王 偉，原 野，南 蓬

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物多樣性與生態(tài)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438)

根據(jù)《中華人民共和國藥典》規(guī)定，中藥材黃芪的來源是豆科黃芪屬膜莢黃芪(Astragalusmembranaceus)及其原變種蒙古黃芪(Astragalusmembranaceusvar.mongholicus)，用藥部位是其干燥根部，是我國最常用的中藥材之一[1].黃芪始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為黃芪位列中藥上品，生用可固表托瘡，密炙黃芪可用于益氣補(bǔ)中；現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，黃芪在增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗病毒、抗衰老、強(qiáng)心等方面具有重要的醫(yī)療價值[2-6].

近年來隨著對黃芪的深入研究，其作為重要的藥食兩用資源被不斷開發(fā)，市場需求量快速增加，黃芪資源供不應(yīng)求，不少不法分子趁機(jī)將黃芪偽品冒充正品在藥材市場售賣.目前，市面上常見的黃芪偽品有: 紫苜蓿(Medicagosativa)，梭果黃芪(Astragalusernestii)，背扁黃芪(Astragaluscomplanatus)，多序巖黃芪(Hedysarumpolybotrys)，白花草木犀(Melilotusalbus)，錦雞兒(Caraganasinica)，蜀葵(Althaearosea)，大野豌豆(Viciagigantea)等[7-8].黃芪正偽品的療效相去甚遠(yuǎn)，正品膜莢黃芪和蒙古黃芪的有效成分主要為毛蕊異黃酮及其糖苷、黃芪甲苷等，并且安全無毒[9].部分偽品可能存在一定的毒性，如在比格犬毒性試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，300mg/kg劑量的蜀葵對比格犬生殖系統(tǒng)有一定的影響，且給藥組在停藥觀察期間出現(xiàn)嘔吐、惡心反應(yīng)[10]；有些偽品如錦雞兒、紫苜蓿不含毛蕊異黃酮及其糖苷、黃芪甲苷這兩類主要的有效成分[11-12]，同屬中的背扁黃芪與梭果黃芪同樣也未檢測到這些物質(zhì)[13-14].因此，確保黃芪藥材的準(zhǔn)確性、厘清偽品的來源和種類對于黃芪用藥的安全性和有效性都十分重要.

市面上流通的中藥材幾乎都需要經(jīng)過人為的加工和炮制，黃芪正品與偽品的根部切片在外形、顯微特征乃至部分化學(xué)成分上都十分相似，如多序巖黃芪和蜀葵的外觀接近正品膜莢黃芪，偽品梭果黃芪、背扁黃芪和錦雞兒的外觀與正品蒙古黃芪十分接近.在實(shí)際鑒別中難以運(yùn)用傳統(tǒng)形態(tài)鑒別辦法區(qū)分，而DNA條形碼技術(shù)具有簡便、微量、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，為黃芪正品與偽品的鑒別提供了新的方法和思路.

本研究使用ITS、rbcL、psbA-trnH3種通用DNA條形碼，對2種黃芪正品膜莢黃芪和蒙古黃芪及6種常見的偽品: 多序巖黃芪、紫苜蓿、錦雞兒、大野豌豆、背扁黃芪和梭果黃芪進(jìn)行分子鑒別，旨在探討DNA條形碼在黃芪與其偽品飲片鑒別中的應(yīng)用，為黃芪正品與偽品的鑒別提供準(zhǔn)確有效的標(biāo)準(zhǔn).

1 材料與方法

1.1 材料

黃芪正品膜莢黃芪、蒙古黃芪與常見偽品梭果黃芪、背扁黃芪、錦雞兒、多序巖黃芪干燥飲片均采收自甘肅、內(nèi)蒙、安徽、陜西、河北等各大藥材市場，每種飲片選取3個產(chǎn)區(qū)的藥材(圖1)；紫苜蓿、大野豌豆是2017-2018期間從四川、福建等地采集得到的干燥植物樣品，每種植物隨機(jī)選取3個植株，植株間距100m以上，材料基本信息如表1所示，所有樣品都經(jīng)過南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材研究所吳健老師進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，樣品皆保存于復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子與進(jìn)化生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室.

