陳 宏 張 偉 蘇玉明 李 全 陳 群宋倩男 王昕宇 李美蓄 張 菁 劉 征

(1 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒一科，哈爾濱市 150040，電子郵箱：chenhong667788@163.com；2 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱市 150040；3 黑龍江省哈爾濱市阿城區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，哈爾濱市 150300)

哮喘是臨床常見病、多發(fā)病,其患病率和病死率一直呈逐年增高的趨勢(shì)[1]，近年來(lái)一直是國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。哮喘不僅可造成患者日常活動(dòng)受限，而且會(huì)導(dǎo)致患者的情緒、心理和社會(huì)功能等多方面的損害，對(duì)患者的健康構(gòu)成嚴(yán)重的威脅[2]。由于臨床研究受倫理學(xué)的限制，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探索有效治療變應(yīng)性哮喘的可行方法，具有重要的臨床指導(dǎo)意義[3]。本研究選擇SD大鼠作為研究對(duì)象，探討補(bǔ)益肺腎湯對(duì)哮喘大鼠氣道炎癥反應(yīng)的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠112只，7～8周齡，體重(200±10)g。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(23±2)℃，濕度50%，自動(dòng)光控12 h/12 h明暗周期(開燈時(shí)間為8：00 AM，關(guān)燈時(shí)間為8：00 PM)，光照強(qiáng)度適中(約為100 lx)，動(dòng)物可自由獲取食物、水和活動(dòng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的篩選及分組 將SD大鼠放于自制的密閉玻璃箱內(nèi)，超聲霧化0.5%的磷酸組胺鹽生理鹽水溶液刺激大鼠，觀察大鼠吸入組胺后的呼吸變化情況，選擇吸入組胺后20 s內(nèi)出現(xiàn)呼吸急促，前肢縮抬，點(diǎn)頭或腹式呼吸等哮喘癥狀的大鼠作為試驗(yàn)用鼠。共篩選出105只大鼠，將其按照隨機(jī)數(shù)字表法分為7組，包括正常對(duì)照組、模型組、生理鹽水組、補(bǔ)益肺腎湯高劑量組、補(bǔ)益肺腎湯中劑量組、補(bǔ)益肺腎湯低劑量組、異丙腎上腺素組，每組15只。

1.3 主要藥物、試劑及儀器

1.3.1 藥物：補(bǔ)益肺腎湯藥方組成包括黃芪20 g、丹參15 g、太子參15 g、麥冬15 g、五味子10 g、陳皮10 g、姜半夏10 g、川貝母8 g、炒蘇子8 g、烏梅15 g、地龍10 g、磁石8 g、補(bǔ)骨脂8 g、紫河車8 g、桃仁8 g、瓜蔞仁10 g。將上述藥物在實(shí)驗(yàn)室制成煎劑，經(jīng)蒸餾水常規(guī)煎煮分別濃縮至每毫升含0.5、1.0、2.0 g生藥(分別對(duì)應(yīng)低、中、高劑量)，4℃保存?zhèn)溆?，使用時(shí)可稍加熱。異丙腎上腺素(國(guó)藥準(zhǔn)字：H31022037)購(gòu)自上海大眾藥業(yè)有限公司。

1.3.2 試劑：卵清蛋白、伊文思藍(lán)均為美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)，吸附無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗為武漢生物制品研究所生產(chǎn)，生理鹽水，乙醚、丙酮、結(jié)晶氯化鋁為上海蘇燃化學(xué)試劑公司生產(chǎn)，氫氧化鈉為天津科密歐化學(xué)試劑公司生產(chǎn)，大鼠卵清蛋白特異性IgE試劑盒為美國(guó)R&D公司生產(chǎn)。IgE、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-2、IL-4、IL-5和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)定量夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海西唐生物有限公司，核因子κB免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3.3 儀器：ELX 800UV型酶標(biāo)儀為美國(guó)Bio-Tek公司生產(chǎn)；LRH-250A型生化培養(yǎng)箱為廣東省醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；UV9600型紫外/可見光分光光度計(jì)為北京瑞麗分析儀器公司生產(chǎn)。

1.4 動(dòng)物模型建立方法

1.4.1 氫氧化鋁凝膠的配制：(1)稱取精制明礬50 g，加入蒸餾水500 mL，加熱攪拌使之完全溶解；稱取氫氧化鈉14 g，加入蒸餾水84 mL；(2)稱取酚酞0.01 g，加入95%酒精1 mL配制成1%的酚酞酒精溶液；(3)稱取氯化鋇，加入蒸餾水配置成10%的氯化鋇溶液；(4)向明礬溶液中加入配好的1%的酚酞酒精溶液0.4 mL；(5)將配制好的氫氧化鈉溶液緩慢地加入明礬溶液中，此時(shí)會(huì)有大量絮狀沉淀析出，在加入氫氧化鈉溶液的過(guò)程中要不斷地?cái)噭?dòng)，直至混合液為紅色并不再消失為止，然后任其自然沉淀；(6)當(dāng)沉淀物占總體積一半后，棄去上清溶液，用蒸餾水加至原體積，并攪拌均勻，此過(guò)程重復(fù)3次，反復(fù)洗滌沉淀兩次后收集，即得氫氧化鋁凝膠。

