楊曉輝，蔡慧珍，汪 嶺，趙 聰

（寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，寧夏銀川 750004）

0 引言

原花青素（Proanthocyanidins，PC）作為一種自然界存在的黃酮類聚合物［1］，又名縮合鞣質(zhì)，廣泛存在于植物界和食品中，具有很強的生物活性［2］，且安全性高。原花青素被認(rèn)為是目前清除體內(nèi)自由基最為有效的天然抗氧化成分之一［3］，具有抗氧化、降低血脂、降低血糖、抗癌、免疫調(diào)節(jié)等多種功效［4］，并有防止心血管疾病、抗輻射、防血小板凝結(jié)等作用［5-6］。因此，原花青素在藥品、保健品、食品及化妝品等多領(lǐng)域應(yīng)用廣泛［7］。目前關(guān)于原花青素的研究也卓有成效，但大多是關(guān)于原花青素的提取、結(jié)構(gòu)及生理活性的研究，原花青素在體內(nèi)的吸收和代謝過程的研究還需要進一步深入［8］。

經(jīng)研究表明：“黑美人”馬鈴薯原花青素含量較高，其營養(yǎng)價值比普通馬鈴薯高［9］。筆者經(jīng)過試驗發(fā)現(xiàn)，“黑美人”馬鈴薯中原花青素在大鼠血清、尿液、糞便中均有不同含量的存在，且灌胃天數(shù)不同，其含量差異較大，但其在體內(nèi)的吸收和代謝過程尚不明確。本研究將采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，LC-MS）技術(shù)對“黑美人”馬鈴薯原花青素給藥大鼠不同給藥天數(shù)的尿液和糞便中代謝產(chǎn)物進行分析，研究“黑美人”馬鈴薯原花青素的主要代謝產(chǎn)物及其動態(tài)變化規(guī)律，探討“黑美人”馬鈴薯原花青素的代謝特征，為“黑美人”馬鈴薯原花青素體內(nèi)代謝機制探索提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 實驗動物

成年SD大鼠20只（雌雄各半）。

1.2 儀器與試劑

Rapid Trace SPE自動固相萃取儀（瑞典Biotage AB公司）；1100液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）；九陽料理機（JYL-C012-九陽股份有限公司）；高速離心機（Neofuge15R-上海力申科學(xué)儀器有限公司）；數(shù)控超聲波系統(tǒng)（KQ-100DE-昆山市超聲儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

“黑美人”馬鈴薯；原花青素標(biāo)準(zhǔn)品（95%）（北京上立方聯(lián)合化工技術(shù)研究院）；乙酸乙酯；無水乙醇；甲酸；乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。

1.3“黑美人”馬鈴薯原花青素的制備

將“黑美人”馬鈴薯洗凈、晾干，用榨汁機制成勻漿，精確稱取100.0 g于燒杯中，依照料液比例1∶7.5（W/V）加入75%的乙醇溶液，并在60℃超聲波儀中提取30 min。將提取后的溶液在離心沉降器上以轉(zhuǎn)速為1 000～3 000 rpm遞增的速度離心5 min，將上清液進行真空抽濾，揮發(fā)除去揮發(fā)性萃取劑，并使用AB-8大孔吸附柱分離和純化，得到原花青素粉末。

1.4 樣本采集與前處理

1.4.1 樣本采集

將成年SD大鼠隨機分為實驗組和對照組（實驗組和對照組分別分成1，2，3，5，7 d組，每組雌雄各半）。實驗組給予“黑美人”馬鈴薯原花青素的提取物，以150 mg/（kg·d）的劑量灌胃給藥，對照組給予相應(yīng)劑量的生理鹽水，分別灌胃給藥1，2，3，5，7 d，管飼量為大鼠體重的1%，每日上午十點左右灌胃，其他飲食保持正常，將大鼠放在代謝籠中單籠喂養(yǎng)。分別收集1，2，3，5，7 d組大鼠的排泄物（尿液、糞便），清晰標(biāo)記，并保存在-80℃的冰箱中。

1.4.2 樣本的提取與凈化

分別精確稱量不同天數(shù)的SD大鼠尿液1.0 mL置于試管中，按照1∶9（V∶V）加入75%的乙醇溶液，于60℃超聲波提取1 h，離心取上清液；取不同給藥天數(shù)的SD大鼠糞便，研磨成粉末，分別稱取1.0 g，按1∶9（W∶V）加入75%的乙醇溶液，并在60℃超聲波儀中提取1 h，離心取上清液。上述各組上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，乙酸乙酯萃取后溶于30%乙醇中，將其轉(zhuǎn)移至已活化的C18固相萃取小柱中純化，收集樣液，于0.25μm有機微孔濾膜進行過濾，進行HPLCMS分析。

1.5 液相色譜-質(zhì)譜條件

LC條件：色譜柱為Zorbax Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B）。洗脫梯度（0～10 min，A 5%～10%；10～20 min，A 10%～15%；20～30 min，A 15%～20%；30～40 min，A 20%～40%；40～50 min，A 40%～60%）；流速1 mL/min；檢測波長280 nm；柱溫45℃。