表1 黃芪正品與偽品材料信息表Tab.1 Basic information of authentic and counterfeit Huangqi

1.2 方法

1.2.1 植物總DNA的提取、通用引物設(shè)計及測序

本研究所有供試材料均為藥材炮制后的飲片或者干燥植物，使用天根DP305-03植物DNA提取試劑盒對供試樣品的DNA進(jìn)行提取，依據(jù)前人的文獻(xiàn)研究[15-17]，選取ITS，rbcL，psbA-trnH3種通用的DNA條形碼，相關(guān)PCR反應(yīng)條件如表2所示，PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物由上海美吉生物公司進(jìn)行測序，樣品采用雙向測序.

表2 PCR擴(kuò)增選用序列以及對應(yīng)的反應(yīng)條件Tab.2 Sequences of used primers and corresponding PCR reaction conditions

1.2.2 序列分析

雙向測序獲得的序列使用seqman軟件拼接，先使用NCBI的BLAST工具進(jìn)行比對，確認(rèn)物種信息的準(zhǔn)確性(https: ∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，隨后使用Mega6.0軟件進(jìn)行序列比對，并基于p-distance模型計算種間及種內(nèi)遺傳距離以繪制遺傳距離圖檢驗(yàn)各基因的Barcoding gap.采用DAMBE軟件進(jìn)行核苷酸替換飽和性分析[18-19]，使用MEGA 6.0軟件以分支自展值bootstrap作1000次可信度分析(bootstrap值用來檢驗(yàn)聚類樹分支可信度，根據(jù)所選的模型將序列位點(diǎn)進(jìn)行重排構(gòu)樹，出現(xiàn)相同的分支會為該分支增加一分，一般認(rèn)為分支自展值≥70%的情況下，聚類樹的結(jié)果較為可靠.本研究中為了直觀展示聚類樹分支自展值的大小，用三角形表示分支自展值≥70%的情況)，構(gòu)建NJ樹(Neighbor Joining Method，鄰接法)，根據(jù)建樹結(jié)果考察單一DNA條形碼及組合DNA條形碼對黃芪正、偽品鑒別的能力.

2 結(jié)果與分析

2.1 通用DNA條形碼序列結(jié)果分析

所有供試樣品DNA通用條形碼的序列特征如表3所示.在3種DNA通用條形碼中，psbA-trnH序列經(jīng)比對后的變異位點(diǎn)數(shù)及信息位點(diǎn)數(shù)為160個；ITS序列變異位點(diǎn)數(shù)及信息位點(diǎn)數(shù)最多，分別為196個；rbcL序列的變異位點(diǎn)數(shù)及信息位點(diǎn)數(shù)最少，共有57個.

表3 供試樣品序列特征Tab.3 Sequence analysis on single barcode

2.2 DNA Barcoding gap檢驗(yàn)

使用MEGA 6.0軟件基于p-distance模型計算所有供試樣品的種內(nèi)、種間遺傳距離，遺傳距離是指以任何對象(序列、基因次序、基因有無、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等)采用各種方法估計的兩個OTU(個體、群體、物種、種上分類單元或基因家族序列)之間的差異值，相同的OTU之間的距離為0，不同的OTU之間的距離大小與其相似程度成反比，遺傳距離可以直觀地體現(xiàn)序列之間的差異程度[20].本研究中各物種基于p-distance模型計算所得的遺傳距離如圖2顯示，顏色越淺代表遺傳距離越小，顏色越深代表遺傳距離越大.

隨后利用Microsoft Office Excel繪制遺傳距離圖，根據(jù)計算結(jié)果如圖3顯示: 3種DNA條形碼的平均種內(nèi)遺傳距離較為穩(wěn)定，全部集中于0～0.002的區(qū)域內(nèi)，rbcL平均種內(nèi)遺傳距離為0，平均種間遺傳距離為0.0360，種間遺傳距離最大的是大野豌豆與多序巖黃芪.

