副干酪乳桿菌SMN-LBK在乙醇 脅迫下的轉(zhuǎn)錄組分析

郭金鳳，楊 婕，李寶坤，金 丹，黎 旭，盧士玲，王慶玲，姬 華，董 娟，李應(yīng)彪，蔣彩虹

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003）

副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）是一種兼性厭氧、不運(yùn)動(dòng)、不產(chǎn)芽孢、發(fā)酵葡萄糖主要產(chǎn)生L-乳酸的桿狀或長(zhǎng)桿狀革蘭氏陽(yáng)性菌[1]。副干酪乳桿菌能促進(jìn)人體內(nèi)微生物菌群的平衡以及酶的平衡[2]，同時(shí)還可以刺激特異性和非特異性的免疫機(jī)制，具有預(yù)防某些疾病、促進(jìn)發(fā)育、增強(qiáng)體質(zhì)、延緩衰老和延長(zhǎng)壽命的益生功效[3]，是近年來(lái)國(guó)外研究頗多的益生乳酸細(xì)菌。

副干酪乳桿菌廣泛存在于馬奶酒等傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品及腸道中，還有少量存在于一些低度清酒[4]和白蘭地中[5]。因此，副干酪乳桿菌易遭受乙醇脅迫。研究表明，在乙醇脅迫下細(xì)胞膜首先受到攻擊，乳酸菌通過(guò)改變不飽和脂肪酸的比例[6]，提高細(xì)胞膜的流動(dòng)性[7]，造成胞內(nèi)物質(zhì)流失，致使正常生理功能及代謝調(diào)控失常。因此，提高菌株的乙醇適應(yīng)能力對(duì)其在食品工業(yè)的應(yīng)用具有重要作用。

近年來(lái)，隨著分子生物技術(shù)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及生物信息學(xué)的發(fā)展，在脅迫研究方面，科研人員正在通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)，進(jìn)行乳酸菌在不同因素脅迫后差異基因的分析，進(jìn)而研究乳酸菌的脅迫機(jī)制。因此，轉(zhuǎn)錄組學(xué)是研究生物耐受機(jī)制的重要手段。目前雖有關(guān)于乙醇耐受性的報(bào)道，但是對(duì)乳酸菌的乙醇脅迫應(yīng)答機(jī)制卻缺乏了解。本研究以1 株分離于新疆塔城地區(qū)馬奶酒中的耐乙醇菌株副干酪乳桿菌SMN-LBK為研究對(duì)象，分別以4%、6%、8%、10%乙醇進(jìn)行脅迫處理，測(cè)定其存活率，并以10%乙醇為對(duì)其進(jìn)行脅迫處理，對(duì)其基因表達(dá)情況進(jìn)行研究，旨在從轉(zhuǎn)錄水平上揭示副干酪乳桿菌SMN-LBK的乙醇脅迫應(yīng)答機(jī)制，并為進(jìn)一步闡明乳酸桿菌的耐受機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基

副干酪乳桿菌SMN-LBK是從新疆塔城地區(qū)馬奶酒樣品中分離篩選出的1 株耐乙醇乳酸菌。

液體MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母浸粉5 g、無(wú)水乙酸鈉5 g、葡萄糖20 g、檸檬酸三銨2 g、磷酸氫二鉀2 g、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g、 吐溫80 1 mL，蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 6.2～6.4，121 ℃滅菌20 min。

固體MRS培養(yǎng)基：在液體MRS培養(yǎng)基內(nèi)添加18 g/L瓊脂粉，于121 ℃滅菌20 min。

含乙醇MRS培養(yǎng)基：已滅菌液體MRS培養(yǎng)基按不同體積比添加無(wú)水乙醇，配制成4%、6%、8%、10%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇培養(yǎng)基，以不添加乙醇的培養(yǎng)基作為對(duì)照。