ESI-MS條件：采用電噴霧離子源（ESI）電離，負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)，孔壓－30 V；霧化壓力4 kV；氣體流速20 mL/min；離子源溫度325℃；質(zhì)譜離子掃描范圍100～1 200 m/z。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以X±S表示，由Origin8.0軟件進行分析，組間差異表現(xiàn)為P＜0.05和P＜0.01。

2 結(jié)果與討論

2.1 大鼠尿液中代謝產(chǎn)物及動態(tài)分析

在1.5所述條件下，將純化后1，2，3，5，7 d對照組和實驗組給藥大鼠尿液中原花青素的代謝產(chǎn)物進行LC-MS分析，總離子流如圖1所示。結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間和質(zhì)譜信息分析表明，在實驗組的尿液代謝產(chǎn)物中有（-）-表兒茶素（產(chǎn)物Ⅰ）、表兒茶素芐硫醇（產(chǎn)物Ⅱ）和m-香豆酸（產(chǎn)物Ⅲ），且三者含量在給藥1，2，3 d有明顯差別（如圖2所示），然而，3種化合物在對照組的尿液代謝產(chǎn)物中未檢測到。根據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析，實驗組給藥3 d后SD大鼠尿液中代謝產(chǎn)物的響應(yīng)值最高，3 d后大鼠代謝趨于穩(wěn)定，但都和對照組尿液的檢出值存在顯著性差異（P＜0.01）。

圖1 實驗組（a）和對照組（b）給藥3d后尿液代謝產(chǎn)物的LC-MS總離子流

圖2 實驗組大鼠給藥前后7 d尿液代謝產(chǎn)物的含量變化

筆者在前期的實驗中發(fā)現(xiàn)，“黑美人”馬鈴薯原花青素主要是由表兒茶素結(jié)構(gòu)單元組成的原花青素聚合物，本實驗中，尿液中原花青素的代謝產(chǎn)物（-）-表兒茶素和表兒茶素芐硫醇的濃度先升高后逐漸平穩(wěn)，這可能是由于在開始給藥時動物對外源物質(zhì)的耐受性較差以及體內(nèi)酚類物質(zhì)的代謝酶活性沒有被完全激活，隨著原花青素被利用的程度逐漸增加，代謝產(chǎn)生的酚類化合物的含量相應(yīng)增加。m-香豆酸是由腸道微生物群降解黃烷醇產(chǎn)生的重要酚酸，具有多種抗氧化和抗炎活性，因此，原花青素可以通過增加尿液中酚類物質(zhì)的排泄來增加尿液的抗氧化活性，進而對整個尿路的免疫機能產(chǎn)生正面影響［10］。

2.2 大鼠糞便中代謝產(chǎn)物及動態(tài)分析

在1.5所述條件下，將純化后1，2，3，5，7 d的對照組和實驗組給藥大鼠糞便中原花青素的代謝產(chǎn)物進行LC-MS分析，總離子流如圖3所示。結(jié)合標(biāo)品的保留時間和質(zhì)譜信息分析表明，實驗組的糞便代謝產(chǎn)物中仍然有表兒茶素芐硫醇（化合物Ⅱ）和m-香豆酸（化合物Ⅲ）存在，但其含量低于尿液，未檢出化合物（-）-表兒茶素。糞便中表兒茶素芐硫醇和m-香豆酸含量在給藥1，2 d有明顯差別（見圖4），在對照組的糞便代謝產(chǎn)物中未檢測到這兩種化合物。根據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析，實驗組給藥2 d后SD大鼠糞便中二種代謝產(chǎn)物的響應(yīng)值最高，3 d后SD大鼠的代謝趨于穩(wěn)定，但都和對照組糞便的檢出值存在顯著性差異（P＜0.01）?！昂诿廊恕瘪R鈴薯原花青素通過糞便排泄的代謝產(chǎn)物主要有兩種，不僅遠(yuǎn)沒有尿液排泄的復(fù)雜途徑，并且含量均較低。

圖3 實驗組（a）和對照組（b）給藥2 d后糞便代謝產(chǎn)物的LC-MS總離子流

圖4 實驗組大鼠給藥前后7 d糞便代謝產(chǎn)物的含量變化

3 結(jié)語

“黑美人”馬鈴薯原花青素在SD大鼠尿液和糞便中的排泄及其作用與代謝途徑密切相關(guān)。本研究采用LC-MS法對“黑美人”馬鈴薯原花青素給藥SD大鼠不同給藥天數(shù)的尿液和糞便中代謝產(chǎn)物進行分析，篩選出表兒茶素芐硫醇和m-香豆酸為主要代謝成分，并研究其動態(tài)變化，為“黑美人”馬鈴薯原花青素的體內(nèi)代謝機制探索提供依據(jù)。