小?？Х裙た傸S酮提取工藝優(yōu)化及其體外抗氧化活性分析

王彥兵 王曉媛 肖兵 尹紅星 劉小瓊 張洪波 戴余波 李錦紅

摘要：【目的】優(yōu)化咖啡果皮總黃酮的超聲波輔助提取工藝條件，并分析其體外抗氧化活性，為咖啡果皮的綜合利用提供理論基礎(chǔ)。【方法】以小?？Х裙樵稀⒁掖既芤簽樘崛?，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲波時(shí)間和超聲波溫度4個(gè)因素為自變量，咖啡果皮總黃酮提取率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，研究各自變量及其交互作用對咖啡果皮總黃酮提取率的影響，確定最佳提取工藝，并比較咖啡果皮總黃酮和L-抗壞血酸的抗氧化活性。【結(jié)果】4個(gè)因素對咖啡果皮總黃酮提取率的影響排序?yàn)槌暡〞r(shí)間>料液比>乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲波溫度，其中乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和超聲波時(shí)間對總黃酮提取率有極顯著影響（P<0.01），超聲波時(shí)間與超聲波溫度的交互作用對總黃酮提取率有顯著影響（P<0.05）?？Х裙た傸S酮提取工藝條件經(jīng)優(yōu)化后為：乙醇體積分?jǐn)?shù)41%、料液比1∶46（g/mL）、超聲波時(shí)間44 min、超聲波溫度60 ℃，在此條件下，得到的實(shí)際提取率（6.99±0.02）%與預(yù)測值（7.02%）的相對誤差小?？Х裙た傸S酮對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基和羥自由基有一定的清除能力，其半清除濃度（IC50）分別為3.93和297.23 μg/mL，清除能力分別是L-抗壞血酸的61%和17%?？Х裙た傸S酮具有一定還原力，還原力隨質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)?！窘Y(jié)論】響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取咖啡果皮總黃酮工藝切實(shí)可行，建立的回歸模型擬合度和重現(xiàn)性較好，提取的總黃酮具有一定抗氧化能力。咖啡果皮可作為一種天然抗氧化劑來源在食品、醫(yī)藥等方面進(jìn)行開發(fā)利用。

關(guān)鍵詞： 咖啡果皮;總黃酮;提取工藝;響應(yīng)面;抗氧化活性

中圖分類號： S571.2;TS201.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）02-0385-09

Optimization of extracting total flavonoids from Coffea arabica peel and its antioxidant activity in vitro

WANG Yan-bing， WANG Xiao-yuan， XIAO Bing， YIN Hong-xing， LIU Xiao-qiong，ZHANG Hong-bo， DAI Yu-bo， LI Jin-hong*

（Dehong Tropical Agriculture Institute of Yunnan， Ruili， Yunnan? 678600， China）

Abstract：【Objective】The optimization of process parameters for ultrasonic-assisted extraction of total flavonoids from Coffea arabica（coffee） peel was investigated in this study. Meanwhile，the antioxidant activity in vitro was studied to provide a theoretical basis for the comprehensive utilization of coffee peel. 【Method】Using coffee peel as raw material， ethanol solution as the extraction agent，coffee peel total flavonoids extraction yield as the response value，based on single-factor tests，Box-Benhnken center composite experiment was carried out with four factors， including ethanol volume fraction，solid-liquid ratio，ultrasonic time and ultrasonic temperature. Studying the effects of each variable and its interaction on the extraction rate of total flavonoids from coffee peel， determining the optimum extraction technology and comparing the antioxidant activity of total flavonoids in coffee peel with that of L-ascorbic acid. 【Result】The effects of four factors on the extraction rate of total flavonoids from coffee peel was as follows： ultrasonic time>solid-liquid ratio>ethanol volume fraction>ultrasonic temperature. Ethanol volume fraction，solid-liquid ratio and ultrasonic time had extremely significant influence on total flavonoids yield（P<0.01）. The interaction between ultrasonic time and ultrasonic temperature had significant influence on total flavonoids yield （P<0.05）. The optimum technology conditions of total flavonoids from coffee peel were obtained as follows： ethanol volume fraction 41%，solid-liquid ratio 1∶46 g/mL，ultrasonic time 44 min，ultrasonic temperature 60 ℃. Under the above optimum conditions，the total flavonoids content of coffee peel reached up to （6.99±0.02）%，which was close to the theoretical value（7.02%）. Antioxidant evaluation showed that coffee peel flavonoids had certain scavenging abilities towards 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH） and hydroxyl free radical，and the cleanrance abilities were 61% and 17% of L-ascorbic acid，with the half cleanrance concentration（IC50） values being of 3.93 μg/mL and 297.23 μg/mL. The total flavones of coffee peel had certain reducibility，and the reducing power increased with the increase of mass concentration. 【Conclusion】The response surface method can optimize the ultrasonic assisted extraction of total flavonoids from coffee peel，and the established regression model has good fitting degree and reproducibi-lity. Extracted coffee peel total flavonoids has? antioxidant capacity. Coffee peel can be developed as a natural source of antioxidants in food industry and pharmacy， etc.

