饒曉紅 童文娟 陳丁丁
[摘要] 目的 探究川崎?。↘D)并發(fā)感染患兒Treg/Th17細(xì)胞、免疫功能的變化及臨床意義。 方法 選取2016年1月~2018年6月于安徽省兒童醫(yī)院就診的KD并發(fā)感染患兒100例作為觀察組,選擇同期診斷為KD但無并發(fā)感染患兒37例作為對照組。利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測兩組患兒炎癥因子指標(biāo),采用流式細(xì)胞術(shù)檢測調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、輔助性T細(xì)胞17(Th17)、CD3+、CD4+、CD8+以及自然殺傷(NK)細(xì)胞比例變化,同時利用免疫比濁法測定免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)及免疫球蛋白A(IgA)。 結(jié)果 觀察組白細(xì)胞個數(shù)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、降鈣素原、中性粒細(xì)胞百分比數(shù)、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)及白細(xì)胞介素8(IL-8)含量明顯均高于對照組(P < 0.05);流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果示,觀察組Treg、Th17細(xì)胞百分比及Treg/Th17比值明顯高于對照組(P < 0.05);免疫比濁法與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果示,觀察組IgG、IgA、IgM、CD4+、NK細(xì)胞含量明顯高于對照組(P < 0.05),而CD3+、CD8+及CD4+/CD8+含量明顯低于對照組(P < 0.05)。 結(jié)論 KD并發(fā)感染患兒炎癥較為強(qiáng)烈,Treg/Th17細(xì)胞、免疫功能更為紊亂,這些指標(biāo)變化對于臨床診斷KD并發(fā)感染患兒具有指導(dǎo)意義。
[關(guān)鍵詞] 川崎病;并發(fā)感染;Treg/Th17細(xì)胞;免疫功能;變化;臨床意義
[中圖分類號] R725.4? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210(2020)02(b)-0091-04
Changes and clinical significance of Treg/Th17 cells and immune function in children with Kawasaki disease complicated with infection
RAO Xiaohong? ?TONG Wenjuan? CHEN Dingding
Department of Emergency Internal Medicine, Anhui Provincial Children′s Hospital, Anhui Province, Hefei? ?230051, China
[Abstract] Objective To investigate the changes and clinical significance of Treg/Th17 cells and immune function in children with Kawasaki disease (KD) complicated with infection. Methods From January 2016 to June 2018, 100 children with KD complicated with infection in Anhui Provincial Children′s Hospital were selected as observation group, and 37 children diagnosed as KD but not complicated with infection were selected as control group. The inflammatory factors indexes were measured by enzyme linked immunosorbent assay kit and regulatory T cells (Treg), helper T cells 17(Th17), CD3+, CD4+, CD8+ and the proportion of natural killer (NK) cells were detected by flow cytometry. At the same time, immunoglobulin M(IgM), immunoglobulin G(IgG) and immunoglobulin A(IgA) were determined by immunoturbidimetry. Results The number of leukocytes, platelets, calcitonin, percentage of central granulocytes, hypersensitive C-reactive protein (hs-CRP), tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6) and interleukin-8 (IL-8) in the observation group were significantly higher than the control group (P < 0.05). The results of flow cytometry showed that the percentage of Treg, Th17 cells and the ratio of Treg/Th17 in the observation group were significantly higher than the control group (P < 0.05). The results of immunoturbidimetry and flow cytometry showed that the contents of IgG, IgA, IgM, CD4+ and NK cells in the observation group were significantly higher than the control group (P < 0.05), while the contents of CD3+, CD8+ and CD4+/CD8+ were significantly lower than the control group (P < 0.05). Conclusion The inflammation of children with KD complicated with infection is strong, Treg/Th17 cells and immune function are more disordered. The changes of these indexes have guiding significance for the clinical diagnosis of KD complicated with infection.
