張逢溫 陳 誠 張賓樂 曹偉超 王 鳳 陳軍民 黃衛(wèi)寧 小川晃弘

(1. 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122； 2. 無錫麥吉貝可生物食品有限公司，江蘇 無錫 214131； 3. 三菱化學(xué)食品株式會社，日本 東京 1008251)

烘焙食品是全世界的主流食品[1]，其中蛋糕類產(chǎn)品是最受歡迎的烘焙食品之一。雞蛋作為蛋糕的主要成分，具有多種功能，包括起泡、乳化、賦予色澤和風(fēng)味[2]。然而，雞蛋是最常見的過敏源[3]，高膽固醇以及高昂的價格和市場價格波動[4]使生產(chǎn)商或研究者更加積極地尋求雞蛋替代品。其中以大豆蛋白和牛乳蛋白為代表的雙蛋白兼顧動、植物蛋白雙重營養(yǎng)優(yōu)勢，可以全面地改善人體機能，促進人類健康[5]。同時這兩種蛋白質(zhì)因其優(yōu)良的功能特性已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)[6-7]，并將這兩種蛋白作為雞蛋替代品應(yīng)用于蛋糕體系中[8-9]。

酸面團發(fā)酵技術(shù)可改善產(chǎn)品比容質(zhì)構(gòu)，提高營養(yǎng)價值及賦予特殊風(fēng)味[10-11]，其影響程度與乳酸菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生有機酸、酶和胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)[12-13]有關(guān)。胞外多糖在食品加工中可作為增稠劑、乳化劑以及冷凍保護劑等。湯曉娟[14]研究發(fā)現(xiàn)EPS可減少冰晶形成、保護面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)從而提高冷凍面團品質(zhì)；莊靚等[15]篩選出產(chǎn)具有乳化活性的胞外多糖的乳酸菌，并應(yīng)用于蕎麥面包中，發(fā)現(xiàn)EPS可增大面包比容和改善質(zhì)構(gòu)。然而乳酸菌產(chǎn)胞外多糖在面糊和蛋糕體系中的應(yīng)用尚未見報道。

試驗擬在大豆分離蛋白和乳清濃縮蛋白按一定比例復(fù)配替代全蛋制作蛋糕的基礎(chǔ)上，將乳酸菌發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用于蛋糕制作中，探究胞外多糖在攪打過程中對蛋白質(zhì)性質(zhì)的影響，旨在評估胞外多糖對無蛋蛋糕面糊特性和烘焙品質(zhì)的影響，為烘焙食品加工工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

綿白糖、大豆油：市售；

低筋小麥粉：美玫牌，粗蛋白含量8.2%，香港面粉有限公司；

大豆分離蛋白(SPI)：粗蛋白含量90%，山東御馨豆業(yè)蛋白有限公司；

乳清濃縮蛋白(WPC)：粗蛋白含量80%，山東億寶萊生物技術(shù)有限公司；

融合魏斯氏菌：分離自酒曲；

蔗糖酯型乳化劑：RTOYO菱友MFC(簡稱MFC)，三菱化學(xué)食品株式會社；

雙效泡打粉：廣州焙樂道食品有限公司；

MRS肉湯培養(yǎng)基：杭州百思生物技術(shù)有限公司；

BCA試劑盒：碧云天生物技術(shù)有限公司；

異硫氰酸酯(FITC)、羅丹明B：阿拉丁生化科技股份有限公司；

無水乙醇、三氯乙酸、溴酚藍等：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

攪拌機：5K5SS型，美國廚寶Kitchen Aid公司；

烤箱：SM-503型，新麥機械(無錫)有限公司；

冷凍切片機：CM1950型，德國徠卡公司；

質(zhì)構(gòu)分析儀：Brookfield CT3型，美國博勒飛公司；

高速勻漿機：FSH-2型，丹瑞儀器設(shè)備有限公司；

數(shù)字旋轉(zhuǎn)黏度計：NDJ-5S型，上海微川精密儀器有限公司；

熒光倒置顯微鏡：Zeiss Axio Vert.A1型，德國卡爾·蔡司公司；

激光共聚焦顯微鏡：LSM170型，德國卡爾·蔡司公司；

恒溫恒濕培養(yǎng)箱：APX-150C型，上海博迅集團有限公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)EPS乳酸菌發(fā)酵小麥粉的制備 在-80 ℃冰箱中取出產(chǎn)EPS乳酸菌菌株，菌株來源為實驗室前期篩選的融合魏斯氏菌[13,16]，在MRS液體培養(yǎng)基中活化兩次，7 000 r/min離心10 min，取菌泥。將菌泥加入到等質(zhì)量的小麥粉和無菌水中攪拌均勻，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，即得到乳酸菌發(fā)酵小麥粉。為了促進發(fā)酵粉中EPS的生成，在EPS陽性組中用蔗糖按質(zhì)量比替代10%的小麥粉，以不添加蔗糖的發(fā)酵粉為陰性組。