Key words： coffee peel; total flavonoids; process optimization; response surface analysis; antioxidant activity

Foundation item： National International Scientific and Technological Cooperation Project（2014DFG32400）;Conservation of Species and Varieties（Tropical Crops） Project of Ministry of Agriculture and Rural Affairs（151813013540-52710）;Yunnan Major Science and Technology Special Project（2018ZG014）;Yunnan Science and Technology Project（2016DC026）

0 引言

【研究意義】咖啡屬茜草科（Rubiaceae）咖啡屬（Coffea）小喬木或大灌木，與可可、茶葉并稱為世界三大飲料，是僅次于石油的第二大貿(mào)易商品（Behrouzian et al.，2016）。我國是咖啡種植國之一，產(chǎn)區(qū)主要集中在云南和海南，產(chǎn)量占全球總量的1.5%，其中云南小?？Х确N植面積及生豆產(chǎn)量均占全國咖啡產(chǎn)業(yè)的98%以上，在我國咖啡產(chǎn)業(yè)中占有舉足輕重的地位（代正明等，2018;匡鈺等，2018）。咖啡果皮是咖啡加工過程的初級副產(chǎn)物，約占咖啡干重的29.0%（Janissen and Huynh，2017）。云南小?？Х榷嗖捎冒霛穹ê蜐穹ㄟM(jìn)行脫皮，每干制生產(chǎn)1 t咖啡豆，產(chǎn)生的咖啡果皮達(dá)2 t以上（Prata and Oliveira，2007;匡鈺等，2018）。國內(nèi)對咖啡果皮的利用尚停留在初級階段，除部分用于堆肥外，大部分被當(dāng)作廢棄物丟棄，造成極大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染（王丹丹等，2019）?？Х裙じ缓w維素、蛋白質(zhì)、總糖、氨基酸、脂肪酸及花青素（張?jiān)弃Q等，2016）和蘆?。℉eeger et al.，2017）等黃酮類物質(zhì)，營養(yǎng)成分豐富，具有較高的開發(fā)利用價(jià)值（胡榮鎖等，2018）。植物源黃酮類物質(zhì)具有抗痙攣、抑菌、消炎、清除自由基和抑制致癌化合物誘變等功效，是國內(nèi)外食品、藥品及保健品等相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)（Li et al.，2009;方芳和王鳳忠，2018;Perez-Vizcaino and Fraga，2018;王彥兵等，2019;張煥新等，2019）。因此，研究咖啡果皮總黃酮提取工藝及其抗氧化活性，對提高咖啡資源綜合利用率及其附加值具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在咖啡加工副產(chǎn)物的黃酮提取方面，劉鑫和高彥祥（2011）研究了靜態(tài)亞臨界水提取脫脂咖啡渣中黃酮類物質(zhì)的工藝，在最佳提取條件（提取溫度170 ℃、時(shí)間45 min、料液比1∶50）下，黃酮提取率為6.97%。在咖啡果皮綜合利用方面，國內(nèi)主要集中在花青素提取（張?jiān)弃Q等，2016）、果皮茶制作（羅婭婷等，2018）和膳食纖維提?。ㄍ醯ささ?，2019）等方面，而國外對其研究范圍較廣，包括酶（Pandey et al.，2000;Dias et al.，2015;Bhoite and Murthy，2015）和有機(jī)酸（Pleissner et al.，2016）提取、生物基質(zhì)（Pandey et al.，2000）和青貯飼料（Salinas-Rios et al.，2015）制備、綠色能源（Corro et al.，2013;Menezes et al.，2014）開發(fā)等。漿果類普遍富含黃酮類物質(zhì)，皮渣作為其加工工程中的副產(chǎn)物，可為天然黃酮的開發(fā)提供大量原材料。焦巖等（2013）應(yīng)用正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助提取獼猴桃果皮總黃酮工藝，最佳條件（液固比30∶1、提取時(shí)間40 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取溫度60 ℃）下的黃酮提取率為2.68%;羅群等（2013）利用正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助提取石榴皮黃酮工藝，在最佳工藝條件（提取溫度75 ℃、提取時(shí)間20 min、超聲功率400 W、料液比1∶20、超聲間歇時(shí)間5 s/3 s、提取次數(shù)1次）下黃酮提取率為5.97%;黃正虹（2014）利用正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助提取葡萄皮黃酮工藝，在最佳工藝條件（超聲處理功率250 W、液固比50∶1、超聲處理溫度50 ℃、超聲處理時(shí)間60 min）下得到黃酮提取率為6.20%;馮智鵬等（2017）利用正交試驗(yàn)優(yōu)化乙醇浸提法提取沙棘果渣黃酮工藝，在最佳條件下得到黃酮提取率為1.72%?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，對于咖啡果皮黃酮提取及其功能的研究鮮見報(bào)道，極大限制了咖啡果皮資源的綜合開發(fā)利用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以小粒咖啡果皮為試驗(yàn)材料，優(yōu)化咖啡果皮總黃酮超聲波輔助提取工藝，并對其體外自由基清除能力和還原力進(jìn)行研究，旨在為咖啡果皮資源的綜合利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

