楊家敏 李驚雷

結(jié)腸癌是世界上第三大常見癌癥，癌預(yù)后一般較差，5年總體生存率低于5%，這種低生存率主要是由于診斷較晚以及缺乏有效的非手術(shù)治療方法[1]。尋找更好的藥物治療這種致命的腫瘤是迫切需要的。癌細(xì)胞對化療藥物反應(yīng)的一個(gè)關(guān)鍵因素是細(xì)胞凋亡通路的激活，而這種通路在抗化療的癌細(xì)胞中經(jīng)常受損[2]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路緊密調(diào)控細(xì)胞存活與凋亡的平衡，Akt是PI3K的下游效應(yīng)因子，引起腫瘤細(xì)胞存活/抑制凋亡，在不同凋亡信號的刺激下通過磷酸化誘導(dǎo)下游靶點(diǎn)刺激血管生成[3,4]。因此，Akt信號正成為癌癥化療和治療的一個(gè)有希望的靶點(diǎn)。阿帕替尼是一種新型的血管內(nèi)皮生長因子2(VEGFR2)酪氨酸激酶高選擇性抑制劑，可以顯著抑制腫瘤組織中新生血管的生產(chǎn)，其結(jié)合親和力是索拉非尼的10倍以上[5]。通過Ⅲ期臨床試驗(yàn)證明，阿帕替尼是惟一有效的晚期胃癌患者治療藥物，且沒有化療適應(yīng)證[6]。同時(shí)，在多個(gè)Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，阿帕替尼中對多種腫瘤顯示出了很好的治療效果[7]。但我們對該藥物分子機(jī)制的了解仍然有限，尚不清楚阿帕替尼是否對腸癌有抗腫瘤作用。因此，本研究探討甲磺酸阿帕替尼通過PI3K/Akt信號通路對HCT-116細(xì)胞增殖/凋亡的影響，探討甲磺酸阿帕替尼對腸癌的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用甲磺酸阿帕替尼治療腸癌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心昆明細(xì)胞庫，中國)；甲磺酸阿帕替尼片(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，中國)；胎牛血清(Gibco公司，美國)；RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國)；0.25%胰蛋白酶(天津百賽思試劑公司，中國)；青鏈霉素溶液和胰酶(Corning公司，美國)；四噻唑藍(lán)(MTT)(Amresco公司，美國)；細(xì)胞凋亡檢測AnnexinV/PI試劑盒(BD公司，美國)；蛋白抽提試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，中國)；鼠抗PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax和Caspase-3單克隆抗體(Santa Cruz公司，美國)；鼠抗GADPH單克隆抗體和辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國)；聚偏乙稀二氟膜(PVDF膜)(Millipore公司，美國)；ECL化學(xué)發(fā)光液(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，中國)；高速低溫離心機(jī)(Sigma，美國)；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Ther-mo Revco，美國)；倒置顯微鏡(Nikon公司，日本)；HBS-1096B酶標(biāo)儀(南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，中國)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀和流式細(xì)胞儀(BD公司，美國)；凝膠成像儀(UVP公司，美國)；BIO-RAD垂直電泳儀(BIO-RAD公司，美國)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 用含胎牛血清(10%)和青鏈霉素(100 U/L)的RPMI-1640培養(yǎng)液在在37℃、5% CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)HCT-116細(xì)胞，隔天換液，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到80%左右時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、阿帕替尼低劑量組、阿帕替尼中劑量組、阿帕替尼高劑量組?？瞻讓φ战M和阿帕替尼低、中、高劑量組分別給予終濃度為0、1、2、4 μmol/L的甲磺酸阿帕替尼，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖率 按照1.2方法處理細(xì)胞，消化后以5×103孔接種于96孔板中，200 μl/孔，待細(xì)胞融合后加入MTT 50 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄上清，加入DMSO 200 μl/孔，振蕩，檢定吸光度值(OD值)，計(jì)算細(xì)胞增殖率[細(xì)胞增殖率=(試驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測 按照1.2方法處理細(xì)胞，消化后轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，離心棄上清，用1×Binding buffer調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，根據(jù)細(xì)胞凋亡檢測AnnexinV/PI試劑盒說明書步驟用流失細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.5 Western Blot法檢測 PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平按照1.2方法處理細(xì)胞，消化后轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，離心棄上清，根據(jù)細(xì)胞量加入胞蛋白抽提試液，裂解2 h；離心取上清，進(jìn)行蛋白定量；調(diào)整蛋白濃度，加入1/5體積的5×Buffer，沸水進(jìn)行變性，-80℃保存?zhèn)溆?。進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育一抗、孵育二抗，采集圖像，對免疫印跡條帶灰度值并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 甲磺酸阿帕替尼對HCT-116細(xì)胞增殖的影響 與空白對照組比較，給予甲磺酸阿帕替尼處理后，HCT-116細(xì)胞增殖率降低，且隨著甲磺酸阿帕替尼劑量增加，細(xì)胞增殖率降低越顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1，圖1。