1.3.2 胞外多糖的提取 參照Ketabi等[17]的方法，修改如下：取10 g發(fā)酵小麥粉，加入20 mL去離子水稀釋，4 ℃ 振蕩1 h后離心(10 000×g，20 min，4 ℃)。取上清液與80%三氯乙酸混合至濃度為4%，4 ℃靜置過夜。離心(10 000×g，20 min，4 ℃)去沉淀，加入3倍體積95%乙醇至上清液中。4 ℃靜置12 h后再次離心(10 000×g，20 min，4 ℃)收集沉淀。用去離子水溶解沉淀，4 ℃透析(8 000～14 000 Da)48 h，每隔8 h換一次水，冷凍干燥。

1.3.3 蛋白溶液起泡能力和泡沫穩(wěn)定性的測定 用pH 7.0緩沖液配制含有0.5% MFC、濃度為1%的復(fù)合蛋白液(SPI和WPC質(zhì)量比3∶2)，添加0.5 mg/mL胞外多糖至蛋白溶液中(EPS+)，以未添加胞外多糖為對照(EPS-)，室溫下磁力攪拌2 h使其充分溶解。取80 mL溶液用高速勻漿機以10 000 r/min攪打0.0～2.5 min，立即倒入量筒記錄體積，靜置10 min后再次記錄溶液體積。分別按式(1)、(2)計算起泡能力和泡沫穩(wěn)定性[18]。

(1)

(2)

式中：

FC——起泡能力，%；

FS——泡沫穩(wěn)定性，%；

V0——攪打前蛋白溶液體積，mL；

V1——攪打后蛋白溶液體積，mL；

V2——靜置后蛋白溶液體積，mL。

1.3.4 液相蛋白表面疏水性的測定 分別取1.3.3中配制的含與不含胞外多糖的蛋白液，用高速勻漿機以10 000 r/min 分別攪打0.0～2.5 min，然后用20 mmol/L pH 6.0的磷酸鹽緩沖液將液相蛋白稀釋至濃度為5 mg/mL。根據(jù)Ilham等[19]的方法，按式(3)計算溴酚藍結(jié)合量。

(3)

式中：

B——溴酚藍結(jié)合量，μg；

200——換算因子，μg；

A0——空白吸光值；

A1——樣品吸光值。

1.3.5 液相蛋白含量的測定 取1.3.3中配制的含與不含胞外多糖的蛋白液，加入大豆油使油相體積為20%。持續(xù)攪拌至兩相混合均勻，然后用高速勻漿機以10 000 r/min 攪打0.0～2.5 min制備乳液。取一定量乳液以10 000 r/min離心40 min，用BCA試劑盒測定下清液中蛋白含量[20]。界面蛋白含量為體系總蛋白含量與液相蛋白含量的差值。

1.3.6 無蛋蛋糕面糊的制備及烘烤 無蛋蛋糕面糊配方如表1所示，分別用EPS陽性組(EPS+30)和EPS陰性組(EPS-30)發(fā)酵小麥粉替代30%的小麥粉(基于小麥粉的質(zhì)量)，額外的加水量需扣除發(fā)酵小麥粉的含水量。復(fù)合蛋白粉中SPI和WPC質(zhì)量比為3∶2。在攪拌鍋中稱取綿白糖、復(fù)合蛋白粉、蛋糕油和水以2檔1 min混合均勻，添加大豆油繼續(xù)2檔1 min混勻，添加發(fā)酵小麥粉以及過篩的低筋粉和雙效泡打粉，手動輕微翻攪以避免攪打時粉末揚起，以2檔1 min混勻，然后以6檔3 min攪打起泡，形成面糊。稱取150 g面糊于模具中，置于上火190 ℃，下火180 ℃的烤箱中烘烤25 min。烘烤結(jié)束后脫模，室溫下冷卻60 min。