1.1.2 試劑

焦炭酸二乙酯 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；UltraSYBR Mixture 康為世紀(jì)生物科技有限公司；Trizol試劑、Qubit?RNA檢測(cè)試劑盒 美國(guó)Life公司；RNA Nano 6000檢測(cè)試劑盒 美國(guó)安捷倫公司；NEBNext?Ultra? Directional RNA Library Prep Kit for Illumina?美國(guó)NEB公司；瓊脂糖 北京天根生物科技有限公司；異丙醇、三氯甲烷、無(wú)水乙醇 天津市福晨化學(xué)試劑有限公司；其余均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1CU雙人單面超凈工作臺(tái) 蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Centrifuge 5417R高速冷凍 離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；ND2000C微量核酸蛋白分析儀 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；GeI Doc XR+ 凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；MX3000P實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，real-time PCR）分析儀、2100生物分析儀 美國(guó)Agilent公司；HiSeq2500測(cè)序儀 美國(guó)Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

取-80 ℃甘油貯存液以2%接種量接種于5 mL已滅菌MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，獲得活化種子液。以2%接種量接種種子液于5 mL已滅菌的液體MRS培養(yǎng)基中，于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，獲得活化菌株。

1.3.2 乙醇脅迫

如圖1所示，S10為空白對(duì)照，SP10為10%乙醇脅迫處理。將活化副干酪乳桿菌SMN-LBK以2%接種于已滅菌的液體MRS培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)至OD600nm為0.8，吸取2%上述菌液分別接種至不含乙醇MRS培養(yǎng)基及含4%、6%、8%、10%乙醇MRS培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)3 h。

圖 1 乙醇脅迫處理示意圖Fig. 1 Schematic illustration of ethanol stress treatment

1.3.3 存活率測(cè)定

將經(jīng)過(guò)乙醇脅迫處理的菌液以無(wú)菌0.85%生理鹽水清洗2 次，并同體積進(jìn)行重懸，吸取1 mL重懸菌液于無(wú)菌0.85%生理鹽水中梯度稀釋，于固體MRS培養(yǎng)基上涂布，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，測(cè)定存活率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，每次3 個(gè)平行樣品。存活率計(jì)算公式如下：

式中：Nc為未經(jīng)乙醇脅迫活菌數(shù)；Ns為乙醇脅迫后活菌數(shù)。

1.3.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

采用焦炭酸二乙酯處理所有實(shí)驗(yàn)相關(guān)耗材，按照Trizol試劑說(shuō)明書提取菌株總RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA降解程度以及是否有污染；采用Nanodrop檢測(cè)RNA的純度（OD260nm/OD280nm）；按照Qubit?RNA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書對(duì)RNA濃度進(jìn)行精確定量；通過(guò)Agilent 2100生物分析儀精確檢測(cè)RNA的完整性。運(yùn)用NEBNext?Ultra? Directional RNA Library Prep Kit for Illumina?進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，并用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物。采用Qubit 2.0進(jìn)行初步定量，稀釋文庫(kù)至1 ng/μL后，采用2100生物分析儀對(duì)文庫(kù)的插入片段長(zhǎng)度進(jìn)行檢測(cè)。將合格的不同文庫(kù)按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求pooling后進(jìn)行HiSeq 2500測(cè)序。

1.3.5 real-time PCR對(duì)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果驗(yàn)證

按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成第1鏈cDNA，real-time PCR所用的引物見(jiàn)表1，其中16S rRNA作為內(nèi)參基因，采用ddH2O作為陰性對(duì)照。按照UltraSYBR Mixture說(shuō)明書進(jìn)行real-time PCR。real-time PCR體系（20 μL）：熒光染料混合液10 μL、正向引物0.4 μL、反向引物0.4 μL、cDNA模板0.8 μL、用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。real-time PCR程序：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸32 s，循環(huán)40 次；溶解曲線分析：95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，95 ℃熒光信號(hào)采集15 s，60 ℃冷卻15 s。每個(gè)樣品設(shè)置3 次平行。利用2-ΔΔCt法分析基因的相對(duì)表達(dá)量，使用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的顯著性分析。

表 1 real-time PCR引物Table 1 Sequences of primers used for real-time PCR

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 質(zhì)量控制

測(cè)序得到的原始測(cè)序序列，對(duì)raw reads進(jìn)行過(guò)濾，去除帶接頭的、低質(zhì)量的reads，得到clean reads，后續(xù)分析都基于clean reads，同時(shí)計(jì)算clean reads的GC含量（堿基G和C數(shù)量總和占總堿基數(shù)量的百分比）、Q20、Q30含量（Phred數(shù)值大于20、30的堿基占總體堿基百分比）。