ITS序列平均種內(nèi)遺傳距離為0.0001，平均種間遺傳距離為0.1110，種內(nèi)遺傳距離最大的是蒙古黃芪，種間遺傳距離最大的是紫苜蓿與背扁黃芪.

psbA-trnH序列平均種內(nèi)遺傳距離為0，平均種間遺傳距離為0.1261，種間遺傳距離最大的是大野豌豆與多序巖黃芪.由以上結(jié)果可知，本研究所選用的3種DNA條形碼種間變異度大，種內(nèi)變異小且穩(wěn)定，存在較為明顯的DNA Barcoding gap.

2.3 單一DNA條形碼構(gòu)建聚類樹

選取ITS、rbcL、psbA-trnH片段保守區(qū)域，并使用DAMBE軟件進(jìn)行核酸替換飽和性檢驗(yàn)，隨后基于得到的DNA條形碼序列構(gòu)建NJ聚類樹以考察單一DNA條形碼鑒別黃芪與其偽品的能力.

NJ樹結(jié)果表明，單一DNA條形碼在不同屬間的黃芪正、偽品鑒別中的正確率較高，在屬下種間的物種鑒別中的效果一般.rbcL、ITS、psbA-trnH序列可以將不同屬間的黃芪正品與偽品區(qū)分開，但是，rbcL片段無法區(qū)分膜莢黃芪、蒙古黃芪和偽品梭果黃芪.

與rbcL片段類似，ITS可將黃芪屬與其他屬的樣品區(qū)分開，但其同樣無法區(qū)分膜莢黃芪、蒙古黃芪和偽品梭果黃芪，并且ITS部分分支支持率較低.

psbA-trnH片段NJ聚類樹結(jié)果表明，該片段也可區(qū)分不同屬間的黃芪正品與偽品，但在黃芪屬內(nèi)的偽品鑒別效果一般.以上結(jié)果證明，使用單一DNA條形碼很難將所有黃芪正品與偽品區(qū)分開.

2.4 組合DNA條形碼構(gòu)建聚類樹

綜合3種單一DNA條形碼rbcL、ITS、psbA-trnH的NJ聚類樹發(fā)現(xiàn)，單一DNA條形碼在黃芪屬內(nèi)正品、偽品中的鑒別效果不佳.因此，采用組合DNA條形碼形式提高分辨力.在前人研究基礎(chǔ)上，本研究分別采用了rbcL+ITS[21]，rbcL+psbA-trnH[22]，rbcL+ITS+psbA-trnH[23]，ITS+psbA-trnH[24]4種條形碼組合評估其在黃芪正品與偽品中的鑒別能力.

綜合4種組合條形碼的NJ聚類樹(圖5)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ITS+psbA-trnH，rbcL+psbA-trnH及rbcL+ITS+psbA-trnH這3種組合DNA條形碼在黃芪與其偽品鑒別中的效果較好(圖5(a),(c),(d)).

rbcL+ITS組合條形碼在同屬間的物種鑒別效率一般(圖5(b))，該組合無法區(qū)分黃芪屬內(nèi)的正品與偽品，且該組合條形碼分支支持率低于50%，可信度不高.

ITS+psbA-trnH組合條形碼構(gòu)建的NJ聚類樹(圖5(a))支持率明顯高于rbcL+ITS組合，該組合條形碼在不同屬間的物種鑒別成功率尚可，且在黃芪屬內(nèi)的偽品鑒別中，該組合可將2種正品膜莢黃芪、蒙古黃芪與2種偽品梭果黃芪、背扁黃芪厘清，表明該組合條形碼鑒別效果尚可.

rbcL+psbA-trnH組合條形碼在黃芪正偽品鑒別中分辨率良好(圖5(c))，使用該組合條形碼，也可將正品黃芪與其余偽品區(qū)分開，且各物種內(nèi)各自形成單系分支，說明使用該組合條形碼可以將本研究中所有供試樣品全部區(qū)分開.