組別細(xì)胞增殖率(%)空白對照組100.00±4.61阿帕替尼低劑量組92.45±8.24?阿帕替尼中劑量組81.03±4.96?#阿帕替尼高劑量組53.00±5.92?#△

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與阿帕替尼低劑量組比較，#P<0.05；與阿帕替尼中劑量組比較，△P<0.05

空白對照組

阿帕替尼低劑量組

阿帕替尼中劑量組

阿帕替尼高劑量組

圖1 甲磺酸阿帕替尼對HCT-116細(xì)胞增殖的影響

2.2 甲磺酸阿帕替尼對HCT-116細(xì)胞PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)的影響 與空白對照組比較，給予甲磺酸阿帕替尼處理后，HCT-116細(xì)胞PI3K和Akt表達(dá)變化不顯著，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；p-PI3K和p-Akt表達(dá)降低，且隨著甲磺酸阿帕替尼劑量增加，降低越顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2，圖2。

組別PI3Kp-PI3KAktp-Akt空白對照組0.81±0.081.10±0.040.70±0.101.32±0.17阿帕替尼低劑量組0.88±0.140.94±0.13?0.64±0.081.06±0.09?阿帕替尼中劑量組0.85±0.150.76±0.05?#0.74±0.180.87±0.16?#阿帕替尼高劑量組0.91±0.080.31±0.02?#△0.78±0.240.39±0.05?#△

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與阿帕替尼低劑量組比較，#P<0.05；與阿帕替尼中劑量組比較，△P<0.05

空白對照組阿帕替尼低劑量組阿帕替尼中劑量組阿帕替尼高劑量組

圖2 甲磺酸阿帕替尼對人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞凋亡的影響

2.3 甲磺酸阿帕替尼對HCT-116細(xì)胞凋亡的影響 與空白對照組比較，給予甲磺酸阿帕替尼處理后，HCT-116細(xì)胞凋亡率增加，且隨著甲磺酸阿帕替尼劑量增加，細(xì)胞凋亡率增加越顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3，圖3。

組別細(xì)胞凋亡率(%)空白對照組0.54±0.03阿帕替尼低劑量組8.16±0.51?阿帕替尼中劑量組10.37±1.53?#阿帕替尼高劑量組15.07±2.46?#△

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與阿帕替尼低劑量組比較，#P<0.05；與阿帕替尼中劑量組比較，△P<0.05

圖3 甲磺酸阿帕替尼對HCT-116細(xì)胞PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)的影響；A:空白對照組，B:阿帕替尼低劑量組，C:阿帕替尼中劑量組，D:阿帕替尼高劑量組

2.4 甲磺酸阿帕替尼對HCT-116細(xì)胞Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 與空白對照組比較，給予甲磺酸阿帕替尼處理后，HCT-116細(xì)胞Bcl-2表達(dá)降低、Bax和Caspase-3表達(dá)增加，且隨著甲磺酸阿帕替尼劑量增加，Bcl-2表達(dá)降低越顯著、Bax和Caspase-3表達(dá)增加越顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4，圖4。