1.4.2 基因表達(dá)水平分析

采用HTSeq軟件對(duì)各樣品進(jìn)行基因表達(dá)水平分析[8]， 根據(jù)基因的長(zhǎng)度計(jì)算每百萬(wàn)片段中來(lái)自某一基因每千堿基長(zhǎng)度的片段（fragments per kilobase per million，F(xiàn)PKM）數(shù)目[9]。本研究以FPKM=1作為判斷基因是否表達(dá)的閾值標(biāo)準(zhǔn)[10]。

1.4.3 差異基因表達(dá)分析

使用DESeq R軟件包（1.18.0）進(jìn)行兩組的差異表達(dá)分析，基于負(fù)二項(xiàng)式分布的模型確定數(shù)字基因表達(dá)數(shù)據(jù)中的差異表達(dá)。使用Chen Rongjun等[11]方法調(diào)整所 得P 值以控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率。通過(guò)D E S e q 發(fā)現(xiàn)調(diào)整的P ＜0.0 5 的基因?yàn)椴町惢?。?duì)檢測(cè)結(jié)果以 log2|Fold Change|＞1、P＜0.05作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，對(duì)差異基因表達(dá)情況進(jìn)行具體分析。

1.4.4 差異基因功能富集分析

采用GOSeq R軟件包對(duì)差異基因進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析，其中對(duì)基因長(zhǎng)度偏差進(jìn)行校正，具有校正的P＜0.05的GO term是顯著富集的差異基因。京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）是一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)資源，用于從基因組測(cè)序產(chǎn)生的大規(guī)模分子數(shù)據(jù)集和其他高通量數(shù)據(jù)庫(kù)中了解生物系統(tǒng)的高級(jí)功能和效用（http://www.genome.jp/kegg/）。采用KOBAS軟件測(cè)試KEGG途徑中差異基因的富集[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇脅迫對(duì)副干酪乳桿菌SMN-LBK存活率的影響

圖 2 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇脅迫下副干酪乳桿菌SMN-LBK的存活率Fig. 2 Survival rates of L. paracasei SMN-LBK under ethanol stress at different concentrations

由圖2可知，以乙醇體積分?jǐn)?shù)0%作為對(duì)照組，以4%、6%、8%、10%乙醇對(duì)副干酪乳桿菌的SMN-LBK進(jìn)行脅迫處理，其存活率依次為25.84%、18.39%、10.86%、1.67%，副干酪乳桿菌SMN-LBK的最高耐乙醇脅迫能力為10%。

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

表 2 數(shù)據(jù)質(zhì)量分析 Table 2 Quality analysis of transcriptomic sequencing data

由表2可知，兩組處理的Q20值均大于95%，Q30值均大于88%，GC含量均在50%左右。結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量好，準(zhǔn)確性高。

2.3 基因表達(dá)水平分析

表 3 不同表達(dá)水平區(qū)間的基因數(shù)量Table 3 Statistics of expression levels of differentially expressed genes

由表3可知，兩組處理的基因表達(dá)量均在PFKM 1～3區(qū)間最低，每個(gè)基因的表達(dá)水平在3.07%～3.95%范圍內(nèi)；基因表達(dá)量均在FPKM＞60區(qū)間最高，每個(gè)基因的表達(dá)水平在47.02%～50.55%范圍內(nèi)，說(shuō)明多數(shù)基因以高水平表達(dá)。

2.4 差異基因表達(dá)分析

2.4.1 差異基因篩選

圖 3 差異基因上下調(diào)情況Fig. 3 Statistics of up-regulated and down-regulated genes

由圖3可知，在SP10與S10組內(nèi)上調(diào)表達(dá)差異基因524 個(gè)，下調(diào)表達(dá)差異基因550 個(gè)；上調(diào)表達(dá)顯著差異基因28 個(gè)，下調(diào)表達(dá)顯著差異基因50 個(gè)（log2|Fold Change|＞1，P＜0.05）。

