酯化，AGPAT 催化sn-2 位點(diǎn)酯化，DGAT 位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，對(duì)于甘油三酯合成來(lái)說(shuō)它是一種特殊的酶，DGAT 被認(rèn)為可能也是甘油三酯合成的限速酶[21]。丁月云[22]研究發(fā)現(xiàn)用中草藥黃芪、王不留行作用奶牛乳腺上皮細(xì)胞后，細(xì)胞中脂滴數(shù)量增多，體積較大且分布較密。本研究表明漏蘆乙醇提取物能提高乳腺上皮細(xì)胞甘油三酯合成關(guān)鍵酶GPAT、AGPAT6和DGAT1基因的mRNA表達(dá)水平，說(shuō)明漏蘆可能通過(guò)正向調(diào)節(jié)甘油三酯合成關(guān)鍵酶的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞對(duì)甘油三酯的合成與分泌。

乳糖是乳中唯一的糖類，乳糖的生物合成是泌乳乳腺腺泡上皮細(xì)胞特有的功能，在高爾基體內(nèi)進(jìn)行。HKⅡ主要催化葡萄糖進(jìn)入合成途徑代謝，葡萄糖被HKⅡ磷酸化為6-磷酸葡萄糖，繼而通過(guò)葡萄糖-6-磷酸變位酶轉(zhuǎn)化為葡萄糖-1-磷酸，在三磷酸尿苷(UTP)的作用下生成二磷酸尿苷(UDP)-葡萄糖進(jìn)而生成一分子的UDP-半乳糖，葡萄糖和UDP-半乳糖在乳糖合成酶催化下合成乳糖[23]。乳糖合成酶由β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（β-1,4-GT）及必需輔助因子α-乳白蛋白（α-LA）組成，其中β-1,4-GT 是乳糖合成酶的催化亞基，控制著乳糖合成的效率[24]。劉杰等[25]利用甲珠和蒲公英水煎劑作用于奶牛乳腺上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)甲珠、蒲公英均能明顯上調(diào)乳腺上皮細(xì)胞對(duì)乳糖的分泌，并呈一定的劑量依賴效應(yīng)。馬震珠[26]也發(fā)現(xiàn)一定劑量的通草、冬葵子和王不留行能提高奶山羊奶樣中乳糖的含量。本研究利用漏蘆乙醇提取物體外作用奶山羊乳腺上皮細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)乳腺細(xì)胞乳糖合成關(guān)鍵酶HKⅡ和β-1,4-GT 的mRNA 表達(dá)的影響，以反映漏蘆對(duì)乳糖合成的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明漏蘆乙醇提取物能提高HKⅡ和β-1,4-GT的基因表達(dá)，初步說(shuō)明漏蘆通過(guò)促進(jìn)乳糖合成關(guān)鍵酶的表達(dá)，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)乳腺細(xì)胞乳糖合成代謝。

4 結(jié)論

本研究表明，漏蘆乙醇提取物能促進(jìn)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞合成分泌β-酪蛋白、甘油三酯和乳糖；漏蘆乙醇提取物能提高乳腺上皮細(xì)胞乳成分合成代謝相關(guān)酶和蛋白的基因表達(dá)，進(jìn)而影響奶山羊乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白、乳脂和乳糖的合成。