表1 無蛋蛋糕面糊配方

1.3.7 面糊密度的測定 參照賈春利等[21]的方法。

1.3.8 面糊黏度的測定 參照王家寶等[22]的方法。

1.3.9 面糊微觀氣泡結(jié)構(gòu)觀察 參照湯曉娟等[23]的方法。

1.3.10 無蛋蛋糕比容的測定 采用油菜籽置換法測定蛋糕比容，分別測定蛋糕的質(zhì)量和體積，按式(4)計算蛋糕比容，試驗重復(fù)3次。

(4)

式中：

SV——無蛋蛋糕比容，cm3/g；

V——無蛋蛋糕體積，cm3；

m——無蛋蛋糕質(zhì)量，g。

1.3.11 無蛋蛋糕質(zhì)構(gòu)分析 將冷卻后的蛋糕切成高12 mm，直徑20 mm的薄片。參照王家寶等的方法測定[24]。

1.3.12 蛋糕芯微觀結(jié)構(gòu)觀察 用刀片切成適當大小的蛋糕芯，用包埋劑覆蓋在托盤上，然后立即置于-80 ℃冰箱中冷凍1 h，用冰凍切片機在-20 ℃下切割成30 μm切片，將其吸附于載玻片上。根據(jù)Wang等[25]的方法，修改如下：用1∶1(體積比)混合的異硫氰酸酯(FITC，3.5×10-4g/mL)和羅丹明B(1.3×10-5g/mL)染料對淀粉和蛋白質(zhì)染色1 min，用去離子水洗去多余染液，蓋上蓋玻片，采用激光共聚焦掃描顯微鏡進行觀察。

1.3.13 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2013和Origin 8.5軟件進行數(shù)據(jù)處理及圖表繪制，通過SPSS 16.0軟件進行顯著性和方差分析(ANOVA)，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 胞外多糖對攪打過程中復(fù)合蛋白液起泡性質(zhì)的影響

由圖1可知，蛋白起泡過程分為兩個階段：0～1 min攪打時間內(nèi)為快速起泡階段，之后為起泡速率變緩階段，與王寧等[26]研究攪打時間對蛋清蛋白起泡能力的變化趨勢一致。相比于EPS-，攪打過程中胞外多糖的添加有助于增加復(fù)合蛋白的起泡容量和起泡速率。Deep等[27]研究也發(fā)現(xiàn)胞外多糖可與乳清蛋白發(fā)生強或弱的相互作用，從而提高乳清蛋白的功能性質(zhì)，包括溶解性、起泡性等。

圖1 胞外多糖對攪打過程中復(fù)合蛋白起泡能力的影響

由圖2可知，泡沫穩(wěn)定性隨攪打時間的增加先快速降低后保持穩(wěn)定。泡沫作為氣液組成的分散體系，具有極大的表面自由能，在熱力學(xué)上屬于不穩(wěn)定體系，容易通過泡沫液體的排出和氣體的擴散而使泡沫破裂，穩(wěn)定性下降[28]。胞外多糖的添加顯著減緩蛋白泡沫穩(wěn)定性下降的速率，且在整個攪打過程中比EPS-擁有更高的穩(wěn)定性，是因為胞外多糖作為大分子能夠增加液相的黏度，調(diào)節(jié)液相間的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，減少泡沫表面液體的排出，從而提高泡沫體系的穩(wěn)定性[29]。

圖2 胞外多糖對攪打過程中復(fù)合蛋白泡沫穩(wěn)定性的影響

2.2 胞外多糖對攪打過程中液相蛋白表面疏水性的影響

由圖3可知，液相蛋白BPB結(jié)合量在0～1 min內(nèi)迅速下降，之后緩慢降低。蛋白溶液在攪打初期由于剪切力的作用使蛋白質(zhì)多肽鏈展開，更多的蛋白質(zhì)暴露內(nèi)部疏水基團而快速吸附至氣液界面形成泡沫，以至于液相中蛋白疏水性快速降低[30]；繼續(xù)攪打蛋白質(zhì)逐漸均勻地包裹氣泡形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，使得疏水性變化放緩，與復(fù)合蛋白起泡能力測定結(jié)果一致。未攪打時，EPS+溶液BPB結(jié)合量為91.9 μg，而EPS-溶液的為83.5 μg，表明EPS+具有更高的表面疏水性，說明胞外多糖與蛋白質(zhì)之間存在氫鍵或靜電等非共價相互作用，使得蛋白的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變從而暴露出更多的疏水區(qū)域。EPS+在未攪打時具有更高的疏水性，有利于蛋白質(zhì)更迅速地吸附至氣液界面并展開，從而加強復(fù)合蛋白的起泡能力。