圖 4 乙醇不同處理下差異基因聚類分析Fig. 4 Clustering analysis of differentially expressed genes under ethanol stress at different concentrations

2.4.2 差異基因表達(dá)聚類分析

采用差異基因火山圖推斷其整體分布情況，聚類分析判斷差異基因在乙醇脅迫的表達(dá)模式。聚類分析以差異基因表達(dá)變化1 倍以上且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率小于0.05進(jìn)行繪制。由圖4可知，有4 類表達(dá)模式相同或相近的基因聚集成類，它們可能具有相似的功能或參與相同的生物學(xué)過(guò)程。

2.4.3 real-time PCR驗(yàn)證分析

圖 5 real-time PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序Fig. 5 Real-time PCR validation of transcriptomic sequencing data

對(duì)差異顯著的基因進(jìn)行real-time PCR驗(yàn)證，如圖5所示，real-time PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果具有一致性。因此，充分驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的正確性與可靠性。

2.5 差異基因功能富集分析

圖 6 乙醇不同處理下差異基因GO富集分析Fig. 6 GO enrichment analysis of differentially expressed genes under ethanol stress at different concentrations

GO富集分析以閾值（P＜0.05）為依據(jù)評(píng)價(jià)差異基因的主要生物學(xué)功能，其主要包括細(xì)胞組分（cellcular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物過(guò)程（biological process，BP）三類。由圖6 可知，SP10與S10相比，BP組蛋白代謝過(guò)程、細(xì)胞內(nèi)蛋白代謝過(guò)程、翻譯過(guò)程為顯著富集GO term；CC組核糖體、核糖核蛋白復(fù)合物為顯著富集GO term；MF組核糖體的結(jié)構(gòu)成分、金屬離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性為顯著富集GO term。KEGG是一個(gè)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)，整合了基因組信息、化學(xué)信息和生化系統(tǒng)功能信息。KEGG Orthology（KO）是KEGG直系同源數(shù)據(jù)庫(kù)，將各個(gè)KEGG注釋系統(tǒng)聯(lián)系在一起，將分子網(wǎng)絡(luò)和基因組信息聯(lián)系起來(lái)，根據(jù)直系同源關(guān)系，實(shí)現(xiàn)跨物種的基因組或轉(zhuǎn)錄組的功能注釋。結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異顯著基因參與的相關(guān)代謝通路進(jìn)行了分析，由表4可知，差異顯著基因主要參與了丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、脂肪酸生物合成、ATP結(jié)合盒式蛋白（ATP-bindingcassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)體、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（phosphotransferase system，PTS）。

表 4 乙醇脅迫下差異顯著基因Table 4 Genes that showed significantly different expression levels under ethanol stress

2.5.1 乙醇對(duì)參與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝的基因表達(dá)情況的影響

由表4可知，pyrB SP10相對(duì)S10顯著上調(diào)。ald1顯著下調(diào)表達(dá)，dltA、dltB、dltC SP10相對(duì)S10均顯著上調(diào)。PyrB是包括大腸桿菌在內(nèi)的所有原核生物嘧啶核苷酸從頭合成中很重要的一個(gè)限速酶，它催化的是天冬氨酸與氨甲酰磷酸生成氨甲酰天冬氨酸和無(wú)機(jī)磷的反應(yīng)[13]。Gerhart等[14]發(fā)現(xiàn)PyrB的一個(gè)最有效抑制劑是代謝途徑的終產(chǎn)物胞嘧啶三磷酸（cytosine triphosphate，CTP），當(dāng)CTP水平高時(shí)，CTP與PyrB結(jié)合，降低CTP合成的速度，反之當(dāng)細(xì)胞內(nèi)CTP水平低時(shí)，CTP從PyrB上解離，加快CTP合成速度，研究還發(fā)現(xiàn)ATP是酶的別構(gòu)激活劑。本研究發(fā)現(xiàn)pyrB顯著上調(diào)，這說(shuō)明副干酪乳桿菌SMN-LBK在乙醇脅迫下，pyrB被激活，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶催化天冬氨酸與氨甲酰磷酸生成氨甲酰天冬氨酸和無(wú)機(jī)磷，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)CTP水平低，加速了pyrB作用，這也是副干酪乳桿菌自我保護(hù)的一種方式。