與rbcL+psbA-trnH及組合條形碼ITS+psbA-trnH類似，使用rbcL+ITS+psbA-trnH組合條形碼聯(lián)合構(gòu)樹也可將全部供試正品、偽品區(qū)分開(圖5(d))，且這3種組合條形碼聚類樹的分支支持率皆較高，結(jié)果較為可信.

綜上，使用rbcL+ITS+psbA-trnH，rbcL+psbA-trnH及ITS+psbA-trnH3種條形碼組合均可將本研究中的2種黃芪正品，6種偽品全部區(qū)分開來，表明這3種組合條形碼可作為黃芪與其偽品鑒別的有效手段.

3 討 論

黃芪藥材正品、偽品的鑒別問題一直備受關(guān)注，相關(guān)研究表明: 利用紫外光譜、石蠟切片可以鑒別膜莢黃芪與紫苜蓿[25]；皂苷實(shí)驗(yàn)、生物堿實(shí)驗(yàn)及紙層析綜合使用可以鑒別黃芪與偽品蜀葵、刺果甘草[26]，然而理化鑒別通用性不強(qiáng)，且切片法、氣味和形態(tài)鑒別法較為主觀，正確率不高，因此分子鑒別手段應(yīng)運(yùn)而生.崔占虎等利用ITS序列區(qū)分黃芪、紅芪、紫苜蓿和蜀葵時發(fā)現(xiàn)，ITS序列可以用于黃芪與其偽品的鑒別[27]，不過該文中聚類樹的部分分支支持率低于50%，結(jié)果并不是十分可靠.此外，高婷等人發(fā)現(xiàn)利用ITS2片段可作為黃芪屬的DNA條形碼，不過該文樣品未包括本研究涉及到的偽品梭果黃芪[28]，因此，單一DNA條形碼能否適用于其他黃芪屬植物猶未可知.在此基礎(chǔ)上，本研究采用ITS、rbcL和psbA-trnH3種通用DNA條形碼對2種黃芪正品，6種偽品進(jìn)行鑒別，進(jìn)一步探究DNA條形碼在黃芪正品與偽品鑒別中的應(yīng)用.

rbcL基因具有通用性良好、易擴(kuò)增、易比對的優(yōu)點(diǎn)，該序列因自身序列進(jìn)化速率較慢且堿基變化較少而在屬以下水平的鑒別中的效果一般[29].本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用rbcL條形碼在屬以下水平的鑒別效果不佳.

ITS片段分布廣泛，常用于被子植物科內(nèi)、近緣屬種之間的研究.Han等使用DNA條形碼對市面上295種1436份常見中藥樣品進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，ITS2序列的鑒別效率最高[30]；陳士林等人根據(jù)6000余份藥用植物樣品實(shí)驗(yàn)結(jié)果也得出同樣結(jié)論，并推薦ITS2序列作為藥用植物通用條形碼，psbA-trnH作為后補(bǔ)條形碼[31]，并且Mei等也驗(yàn)證了ITS2片段可用于艾與其偽品的鑒別[32].Zhang等應(yīng)用ITS序列鑒別龍膽科蔓龍膽屬的藥用植物，驗(yàn)證了ITS條形碼技術(shù)在藥用植物鑒定中的有效性[33].但在本研究中，ITS序列的支持率較低，并且未能將黃芪屬內(nèi)的偽品與正品區(qū)分清楚，鑒別效果一般.