1.4.2 模型建立：(1)致敏階段。分別于第1天、第14天，將新鮮配制的含1.0%卵清蛋白1 mg及10%氫氧化鋁凝膠1 mg的生理鹽水混懸液共1 mL，皮下注射于模型組、生理鹽水組及各治療組大鼠四肢內(nèi)側(cè)，每點(diǎn)各0.2 mL，并腹腔注射0.2 mL，同時(shí)腹腔注射1 mL滅活百日咳桿菌5×9 ，正常對(duì)照組按照上述同樣途徑給予注射生理鹽水。(2)激發(fā)階段。模型組與各治療組，于第21天以1.0%卵清蛋白進(jìn)行霧化吸入，激發(fā)哮喘，每次霧化25～30 min，連續(xù)7 d。密切觀察大鼠有無(wú)持續(xù)口唇黏膜發(fā)紺、腹肌痙攣、頻繁喘息、噴嚏、嗆咳、抓耳撓腮、煩躁不安等行為學(xué)改變則為建模成功。

1.5 給藥方法 (1)不同劑量補(bǔ)益肺腎湯組：于每次激發(fā)前30 min以不同劑量的補(bǔ)益肺腎湯灌胃給藥，以10 mL/(kg·d)灌胃。(2)生理鹽水組：于每次激發(fā)前30 min，給予同體積的生理鹽水灌胃。(3)異丙腎上腺素組：于每次激發(fā)前30 min，尾靜脈注射鹽酸異丙腎上腺素0.5 mg/kg。(4)模型組及正常對(duì)照組：均給予等量生理鹽水灌胃。

1.6 觀察指標(biāo) 末次抗原激發(fā)30 min后頸椎脫臼處死大鼠，摘眼球取血，將血液置于抗凝管中，靜置30 min后，1 500 r/m離心15 min，取血漿，-20℃保存待檢。取完血漿后消毒大鼠胸部皮膚，逐層打開胸部皮膚及胸骨，去除部分肋骨，充分暴露肺臟，手術(shù)線結(jié)扎右肺門。沿肺門剪下右肺，磷酸鹽緩沖液漂洗后，將右肺副葉、后葉固定于4%多聚甲醛溶液中，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅染色待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)大鼠血清lgE及IL-4,肺組織IL-2、IL-4、IL-5、TNF-α水平，免疫組化檢測(cè)肺組織核因子κB活化情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 7組大鼠血清IgE和IL-4水平比較 正常對(duì)照組和各劑量補(bǔ)益肺腎湯組血清IgE、IL-4水平均低于模型組，補(bǔ)益肺腎湯低劑量組血清IgE、IL-4水平均高于中劑量組，異丙腎上腺素組血清IgE、IL-4水平高于正常對(duì)照組及補(bǔ)益肺腎湯高劑量、中劑量組(均P<0.05)。見表1。

表1 7組血清IgE和IL-4水平比較(x±s，ng/mL)

注：與正常對(duì)照組及各劑量補(bǔ)益肺腎湯組相比，*P<0.05；與正常對(duì)照組及高劑量、中劑量補(bǔ)益肺腎湯組比較，&P<0.05；與補(bǔ)益肺腎湯中劑量組比較，#P<0.05。

2.2 7組大鼠肺組織IL-2、IL-4和IL-5水平比較 正常對(duì)照組和各劑量補(bǔ)益肺腎湯組肺組織IL-2、IL-4和IL-5水平均低于模型組和生理鹽水組，補(bǔ)益肺腎湯低劑量組肺組織IL-2、IL-4和IL-5水平均高于補(bǔ)益肺腎湯中劑量組，異丙腎上腺素組肺組織IL-2、IL-5水平均高于正常對(duì)照組、補(bǔ)益肺腎湯高劑量、中劑量組(均P<0.05)。見表2。

表2 7組肺組織IL-2、IL-4和IL-5水平比較(x±s，ng/mL)

注：與正常對(duì)照組及各劑量補(bǔ)益肺腎湯組相比，*P<0.05；與正常對(duì)照組及高劑量、中劑量補(bǔ)益肺腎湯組比較，&P<0.05；與補(bǔ)益肺腎湯中劑量組比較，#P<0.05。