趙鵬[15]研究表明ald基因在氧化脅迫情況下顯著下調(diào)表達(dá)，胞內(nèi)丙氨酸的代謝受到影響。Ald是一種雙向反應(yīng)酶，正向以丙氨酸為底物氧化脫氨生成丙酮酸、NADH，并釋放NH3[16]。逆向由丙酮酸氨化生成丙氨酸，消耗一分子銨和NADH[17]。本研究ald1 SP10相對(duì)S10顯著下調(diào)表達(dá)，說(shuō)明副干酪乳桿菌SMN-LBK在乙醇脅迫下，Ald催化丙酮酸生成丙氨酸的活性降低，而丙氨酸廣泛存在于已知蛋白中，此外，它還在組成細(xì)胞壁肽聚糖骨架具有重要作用，所以ald可能參與并調(diào)控了副干酪乳桿菌S10的乙醇脅迫調(diào)控，并且在其細(xì)胞質(zhì)的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞壁生物合成中受到了抑制。DltB是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的一種dlt操縱子，其催化D-丙氨酸殘基并入脂磷壁酸中[18]。 脂磷壁酸是一種革蘭氏陽(yáng)性（G+）菌細(xì)胞壁特殊組分，由核糖醇或甘油殘基經(jīng)由磷酸二鍵互相連接而成的多聚物，其可以跨過(guò)肽聚糖層，以其末端磷酸共價(jià)連接于質(zhì)膜中糖脂（例如二葡糖基二酰基甘油）的寡糖基部分。本研究發(fā)現(xiàn)dltA、dltB和dltC SP10相對(duì)S10均顯著上調(diào)，說(shuō)明副干酪乳桿菌SMN-LBK通過(guò)增強(qiáng)與細(xì)胞壁合成相關(guān)基因的表達(dá)抵抗乙醇的侵害。

2.5.2 乙醇對(duì)參與脂肪酸生物合成基因表達(dá)情況的影響

由表4可知，fabG和fabZ基因SP10相對(duì)S10顯著下調(diào)表達(dá)。fabG催化細(xì)菌脂肪酸合成途徑中催化3-氧?；?ACP還原為3-羥?；?ACP[19]，消耗NADPH或NADH，是必需的還原步驟[20]。Filip’echev等[21]研究表明，用于假定fabG質(zhì)粒AZOBR_p1-攜帶的fabG基因，對(duì)于在Azospirillum brasilenseSp245中雙鞭毛系統(tǒng)的正確裝配和工作是必需的。Putim等[22]基于STITCH數(shù)據(jù)庫(kù)的分析預(yù)測(cè)fabG與結(jié)核分枝桿菌抗藥性有關(guān)。Tan等[23]研究發(fā)現(xiàn)增加fabZ的用量可使大腸桿菌辛酸效價(jià)的最高增加45%。Kastaniotis等[24]發(fā)現(xiàn)YHR067w編碼一種新的線粒體fabZ，線粒體FAS途徑的功能與硫辛酸或磷脂生物合成、蛋白質(zhì)膜插入或內(nèi)膜氧化損傷修復(fù)相關(guān)。本研究中fabG和fabZ SP10相對(duì)S10顯著下調(diào)表達(dá)，說(shuō)明在乙醇脅迫下，副干酪乳桿菌SMN-LBK的脂肪酸合成受阻，細(xì)胞膜內(nèi)膜受損，從而對(duì)乙醇的抵抗能力下降。

2.5.3 乙醇對(duì)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體基因表達(dá)情況的影響