新鮮小?？Х裙麑?shí)（品種為卡蒂姆CIFC7963）采摘于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部瑞麗咖啡種質(zhì)資源圃，洗凈后采用半濕法脫皮脫膠，收集果皮，蒸餾水多次清洗，去除果膠，50 ℃真空干燥，粉碎過60目篩，常溫保存?zhèn)溆谩?，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，生物試劑）購自山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥98%）購自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司;亞硝酸鈉、硝酸鋁、硫酸亞鐵、氫氧化鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵、抗壞血酸和無水乙醇均為分析純，購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉（優(yōu)級純）購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;三氯乙酸（分析純）購自成都市科隆化學(xué)品有限公司;水楊酸（分析純）購自上?；瘜W(xué)試劑有限公司試劑一廠。主要儀器設(shè)備：VOS-90A真空干燥箱[施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司]、ME201電子天平[梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司]、SB25-12DTS超聲波雙頻清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）、T6紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、CT14D臺式高速離心機(jī)（上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司）和Labonova Smar超純水機(jī)（德國Think-lab公司）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 果皮總黃酮提取流程 稱取1.0 g咖啡果皮樣品粉末→特定條件下超聲波提取→離心→吸取上清液→待測。

1. 2. 2 總黃酮含量測定

1. 2. 2. 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 參照王彥兵等（2019）的方法。繪制蘆丁質(zhì)量濃度（x）與吸光值（y）間的線性關(guān)系，得到回歸方程：y=11.6740x-0.0019（R2=0.9996）。

1. 2. 2. 2 總黃酮提取率計(jì)算 將待測液稀釋，取適量于10 mL比色管中，按1.2.2.1的方法計(jì)算稀釋液總黃酮質(zhì)量濃度，根據(jù)公式（1）計(jì)算提取率。

總黃酮提取率（%）=[C×n×Vm×10]? ? ? ?（1）

式中，C為提取液中總黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL），n為稀釋倍數(shù)，V為提取液總體積（mL），m為咖啡果皮質(zhì)量（g），10為轉(zhuǎn)換系數(shù)。

1. 2. 3 單因素試驗(yàn)

1. 2. 3. 1 乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇 固定料液比1∶30（g/mL，下同）、超聲波時(shí)間50 min、超聲波溫度50 ℃，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%、70%和80%條件下的咖啡果皮總黃酮提取率。

1. 2. 3. 2 料液比選擇 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、超聲波時(shí)間50 min、超聲波溫度50 ℃，考察料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60條件下的咖啡果皮總黃酮提取率。

1. 2. 3. 3 超聲波時(shí)間選擇 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、料液比1∶40、超聲波溫度50 ℃，考察超聲波時(shí)間為30、40、50、60、70和80 min條件下的咖啡果皮總黃酮提取率。

1. 2. 3. 4 超聲波溫度選擇 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、料液比1∶40、超聲波時(shí)間40 min，考察超聲波溫度為30、40、50、60、70和80 ℃條件下的咖啡果皮總黃酮提取率。

1. 2. 4 響應(yīng)面優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-behnken中心組合原理，以咖啡果皮總黃酮提取率為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲波提取工藝。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