[Key words] Kawasaki disease; Complicated with infection; Treg/Th17 cells; Immune function; Change; Clinical significance
川崎?。↘D)又名皮膚黏膜淋巴綜合征,是一種全身性血管炎癥病變綜合征,多發(fā)于5歲以下兒童,近年來,該病發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增高的趨勢[1]。KD發(fā)病較為復(fù)雜,冠狀動脈損傷是KD患兒較為常見的并發(fā)癥,嚴(yán)重者可能導(dǎo)致心源性猝死。目前KD是兒童獲得性心臟病的主要原因[2],其導(dǎo)致兒童發(fā)生心血管病變的概率高居首位,但是其發(fā)病機(jī)制至今尚未明確闡明[3]。目前有研究猜測,免疫系統(tǒng)功能紊亂與KD發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4],CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、輔助性T細(xì)胞17(Th17)是組成細(xì)胞免疫的重要部分,Treg能夠明顯抑制炎性反應(yīng),而Th17則能夠不斷促進(jìn)炎性反應(yīng),Treg/Th17比例的變化能夠體現(xiàn)出T細(xì)胞免疫功能的變化[5]。KD患兒發(fā)病常常伴有EB病毒、肺炎支原體等并發(fā)感染,KD患兒并發(fā)感染常伴有多種免疫功能改變與紊亂[6-7]。本文對KD并發(fā)感染患兒Treg/Th17細(xì)胞、免疫功能的變化進(jìn)行探究,具體研究如下:
1 資料與方法
1.1 一般資料
選取2016年1月~2018年6月于安徽省兒童醫(yī)院(以下簡稱“我院”)就診的患兒,納入標(biāo)準(zhǔn):①符合《川崎病診斷指南》[8];②經(jīng)病原學(xué)檢測確診為病毒感染;③年齡4個月~14歲;④治療前未使用影響免疫系統(tǒng)功能類藥物;⑤患者及其家屬同意參與本研究,并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):①患有其他免疫系統(tǒng)疾病;②合并有嚴(yán)重心腎疾病;③不配合治療者。觀察組患兒100例,其中男70例,女30例;年齡4個月~8歲,平均(1.76±1.31)歲;并發(fā)肺炎鏈球菌感染38例,EB病毒感染27例,衣原體感染10例,沙門菌感染11例,其他病毒感染14例。選擇同期于我院診斷為KD但無并發(fā)癥感染患者37例作為對照組,其中男22例,女15例;年齡5個月~6歲,平均(1.99±1.42)歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05),具有可比性。本研究通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。
1.2 觀察指標(biāo)及檢測方法
1.2.1 炎癥因子檢測? 兩組患兒入院后確診KD后予丙種球蛋白及對癥治療,如存在感染,給予相應(yīng)抗生素或抗病毒藥物治療。治療前,清晨空腹?fàn)顟B(tài)下收集兩組患兒的靜脈血,檢測白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、降鈣素原、中性粒細(xì)胞百分比、紅細(xì)胞沉降率(ESR)以及超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)水平變化。同時取200 μL血液,4000 g離心10 min后取血清,離心半徑為11.5 cm,利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)試劑盒檢測兩組患兒血清中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)以及白細(xì)胞介素8(IL-8)水平,操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行(上海通蔚生物科技有限公司,生產(chǎn)批號:20151207)。