由表4可知，gbuB、gbuA、macB2、肽ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物結(jié)合蛋白基因、mppA、ykpA、yclF和rbsA SP10相對(duì)S10均顯著下調(diào)表達(dá)。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是一個(gè)與結(jié)構(gòu)相關(guān)的吸收和外運(yùn)系統(tǒng)的超家族[25]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通常由多個(gè)亞基組成，其中1 個(gè)或2 個(gè)是跨膜蛋白，還有膜相關(guān)ATPase。ATPase亞基利用ATP結(jié)合和水解的能量促進(jìn)各種底物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，以吸收或輸出底物。肽ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物結(jié)合蛋白基因、mppA、yclF都是與肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的基因，細(xì)胞膜上的肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不僅能夠轉(zhuǎn)運(yùn)小肽進(jìn)入細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)，并且還參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、趨化性等重要生理活動(dòng)[26]。王艷紅等[27]從中度嗜鹽菌喜鹽芽孢桿菌Halobacillus Y5中成功克隆了1 個(gè)新的耐鹽堿基因（HY5_opu D），該基因是1 個(gè)新的甘氨酸甜菜堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，能夠使大腸桿菌KNabc在0.2 mol/L NaCl、5 mmol/L LiCl及堿性（pH 8.0）環(huán)境下生長(zhǎng)。Park等[28]發(fā)現(xiàn)大腸桿菌高親和力核糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由周質(zhì)核糖結(jié)合蛋白（RBP或RbsB）、膜組分（RbsC）和ATP結(jié)合蛋白（RbsA）組成。本研究發(fā)現(xiàn)SP10相對(duì)S10下副干酪乳桿菌SMNLBK 8 個(gè)基因均顯著下調(diào)表達(dá)。在乙醇作用下，細(xì)菌的細(xì)胞膜通透性增大，使跨膜蛋白肽健斷裂，與膜相關(guān)ATPase活性受到抑制，使其正常的跨膜運(yùn)動(dòng)與物質(zhì)運(yùn)輸遭受破壞。

2.5.4 乙醇對(duì)參與PTS的基因表達(dá)情況的影響

由表4可知，fruA、MtlA、agaW SP10相對(duì)S10均顯著下調(diào)。糖PTS是許多乳酸桿菌中將外界碳源轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞并將其進(jìn)行磷酸化的一種重要工具[29]。PTS通過(guò)涉及PTS的不同組分的一系列步驟將磷酸烯醇式丙酮酸酯的磷酸鹽基團(tuán)轉(zhuǎn)移到進(jìn)入的糖中發(fā)揮作用。PTS由缺乏糖特異性的細(xì)胞質(zhì)組分和膜相關(guān)酶構(gòu)成，其對(duì)少數(shù)糖具有特異性。細(xì)胞質(zhì)組分是酶I（EI）和組氨酸可磷酸化蛋白（HPr）。PTS系統(tǒng)的膜成分酶II（EII）由3～4 個(gè)亞基組成：IIA、IIB、IIC和有時(shí)IID[30]。本研究表明：副干酪乳桿菌SMN-LBK在乙醇脅迫下，其對(duì)果糖、甘露糖、乙酰半乳糖胺的轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降，從而可能使其正常的碳代謝受到抑制而影響其代謝調(diào)控。

3 結(jié) 論

丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝基因（ald1）、脂肪酸生物合成基因（fabG、fabZ）、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體（macB2、gbuB、gbuA、mppA、ykpA、yclF、rbsA、肽ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物結(jié)合蛋白基因）、PTS（fruA、mtlA、agaW）在乙醇脅迫下顯著下調(diào)表達(dá)，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝基因（pyrB、dltA、dltB、dltC）在乙醇脅迫下顯著上調(diào)表達(dá)，這說(shuō)明副干酪乳桿菌SMN-LBK脂肪酸合成代謝受到抑制，物質(zhì)跨膜運(yùn)輸受到抑制，而天冬氨酸和丙氨酸代謝相關(guān)基因與細(xì)胞壁主要成分肽聚糖、磷壁酸的生物合成相關(guān)，其可能通過(guò)提高這些基因表達(dá)抵御乙醇對(duì)自身的損害。副干酪乳桿菌面對(duì)高用量乙醇脅迫，其基因或者其編碼的蛋白正常的結(jié)構(gòu)受到破壞，從而使其正常功能不能夠得以全部發(fā)揮，這些基因可能與副干酪乳桿菌SMN-LBK的乙醇脅迫機(jī)制密切相關(guān)，但其具體乙醇耐受機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。