1. 2. 5 抗氧化活性研究

1. 2. 5. 1 DPPH自由基清除率測定 參照王彥兵等（2019）的方法，選用L-抗壞血酸作陽性對照。根據(jù)公式（2）計(jì)算DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率（%）=[1-Ai-AjAc]×100 （2）

式中，Ai為樣品溶液吸光值，Aj為無水乙醇代替DPPH溶液的對照組吸光值，Ac為純水代替樣品溶液的空白組吸光值。

1. 2. 5. 2 羥自由基清除率測定 參照王彥兵等（2019）的方法，選用L-抗壞血酸作陽性對照。根據(jù)公式（3）計(jì)算羥自由基清除率：

羥自由基清除率（%）=[1-A-A1A0]×100 （3）

式中，A為樣品溶液吸光值，A1為純水代替過氧化氫溶液的對照組吸光值，A0為純水代替樣品溶液的空白組吸光值。

1. 2. 5. 3 總還原能力測定 參照符群等（2019）的方法并加以改進(jìn)：用蒸餾水將樣品溶液分別稀釋至10.0、20.0、40.0、60.0、80.0和100.0 μg/mL，分別吸取樣品稀釋溶液1.0 mL，均加入0.2 mol/L磷酸鈉緩沖液2.0 mL和1.0%鐵氰化鉀溶液2.0 mL，混勻，50 ℃水浴20 min，迅速冷卻后加入10.0%三氯乙酸溶液2.0 mL，混勻。將混合溶液稀釋2倍后吸取4.0 mL置于10 mL比色管中，加入0.1%三氯化鐵溶液0.4 mL，混勻，以蒸餾水為參比，測定溶液在700 nm波長處吸光值（A）。以同濃度L-抗壞血酸作陽性對照。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)測定。采用Design-Expert 8.0.6、DPS 2000和Origin 8.5進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2. 1. 1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對咖啡果皮總黃酮提取率的影響 如圖1所示，在30%～40%范圍內(nèi)，咖啡果皮總黃酮提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而升高，在40%時(shí)達(dá)最大值（6.07%），顯著高于其他乙醇體積分?jǐn)?shù)下的總黃酮提取率（P<0.05，下同）;在40%～80%范圍內(nèi)，增大乙醇體積分?jǐn)?shù)，總黃酮提取率降低。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)不斷增大，溶液極性逐漸減小，當(dāng)乙醇溶液與提取物極性相近時(shí)，總黃酮提取率達(dá)最大值。因此，后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)將乙醇體積分?jǐn)?shù)設(shè)定為30%～50%。

2. 1. 2 料液比對咖啡果皮總黃酮提取率的影響

如圖2所示，料液比為1∶10～1∶40時(shí)，咖啡果皮總黃酮提取率隨提取溶劑體積的增大而升高，料液比為1∶40時(shí)達(dá)最大值（6.73%），料液比為1∶40～1∶60時(shí)，總黃酮提取率有所降低。一定范圍內(nèi)，增大溶劑體積有利于黃酮溶出;但溶劑體積不斷增大，會導(dǎo)致雜質(zhì)大量溶出，黃酮有效溶出減少。料液比1∶40與1∶50間的總黃酮提取率無顯著差異（P>0.05，下同），但與料液比1∶30差異顯著，因此，后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)料液比設(shè)定為1∶30～1∶50。

2. 1. 3 超聲波時(shí)間對咖啡果皮總黃酮提取率的影響 如圖3所示，咖啡果皮總黃酮提取率隨超聲波時(shí)間的延長呈先升后降的變化趨勢，當(dāng)超聲波時(shí)間為40 min時(shí)，總黃酮提取率最高（6.69%）。一定范圍內(nèi)，延長超聲波時(shí)間有利于黃酮溶出;但長時(shí)間超聲受熱易破壞黃酮類物質(zhì)的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，加之雜質(zhì)溶出增多，使有效黃酮類物質(zhì)溶出減少。超聲波時(shí)間40 min與30 min的總黃酮提取率間差異顯著，與超聲波時(shí)間50 min的提取率差異不顯著，但提取率呈減少趨勢，因此，后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)將超聲波時(shí)間設(shè)定為30～50 min。