圖3 胞外多糖對攪打過程中液相蛋白表面疏水性的影響

2.3 胞外多糖對攪打過程中液相蛋白含量的影響

由圖4可知，液相蛋白含量隨攪打時間的增加先降低后升高。初始階段液相蛋白含量降低是因為蛋白的起泡作用使其吸附至氣液界面，從而導(dǎo)致液相蛋白含量減少；而后液相蛋白含量增加是因為小分子乳化劑能夠與界面蛋白產(chǎn)生競爭吸附作用，使得界面上的蛋白被解吸下來從而導(dǎo)致液相蛋白含量增加，與趙強忠[31]研究結(jié)果一致。Goff等[32]運用顯微鏡觀察和界面流變手段對乳化劑取代界面蛋白機制進行解釋，在乳化劑取代界面蛋白初始階段，乳化劑吸附至界面上使得蛋白網(wǎng)絡(luò)被壓縮，蛋白膜厚度增加而界面蛋白未被取代，隨后乳化劑對界面蛋白的壓力進一步增大直至崩潰，使得蛋白質(zhì)從界面上解吸下來。

圖4 胞外多糖對攪打過程中液相蛋白含量的影響

進一步觀察發(fā)現(xiàn)，攪打初期EPS+比EPS-具有更低的界面蛋白含量，說明更多的蛋白質(zhì)吸附至氣液界面形成氣泡，表明攪打初期EPS+下清液蛋白表面疏水性降低得更快。隨著攪打時間的增加，EPS+中界面蛋白的解吸速率也更加緩慢。Dickinson等[33]發(fā)現(xiàn)多糖分子可以吸附至多個蛋白質(zhì)表面而交聯(lián)成橋，因此胞外多糖可能與界面蛋白產(chǎn)生交聯(lián)作用，使得蛋白質(zhì)受到多糖分子的保護而減少乳化劑對蛋白質(zhì)的競爭吸附，從而提高界面膜的厚度和黏彈性，進一步解釋了EPS+溶液具有更高的泡沫穩(wěn)定性。

2.4 胞外多糖對無蛋蛋糕面糊特性的影響

由表2可知，相比于對照組，經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵小麥粉制作的面糊具有更低的比重，其中EPS+30組比重降低得更為顯著(P<0.05)，是因為EPS+30組含有乳酸菌產(chǎn)的胞外多糖，可以增加蛋白起泡能力及穩(wěn)定氣泡，使得充入面糊的空氣量上升，同時也能更好地使氣泡穩(wěn)定在面糊內(nèi)。添加發(fā)酵小麥粉的面糊黏度增加，而含EPS的面糊黏度進一步增加。Llewellin等[34]研究表明面糊的充氣量與其黏度呈正相關(guān)，而EPS作為可溶于水的大分子多糖，其碳鏈的親水基團可以阻礙水分子的流動性，增加體系的黏稠度。更高的面糊黏度有助于延緩氣泡液膜排液的速度，抑制不穩(wěn)定氣泡的聚結(jié)和歧化，提升乳化體系的穩(wěn)定性，并改善烘烤時面糊的膨脹與定型情況。

表2 乳酸菌產(chǎn)胞外多糖對無蛋蛋糕面糊特性的影響?

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.5 胞外多糖對面糊微觀結(jié)構(gòu)的影響

由圖5可知，乳酸菌發(fā)酵小麥粉制作的面糊氣泡數(shù)量增多，氣泡平均直徑減小，而EPS+30組氣泡分布更均勻，充氣量進一步提高，與比重的測定結(jié)果一致。對照組異常氣泡數(shù)量最多，而含有EPS面糊幾乎沒有異常氣泡，可能是EPS具有穩(wěn)定氣泡的能力以及增大面糊體系黏度。異常氣泡直徑較大，是導(dǎo)致乳化體系不穩(wěn)定的關(guān)鍵因素[22]。