1.2.2 Treg/Th17比例檢測? 患兒在空腹?fàn)顟B(tài)下,抽取5 mL靜脈血,并將其儲存于肝素抗凝真空采血管中,放置于-80℃冰箱保存。Treg檢測:取100 μL全血,加入20 μL APC抗人CD25抗體和FITC抗人CD4抗體[英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司,生產(chǎn)批號:20150416、20150622],混合均勻后避光反應(yīng)10 min,將反應(yīng)的混合液利用離心機(jī)2500 g離心5 min,離心半徑為11.5 cm,將上清液棄掉后加入500 μL的PBS緩沖液,震蕩混合均勻,再次按照2500 g轉(zhuǎn)速離心5 min后進(jìn)行固定穿孔,使用Foxp3抗體過夜孵育,進(jìn)行標(biāo)記。Th17檢測:將采集的靜脈血按照4000 g轉(zhuǎn)速離心5 min,離心半徑為11.5 cm,分離出外周血單個核細(xì)胞,選取1×107個外周血單個核細(xì)胞將其培養(yǎng)于24孔板中,往其中添加50 ng/mL的聚丙烯酸甲酯(PMA)、10 mg/mL布雷非德菌素A以及1 mmol/L的離子霉素(美國Sigma公司,生產(chǎn)批號:20141125、20150217、20151026),將上述樣品混合均勻后,共同培養(yǎng)在含10%加熱滅火小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基[英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司,生產(chǎn)批號:20151027]中,進(jìn)行共同刺激,培養(yǎng)5 h后,利用FITC抗-CD4抗體進(jìn)行標(biāo)記20 min后進(jìn)行穿孔、固定,之后再使用PE-抗人IL-17A抗體[英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司,生產(chǎn)批號:20150613]在胞內(nèi)進(jìn)行標(biāo)記。流式細(xì)胞術(shù)采用型號為Epics XL-MCL的流式細(xì)胞儀(美國貝格曼公司),激發(fā)光波長大小為488 nm。
1.2.3 免疫功能指標(biāo)檢測? 免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)及免疫球蛋白A(IgA)檢測:清晨患兒空腹?fàn)顟B(tài)下抽取靜脈血2 mL,利用免疫比濁法進(jìn)行檢測,檢測儀器為BNProspec型全自動蛋白分析儀(德國西門子公司),嚴(yán)格遵照儀器操作說明進(jìn)行,儀器所用試劑為儀器配套原裝試劑。免疫細(xì)胞檢測:利用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD3+、CD4+、CD8+以及自然殺傷(NK)細(xì)胞,具體操作同“1.2.2”。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用率表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 兩組患兒炎癥因子比較
觀察組白細(xì)胞個數(shù)、PLT、降鈣素原、中性粒細(xì)胞百分比數(shù)、hs-CRP、TNF-α、IL-6及IL-8含量明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05);兩組ESR差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。見表1。
2.2 兩組患兒Treg/Th17比較
觀察組Treg、Th17細(xì)胞百分比及Treg/Th17比值明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。見表2。
2.3 兩組患兒免疫功能指標(biāo)比較
觀察組IgG、IgA、IgM、CD4+、NK細(xì)胞含量明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05),而CD3+、CD8+及CD4+/CD8+含量觀察組明顯低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。見表3。
3 討論
KD是一種多發(fā)于5~6歲兒童異常免疫反應(yīng)產(chǎn)生的全身血管性炎癥,并且男孩發(fā)病率遠(yuǎn)高于女孩[1]。KD發(fā)病常伴隨冠狀動脈瘤、冠狀動脈擴(kuò)張等多種并發(fā)癥,嚴(yán)重者可能導(dǎo)致心力衰竭、心肌梗死的發(fā)生[3]。KD嚴(yán)重影響到嬰幼兒的生命安全,但是其病因和發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明,該病尚未有明確診斷手段與特異性的生物標(biāo)志物,對于患兒早期疾病的診斷與治療帶來一定的困難。研究表明,兒童的這種異常免疫反應(yīng)可能與T細(xì)胞的異常啟動密切相關(guān)[9]。Treg細(xì)胞是一類具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群,能夠?qū)⒆陨砻庖吣褪芫S持在某個水平,抑制自身免疫,在自身免疫疾病的發(fā)生、發(fā)展等過程中發(fā)揮著重要作用[10]。Th17細(xì)胞是一類CD4+輔助性T細(xì)胞亞群,其在自身免疫反應(yīng)中起到促進(jìn)炎癥因子的作用[11],目前Treg/Th17細(xì)胞在誘導(dǎo)多種免疫疾病發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用,其比例的變化在某些程度上能夠指示疾病的進(jìn)程[12]。