2. 1. 4 超聲波溫度對咖啡果皮總黃酮提取率的影響 超聲波溫度為30～60 ℃時(shí)，咖啡果皮總黃酮提取率隨超聲波溫度的升高而顯著增加，在60 ℃時(shí)達(dá)最大值（6.93%），超聲波溫度為60～80 ℃時(shí)，總黃酮提取率逐漸降低（圖4）。升高溫度可加快黃酮溶出，但溫度過高，雜質(zhì)溶出亦增多，加之黃酮類物質(zhì)不耐高溫，使其有效溶出減少。60 ℃的提取率與其他超聲波溫度的提取率間差異顯著，因此，后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)將超聲波溫度設(shè)定為50～70 ℃。

2. 2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2. 2. 1 回歸模型及方差分析結(jié)果 應(yīng)用Design- Expert 8.0.6，設(shè)計(jì)以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、超聲波時(shí)間（C）和超聲波溫度（D）為自變量的4因素3水平共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)（表2）。試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)多元回歸擬合，得到咖啡果皮總黃酮提取率（Y）與4個(gè)自變量之間的四元二次回歸模型：Y=6.94+0.061A+0.071B+0.32C+0.017D+0.030AB-0.010AC+0.027AD+0.025BC+0.018BD+0.063CD-0.51A2-0.067B2-0.44C2-0.58D2。

由表3可知，經(jīng)方差分析，模型（P<0.0001）極顯著，失擬度（P=0.5466>0.05）不顯著，說明該模型切實(shí)可行;R2adj=0.9818，表明提取率變異中僅1.82%不能由該模型解釋;相關(guān)系數(shù)R2=0.9909，說明試驗(yàn)值與預(yù)測值擬合較好;變異系數(shù)（CV=0.93%）<5%，表明試驗(yàn)可靠性高，重復(fù)性好。由F、P及顯著性水平差異可知，4因素對咖啡果皮總黃酮提取率的影響排序?yàn)椋篊>B>A>D。一次項(xiàng)A、B和C及二次項(xiàng)A2、C2和D2對響應(yīng)值的影響達(dá)極顯著水平（P<0.01，下同）;交互項(xiàng)CD和二次項(xiàng)B2對響應(yīng)值的影響達(dá)顯著水平。

2. 2. 2 響應(yīng)面分析結(jié)果 4個(gè)因素交互作用對咖啡果皮總黃酮提取率影響的響應(yīng)面如圖5所示。各因素的變化均為開口向下的拋物線，響應(yīng)曲面呈山峰狀，即各因素變化趨勢是先增加后減少，存在極大值，與單因素試驗(yàn)結(jié)果相符。從圖5可看出，超聲波時(shí)間與超聲波溫度交互作用的響應(yīng)曲面表現(xiàn)最陡峭，其交互作用顯著，與方差分析結(jié)果相符。

2. 2. 3 提取工藝確定及驗(yàn)證 優(yōu)化后的提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)40.75%、料液比1∶46.17、超聲波時(shí)間43.79 min、超聲波溫度60.47 ℃，咖啡果皮總黃酮的理論提取率為7.02%。為便于操作，修正工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)41%、料液比1∶46、超聲波時(shí)間44 min、超聲波溫度60 ℃。在此條件下，經(jīng)3次重復(fù)試驗(yàn)得到的咖啡果皮總黃酮實(shí)際提取率為（6.99±0.02）%，與理論值相對誤差為0.43%，表明建立的回歸模型準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，優(yōu)化設(shè)計(jì)方案切實(shí)可行。

2. 3 抗氧化活性分析結(jié)果

2. 3. 1 DPPH自由基清除能力 咖啡果皮總黃酮和L-抗壞血酸對DPPH自由基的清除率如圖6所示。由圖6可知，DPPH自由基清除率隨咖啡果皮總黃酮和L-抗壞血酸質(zhì)量濃度的增加呈上升趨勢，質(zhì)量濃度為20.0 μg/mL時(shí)，二者的清除率分別為92.16%和98.81%?？Х裙た傸S酮對DPPH自由基清除率的抑制方程為y=3.8755+1.893x（R2=0.9914），半清除濃度（IC50）=3.93 μg/mL;L-抗壞血酸對DPPH自由基清除率的抑制方程為y=4.0927+2.398x（R2=0.9904），IC50=2.39 μg/mL。由IC50可看出咖啡果皮總黃酮對DPPH自由基清除能力是L-抗壞血酸的61%。

2. 3. 2 羥自由基清除能力 如圖7所示，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，咖啡果皮總黃酮和L-抗壞血酸對羥自由基清除能力的量效關(guān)系顯著，質(zhì)量濃度為400.0 μg/mL時(shí)，二者的清除率分別為60.47%和96.30%?？Х裙た傸S酮對羥自由基清除率的抑制方程為y=0.1721+1.9738x（R2=0.9889），IC50=297.23 μg/mL;L-抗壞血酸對羥自由基清除率的抑制方程為y=1.8751+1.8668x（R2=0.9966），IC50=47.20 μg/mL。由IC50可看出咖啡果皮總黃酮對羥自由基清除能力是L-抗壞血酸的17%。