2.6 胞外多糖對無蛋蛋糕烘焙品質(zhì)的影響

由表3可知，相比于對照組，EPS-30組蛋糕比容增加了9.7%，而EPS+30組蛋糕比容提升了12.3%，比容越高的蛋糕會形成更柔軟的質(zhì)構(gòu)，而更高的充氣量和氣體保留率使得面糊在烘烤階段充分膨脹，從而增大比容。此外，EPS可與氣泡界面上蛋白質(zhì)交聯(lián)而提高氣泡膜的強度，使得氣泡在烘烤和出爐時能更好地抵抗溫度和水蒸汽帶來的壓力變化，減少結(jié)構(gòu)收縮甚至崩塌[35]。添加乳酸菌發(fā)酵粉的蛋糕硬度降低了37.5%，而含EPS的發(fā)酵小麥粉蛋糕組硬度降低得更加顯著(P<0.05)，下降了43.0%，蛋糕硬度越低說明蛋糕口感更加柔軟。Lillford等[36]研究表明蛋糕的質(zhì)構(gòu)特征取決于面糊乳液和泡沫體系形成的固體泡沫的結(jié)構(gòu)，而這種結(jié)構(gòu)與面糊體系維持乳液穩(wěn)定及加熱時泡沫抗壓力變形的能力有關(guān)。Wilderjans等[37]研究表明蛋白聚集程度影響蛋糕彈性，乳酸菌發(fā)酵小麥粉的添加使得蛋糕彈性降低，可能是發(fā)酵粉中激活的內(nèi)源蛋白酶有利于蛋白質(zhì)降解，而胞外多糖的添加有助于改善彈性的劣變。咀嚼性能反映食物在口中咀嚼所需的能量，與蛋糕品質(zhì)呈負相關(guān)，其變化趨勢與硬度一致。

紅色箭頭表示異常氣泡

表3 乳酸菌產(chǎn)胞外多糖對無蛋蛋糕烘焙品質(zhì)的影響?

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.7 蛋糕芯微觀結(jié)構(gòu)觀察

由圖6可知，蛋白網(wǎng)絡(luò)呈現(xiàn)較為松散的片狀排布，存在較明顯的球狀蛋白。含有胞外多糖的蛋糕中呈現(xiàn)出條狀的蛋白束結(jié)構(gòu)且分布更加均勻，蛋白質(zhì)與多糖大分子發(fā)生氫鍵或非氫鍵結(jié)合，使較為松散的蛋白網(wǎng)絡(luò)更加緊密和連續(xù)。雞蛋制作的蛋糕中，具有低變性溫度和大量巰基基團的雞蛋蛋白容易與面筋蛋白形成連續(xù)的蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[38]；而無蛋蛋糕中，復(fù)合蛋白與面筋蛋白更低的交聯(lián)度使得蛋白網(wǎng)絡(luò)不連續(xù)，并且由于大豆蛋白、乳清蛋白和麥醇溶蛋白中的大分子球蛋白具有較高的變性溫度，蛋糕中仍保持較完整的球狀結(jié)構(gòu)[38]。經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵，在酸解以及內(nèi)源蛋白酶的作用下，大分子蛋白降解為更小蛋白或多肽，并且暴露出更多的活性基團，從而加強了蛋白網(wǎng)絡(luò)的形成。Ashwini等[39]研究發(fā)現(xiàn)多糖和乳化劑組合使得無蛋蛋糕中的蛋白質(zhì)基質(zhì)更加連續(xù)且均勻。連續(xù)且均勻的蛋白網(wǎng)絡(luò)是形成蛋糕良好質(zhì)構(gòu)的基礎(chǔ)并且能有效防止蛋糕收縮和變形[40]。

圖6 無蛋蛋糕芯激光共聚焦微觀結(jié)構(gòu)圖

3 結(jié)論

研究表明，乳酸菌產(chǎn)胞外多糖對復(fù)合蛋白性質(zhì)以及無蛋蛋糕面糊特性和烘焙品質(zhì)有積極影響。攪打過程中，胞外多糖通過提高復(fù)合蛋白表面疏水性和降低乳化劑的競爭吸附從而顯著提高復(fù)合蛋白的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性(P<0.05)。面糊體系中，產(chǎn)胞外多糖乳酸菌發(fā)酵能顯著增加面糊氣泡數(shù)量(P<0.05)，使氣泡分布更均勻，從而降低面糊密度，增加面糊黏度。相比對照組，EPS+30組比容增加了12.3%，硬度降低了43.0%，烘焙品質(zhì)顯著改善(P<0.05)。蛋糕芯顯微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)的降解以及胞外多糖的交聯(lián)作用使得蛋白網(wǎng)絡(luò)更加連續(xù)且均勻，從而改善蛋糕芯結(jié)構(gòu)。綜上，乳酸菌產(chǎn)胞外多糖在無蛋蛋糕體系中具有良好的應(yīng)用效果，能顯著改善無蛋蛋糕的烘焙品質(zhì)(P<0.05)。乳酸菌產(chǎn)胞外多糖具有不同類型，試驗并未涉及胞外多糖類型對無蛋蛋糕品質(zhì)的影響，有待進一步探究。