組別Bcl-2BaxCaspase-3空白對照組1.51±0.140.13±0.020.20±0.05阿帕替尼低劑量組0.94±0.14?0.25±0.05?0.67±0.10?阿帕替尼中劑量組0.42±0.06?#0.36±0.04?#1.28±0.17?#阿帕替尼高劑量組0.24±0.03?#△0.87±0.16?#△2.79±0.42?#△

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與阿帕替尼低劑量組比較，#P<0.05；與阿帕替尼中劑量組比較，△P<0.05

圖4 甲磺酸阿帕替尼對HCT-116細(xì)胞Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)的影響；A:空白對照組，B:阿帕替尼低劑量組，C:阿帕替尼中劑量組，D:阿帕替尼高劑量組

3 討論

甲磺酸阿帕替尼用于治療復(fù)發(fā)性進(jìn)展期胃腺癌和胃食管交界腺癌[8]。此外，甲磺酸阿帕替尼對非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、肝癌和直腸癌的治療效果目前正在臨床試驗(yàn)中[9]。研究證實(shí)，甲磺酸阿帕替尼能夠抑制卵巢癌A2780細(xì)胞增殖[10]。研究甲磺酸阿帕替尼抑制HCT-116細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制，可以更好開發(fā)甲磺酸阿帕替尼的藥用價(jià)值。

PI3K/Akt信號通路在細(xì)胞增殖/凋亡過程中發(fā)揮重要作用，由多種細(xì)胞因子調(diào)控，參與包括人第10號染色體缺失的磷酸酶(PTEN)在內(nèi)的負(fù)調(diào)控作用[11]。PI3K是磷脂酰肌醇和肌醇的重要激酶，PI3K可以被細(xì)胞表面的受體激活形成p-PI3K,p-PI3K可以激活A(yù)kt等下游效應(yīng)因子，將各種生長因子和細(xì)胞因子的信號傳遞給細(xì)胞[12]。研究表明，在多種人類惡性腫瘤中，Akt信號元件經(jīng)常發(fā)生改變[13]。Akt通過抑制凋亡來促進(jìn)細(xì)胞存活，而其磷酸化被認(rèn)為是結(jié)腸癌侵襲性的關(guān)鍵因素，因此，阻斷Akt活性的策略在理想情況下會導(dǎo)致細(xì)胞增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)[14]。研究表明，多酚可能調(diào)節(jié)Akt通路誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，通過抑制Akt的磷酸化，使p-Akt的表達(dá)減少，促進(jìn)凋亡過程的進(jìn)程。PI3K激活下游靶點(diǎn)Akt，介導(dǎo)生物效應(yīng)[15]。本研究結(jié)果顯示，甲磺酸阿帕替尼可以抑制PI3K和Akt的磷酸化，減少p-PI3K和p-Akt的表達(dá)。

磷酸化Akt可以作用于Bcl-2家族和caspase家族的蛋白，抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞過度生長和增殖[16]。Bcl-2作為一種抗凋亡蛋白，在凋亡信號通路中起著關(guān)鍵作用，Bcl-2可以抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖[17]。在一些人類腫瘤中發(fā)現(xiàn)了高水平的Bcl-2表達(dá)，并且Bcl-2表達(dá)水平與惡性腫瘤的侵襲性相關(guān)[18]。Bax和Bcl-2屬于同一個(gè)家族，Bax作為促凋亡蛋白，與Bcl-2功能相反，Bax不僅拮抗Bcl-2對細(xì)胞凋亡的抑制作用，而且直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[19]。Caspase-9是線粒體凋亡通路的關(guān)鍵因子，活化的Caspase-9可以進(jìn)一步激活下游的Caspase-3，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡[20]。本研究也證實(shí)了甲磺酸阿帕替尼可以抑制HCT-116細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)了Bax和caspase-9的表達(dá)，驗(yàn)證了甲磺酸阿帕替尼誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，甲磺酸阿帕替尼可能通過抑制PI3K/Akt信號通路，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)Bax和caspase-9的表達(dá)，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)結(jié)腸癌凋亡，為甲磺酸阿帕替尼治療結(jié)腸癌提供了理論依據(jù)。