2.3 7組大鼠肺組織TNF-α和核因子κB水平比較 正常對(duì)照組和各劑量補(bǔ)益肺腎湯組肺組織TNF-α和核因子κB水平均低于模型組和生理鹽水組，補(bǔ)益肺腎湯低劑量組肺組織TNF-α和核因子κB水平水平均高于中劑量組，正常對(duì)照組及補(bǔ)益肺腎湯高劑量、中劑量組肺組織TNF-α和核因子κB水平均低于異丙腎上腺素組(均P<0.05)。見表3。

表3 7組肺組織TNF-α和 核因子κB水平比較(x±s)

注：與正常對(duì)照組及各劑量補(bǔ)益肺腎湯組相比，*P<0.05；與正常對(duì)照組及高劑量、中劑量補(bǔ)益肺腎湯組比較，&P<0.05；與補(bǔ)益肺腎湯中劑量組比較，#P<0.05。

3 討 論

哮喘，是一種由淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞介導(dǎo)的氣道慢性炎癥，常存在氣道高反應(yīng)性和廣泛的可逆性氣流阻塞。哮喘的發(fā)病機(jī)制主要與 Ⅰ 型變態(tài)反應(yīng)有關(guān),主要免疫學(xué)特征是血清總IgE和特異性IgE的增高，而IgE可以介導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒而誘發(fā)哮喘的發(fā)作。變應(yīng)原交聯(lián)引起的膜受體變位激活肥大細(xì)胞/嗜堿性粒細(xì)胞后，細(xì)胞膜磷脂甲基化作用使得胞膜的通透性增加，鈣通道開放，胞外鈣離子進(jìn)入胞內(nèi)，并將激活信息傳入，再激活胞內(nèi)酶系列。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，本病與體質(zhì)因素、生活環(huán)境、飲食、情志有密切關(guān)系，內(nèi)因在于肺、脾、腎不足，而外因在于感受外邪、飲食失調(diào)或情志不暢等。肺、脾、腎等臟腑功能失調(diào)，津液運(yùn)化輸布障礙，聚而生痰，留宿于肺，閉阻氣道，肺氣不利，血行不暢而血滯成瘀，痰瘀交結(jié)，蘊(yùn)伏于內(nèi)，成為哮喘之宿本。體內(nèi)伏痰、遇誘因而觸發(fā)，使氣機(jī)升降出納失常，乃是本病病機(jī)之根本。臨床上，在哮喘患者中肺腎氣虛證候非常多見[4]。補(bǔ)腎法已不拘于“急則治標(biāo)，緩則治本”的傳統(tǒng)原則，而廣泛運(yùn)用于變應(yīng)性哮喘各期[5-6]。補(bǔ)益肺腎湯通過(guò)多環(huán)節(jié)、多層次、多途徑治療哮喘，這種整體調(diào)節(jié)的優(yōu)勢(shì)為中醫(yī)治療本病，特別是在遠(yuǎn)期防治具有廣闊的應(yīng)用前景。

研究哮喘的發(fā)病機(jī)制時(shí)，哮喘的動(dòng)物模型大多是由接觸過(guò)敏原引起的過(guò)敏性氣道炎癥模型[7-8]。因此，本研究應(yīng)用氫氧化鋁聯(lián)合卵清蛋白建立哮喘大鼠模型，并采用補(bǔ)益肺腎湯進(jìn)行治療。 結(jié)果顯示，正常對(duì)照組和各劑量補(bǔ)益肺腎湯組血清IgE和IL-4水平，肺組織IL-2、IL-4、IL-5、TNF-α和核因子κB均低于模型組，且正常對(duì)照組及補(bǔ)益肺腎湯中劑量、高劑量組的血清IL-4、肺組織IL-2、IL-5、TNF-α、核因子κB均低于異丙腎上腺組(均P<0.05)，這提示補(bǔ)益肺腎湯可抑制哮喘大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，且效果優(yōu)于異丙腎上腺素。此外，與中劑量和高劑量補(bǔ)益肺腎湯組相比，低劑量補(bǔ)益肺腎湯組血清IgE和IL-4水平，肺組織IL-2、IL-4、IL-5、TNF-α、核因子κB水平均升高(均P<0.05)，而中、高劑量組上述指標(biāo)比較均無(wú)明顯差異(均P>0.05)，提示中、高劑量的補(bǔ)益肺腎湯的效果可能比低劑量更好。

總之，補(bǔ)益肺腎湯能可降低哮喘大鼠血清及肺組織的炎癥因子水平，從而減輕氣道炎癥，其中中、高劑量的效果更好。因此，在西藥常規(guī)治療的基礎(chǔ)上，可加用中藥補(bǔ)益肺腎湯治療哮喘，可起到解痙平喘、肅邪宣肺效果，從而改善患者預(yù)后明顯改善。