目前，一些學(xué)者基于ITS、ITS2序列尋找物種鑒別的SNP位點(diǎn)，馬曉沖等共采集3個居群17份東方澤瀉及3個居群19份澤瀉，通過分析發(fā)現(xiàn)二者在第165bp的位置上存在穩(wěn)定的A-T變異，可用于二者的鑒別[34].趙丹在開發(fā)白及與其偽品SNP分子標(biāo)記時，共采收8個居群72份白及、10個居群103份黃花白及、5個居群30份小白及、3個居群15份華白及、6個居群58份獨(dú)蒜蘭、5個居群41份苞舌蘭，并開發(fā)出3對僅可擴(kuò)增出白及、黃花白及的引物[35].另有鄭司浩等在膜莢黃芪與蒙古黃芪基源植物的特異性分子標(biāo)記開發(fā)中，采集了膜莢黃芪5個居群45份、蒙古黃芪7個居群44份，發(fā)現(xiàn)在第476bp位置上存在穩(wěn)定的C-T變異，蒙古黃芪為C，膜莢黃芪為T，成功設(shè)計出3對針對蒙古黃芪的特異性引物用于膜莢黃芪與蒙古黃芪的基源鑒定[36].這些基于SNP分子標(biāo)記的研究，都需要多居群大樣本進(jìn)行分析.本研究的目的在于開發(fā)能夠快速鑒別市場上常見黃芪正品與偽品的條形碼，在樣本量較小的情況下，DNA條形碼比SNP位點(diǎn)分析更加簡便快捷.

psbA-trnH基因是葉綠體基因進(jìn)化最快的片段之一，但其序列普遍存在poly A-T，嚴(yán)重影響了其測序質(zhì)量，適用范圍因此受限.一些學(xué)者運(yùn)用psbA-trnH分別鑒別百合科植物滇重樓、豆科雞血藤及其近緣種、茄科酸漿屬植物并取得不錯的效果，且精度較高[37-39].但在本研究中，psbA-trnH基因也同樣無法鑒別所有的黃芪正偽品.

Chase等在2007時提出單一DNA條形碼鑒別效率較低，隨即提出兩種關(guān)于matK的組合條形碼(rpoC1、rpoB和matK組合；rpoC1、matK和psbA-trnH組合)[40]，Burgess等也發(fā)現(xiàn)利用rbcL+matK組合的鑒別成功率高達(dá)91.4%，并且組合片段越多其成功率越高[41]，生命條形碼聯(lián)盟(CBOL)也曾提出將rbcL+matK作為陸生植物通用DNA條形碼，ITS及psbA-trnH作為備選序列[42].國內(nèi)亦有學(xué)者使用過組合條形碼，不同植物往往需要不同組合的DNA條形碼達(dá)到更好的鑒別效果，任保青等使用ITS+psbA-trnH鑒別樺木科榿木屬的準(zhǔn)確率可以達(dá)到88.5%，歐陽鋮人等使用rbcL+ITS組合條形碼在金合歡屬物種的鑒別中成功率達(dá)到86.7%[21]；Tan等亦發(fā)現(xiàn)rbcL+ITS組合條形碼能更好地鑒別中國西南地區(qū)亞高山森林草本植物[43].Han等使用ITS+psbA-trnH用于傘形科物種的鑒別成功率可以達(dá)到82%，明顯高于單一DNA條形碼[24]，Zhang等使用ITS2+psbA-trnH條形碼可以成功鑒別雷公藤及其偽品，效果優(yōu)于使用單一DNA條形碼[44].

本次研究結(jié)果表明，單一DNA條形碼在黃芪正品與偽品中的鑒別效果不理想，組合DNA條形碼的鑒別效率及聚類樹支持率均高于單一DNA條形碼，rbcL+psbA-trnH，rbcL+psbA-trnH+ITS及ITS+psbA-trnH3種組合相對于rbcL+ITS組合條形碼的鑒別效率而言，其正確率和效率均很高.

綜上，任意單一DNA條形碼都無法很好地獨(dú)立用于全部黃芪正偽品的鑒定工作，rbcL、ITS、psbA-trnH各具優(yōu)劣，rbcL的序列獲取成功率較高，且在屬以上的鑒定分析中準(zhǔn)確率較高，但在屬以下的分類單元中鑒定分析效果較差，3種單一DNA條形碼均無法單獨(dú)地將黃芪及偽品完全區(qū)分開.組合DNA條形碼鑒別效率明顯高于單一DNA條形碼，可以用于黃芪正偽品的鑒別；鑒于rbcL+psbA-trnH和rbcL+ITS+psbA-trnH組合DNA條形碼序列特異性強(qiáng)，建議將這兩個組合作為黃芪標(biāo)準(zhǔn)的鑒別體系.