本研究結(jié)果顯示觀察組炎癥因子各項(xiàng)指標(biāo)高于對照組,提示KD并發(fā)感染對患兒機(jī)體免疫傷害更大,釋放大量炎癥因子。機(jī)體內(nèi)TNF-α大量出現(xiàn),誘導(dǎo)表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞,使細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附分子大量增加,對血管內(nèi)壁造成較大的免疫損傷[13];IL-6和IL-8能夠增強(qiáng)免疫反應(yīng),導(dǎo)致患兒血管炎癥的出現(xiàn)[14]。白細(xì)胞個數(shù)、PLT、中性粒細(xì)胞百分比數(shù)、hs-CRP是兒科檢測感染的主要指標(biāo)[15],降鈣素原能夠早期明確檢測出患兒并發(fā)的感染和非感染性疾病,還有助于判斷患兒疾病的預(yù)后狀況,幫助醫(yī)生調(diào)整抗生素的治療方法[16]。陳璐[17]的研究結(jié)果與本研究結(jié)果相似,提示KD并發(fā)感染患兒C反應(yīng)蛋白、中性粒細(xì)胞數(shù)均高于未感染組,并且感染組患兒冠狀動脈傷害較大。本研究結(jié)果顯示,觀察組Treg、Th17細(xì)胞百分比及Treg/Th17比值明顯高于對照組,提示患兒機(jī)體內(nèi)存在Treg/Th17的平衡與失衡,KD并發(fā)感染過程中Treg、Th17在患兒體內(nèi)相互作用、相互調(diào)節(jié)。Treg和Th17細(xì)胞之間的平衡性是自身免疫疾病、神經(jīng)系統(tǒng)性炎性反應(yīng)等多種疾病的起因,Th17細(xì)胞能夠分泌釋放大量的白細(xì)胞介素-17(IL-17),進(jìn)而導(dǎo)致下游釋放大量的炎癥因子,造成組織器官的損傷,起到促炎的作用[11],而Treg細(xì)胞則通過一系列的直接或間接作用,起到抑炎的作用[10],本研究中觀察組Treg/Th17比例明顯升高,說明Treg與Th17參與了KD的發(fā)生,并且兩者與炎癥因子的變化密切相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),觀察組IgG、IgA、IgM、CD4+、NK細(xì)胞含量明顯升高,而CD3+、CD8+及CD4+/CD8+含量明顯降低,提示KD并發(fā)感染與體液免疫與細(xì)胞免疫密切相關(guān)。IgG、IgA、IgM等免疫球蛋白是體液免疫的重要免疫分子,在初級免疫反應(yīng)中起著重要作用[18],其能夠形成抗體,參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)。CD4+能夠促進(jìn)細(xì)胞免疫與體液免疫,而CD8+則能夠明顯抑制該過程,CD4+/CD8+比值變化會導(dǎo)致細(xì)胞免疫失調(diào),出現(xiàn)病理反應(yīng),CD4+與CD8+的平衡在自身免疫中也起到重要作用。孟慶祝等[19]研究表明KD感染肺炎支原體后細(xì)胞免疫與體液免疫發(fā)生紊亂,與本研究結(jié)果相似。KD合并感染患兒T細(xì)胞功能異常,T細(xì)胞被高活化后導(dǎo)致釋放大量淋巴因子,淋巴因子進(jìn)一步誘導(dǎo)B細(xì)胞分泌免疫球蛋白及其他的細(xì)胞因子,對血管造成炎性損傷。B細(xì)胞被活化后形成的抗體,對機(jī)體免疫起到調(diào)節(jié)作用,激活后的B細(xì)胞能夠發(fā)揮更強(qiáng)的免疫效應(yīng),更快地殺滅病原菌[20]。對細(xì)胞免疫與體液免疫相關(guān)因子的檢測,分析其變化對于KD合并感染患兒治療具有積極刺進(jìn)作用。
綜上所述,KD并發(fā)感染患兒體液免疫與細(xì)胞免疫更加紊亂,炎癥因子反應(yīng)更加強(qiáng)烈,兩者可能參與KD的病理過程。對患兒體液免疫、細(xì)胞免疫及炎癥相關(guān)因子的檢測,有助于患兒的早期診斷與治療。
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(收稿日期:2019-11-06? 本文編輯:任? ?念)