2. 3. 3 總還原能力 還原力以吸光值衡量，吸光值越大，還原力越強(qiáng)。由圖8可知，在10.0～100.0 μg/mL范圍內(nèi)，隨咖啡果皮總黃酮和L-抗壞血酸質(zhì)量濃度的升高，吸光值不斷增大，即還原力增強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度為100.0 μg/mL時(shí)，果皮總黃酮和L-抗壞血酸的還原力吸光值分別為0.871和0.869，表明咖啡果皮總黃酮具有一定還原力。

3 討論

超聲波輔助是提取植物總黃酮的常用方法，具有操作方便、省時(shí)、提取率高等優(yōu)點(diǎn);乙醇溶劑作為提取劑，安全無毒且可回收利用（方芳和王鳳忠，2018;何軍，2019）。影響超聲波輔助乙醇提取植物總黃酮的因素較多，包括乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲波時(shí)間、超聲波溫度等，影響因素的改變可導(dǎo)致總黃酮有效溶出及穩(wěn)定性的改變。本研究利用4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化咖啡果皮總黃酮超聲波輔助提取工藝，建立了咖啡果皮總黃酮提取率的回歸模型，模型穩(wěn)定可靠、切實(shí)可行，各工藝條件對總黃酮提取率的影響排序?yàn)槌暡〞r(shí)間>料液比>乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲波溫度。其中，超聲波時(shí)間、料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對咖啡果皮總黃酮提取率有極顯著影響，超聲波時(shí)間與超聲波溫度的交互作用對總黃酮提取率影響顯著。最佳條件經(jīng)回歸模型優(yōu)化為：乙醇體積分?jǐn)?shù)41%、料液比1∶46、超聲波時(shí)間44 min、超聲波溫度60 ℃，在此條件下的總黃酮提取率為（6.99±0.02）%，高于獼猴桃皮（2.68%）（焦巖等，2013）、石榴皮（5.97%）（羅群等，2013）、葡萄皮（6.20%）（黃正虹，2014）和沙棘皮渣（1.72%）（馮智鵬等，2017）等漿果類果皮的黃酮提取率?？梢姡Х裙ぷ鳛槌跫壖庸じ碑a(chǎn)物，具有重要的開發(fā)研究價(jià)值。

自由基與腫瘤及心血管疾病密切相關(guān)，天然抗氧化劑具有清除自由基功效，因此從植物中提取抗氧化劑已逐漸成為醫(yī)藥、食品及材料等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)（Li et al.，2011）。目前，由于體內(nèi)活性研究投入大、耗時(shí)長，抗氧化活性物質(zhì)篩選集中于體外模擬測定（熊雙麗等，2012）。本研究結(jié)果表明，咖啡果皮總黃酮對DPPH自由基和羥自由基具有清除作用，一定范圍內(nèi)，清除能力隨質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)，但其清除效果低于L-抗壞血酸，可能是因?yàn)樵囼?yàn)所用的咖啡果皮總黃酮純度不高，一定量的雜質(zhì)會影響黃酮類物質(zhì)的共軛結(jié)構(gòu)?？Х裙た傸S酮對DPPH自由基和羥自由基清除能力的IC50分別為3.93和297.23 μg/mL，分別是L-抗壞血酸清除能力的61%和17%，表明咖啡果皮總黃酮具有一定的抗氧化性，但對不同自由基清除能力存在差異，是由黃酮類化合物結(jié)構(gòu)所決定，其羥基數(shù)量和位置直接影響抗氧化活性（張黎明等，2014）。此外，咖啡果皮總黃酮具有一定的還原力，為其發(fā)揮抗氧化作用提供了可能。因此，下一步將開展分離和純化咖啡果皮總黃酮及確定有效抗氧化成分結(jié)構(gòu)研究。

4 結(jié)論

響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取咖啡果皮總黃酮工藝條件切實(shí)可行，提取率高，回歸模型可用于實(shí)際生產(chǎn)預(yù)測;提取的咖啡果皮總黃酮具有一定抗氧化能力，咖啡果皮可作為一種天然抗氧化劑來源在食品、醫(yī)藥等方面進(jìn)行開發(fā)利用。

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