HCV RNA定量檢測(cè)系統(tǒng)性能驗(yàn)證方案的制定

廖威，方麗娟，鄧旭怡，羅小琴，雷春洪，王剛

（江西迪安華星醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330096）

檢測(cè)系統(tǒng)的分析性能驗(yàn)證是臨床檢驗(yàn)質(zhì)量管理 的 重 要 內(nèi) 容 。 CNAS-CL02：2012 （ISO15189：2012IDT）[1]指出，在常規(guī)應(yīng)用前，應(yīng)由實(shí)驗(yàn)室對(duì)未加修改而使用的已確認(rèn)的檢驗(yàn)程序進(jìn)行獨(dú)立驗(yàn)證。驗(yàn)證過(guò)程證實(shí)的檢驗(yàn)程序的性能指標(biāo)，應(yīng)與檢驗(yàn)結(jié)果的預(yù)期用途相關(guān)。CNAS-CL02-A009[2]指出，定量檢測(cè)方法和程序的分析性能驗(yàn)證內(nèi)容至少包括精密度、正確度、線性范圍、抗干擾能力等驗(yàn)證。正常健康人體內(nèi)不含HCV-RNA，所以檢出限的驗(yàn)證也是重要的驗(yàn)證環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)室HCV-RNA定量檢測(cè)系統(tǒng)使用磁珠法提取核酸,提取效率較柱抽提法高[3]。由于PCR檢測(cè)項(xiàng)目相對(duì)其他專業(yè)的檢測(cè)項(xiàng)目來(lái)說(shuō)，驗(yàn)證的標(biāo)本獲取相對(duì)困難，且驗(yàn)證內(nèi)容和驗(yàn)證方法不完全一致。本文以CNAS文件和中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)頒布的系列文件為依據(jù),對(duì)新使用的HCV-RNA定量檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行性能驗(yàn)證，評(píng)估并分析其臨床應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 HCV-RNA低值S5和高值S3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來(lái)自北京康徹斯坦生物技術(shù)有限公司；2017年和2018年衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)評(píng)標(biāo)本，共 10 份,編號(hào)為：201721～201725、201811～201815；HCV-RNA高值陽(yáng)性血清為本實(shí)驗(yàn)室收集的高濃度臨床陽(yáng)性標(biāo)本；HCV-RNA陰性血清為本實(shí)驗(yàn)室收集的已證實(shí)肝功能、乙肝兩對(duì)半、丙肝抗體和HCV RNA全為陰性的體檢標(biāo)本。所有標(biāo)本于-70℃冰箱保存。

1.2 儀器與試劑 美國(guó)ABI7500熒光定量PCR儀,湖南圣湘生物科技有限公司丙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ?批號(hào)2018001。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 精密度驗(yàn)證 參照WS/T 492-2016[4]文件。將HCV-RNA高濃度陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行10倍梯度稀釋至濃度范圍 為106 IU/ml和103 IU/ml的高低兩個(gè)濃度水平，每天分析一個(gè)批次，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定4次，連續(xù)測(cè)定5d，每個(gè)水平累計(jì)得到20個(gè)數(shù)據(jù)。計(jì)算批內(nèi)精密度(CV批內(nèi))和總精密度(CV批總)。

1.3.2 標(biāo)本攜帶污染驗(yàn)證 使用HCV-RNA高濃度陽(yáng)性標(biāo)本44例、陰性標(biāo)本44例，交叉排列。同時(shí)提取、擴(kuò)增，驗(yàn)證檢測(cè)系統(tǒng)抗污染能力。要求陰性血清檢測(cè)結(jié)果仍為陰性，則驗(yàn)證通過(guò)。

1.3.3 正確度驗(yàn)證 檢測(cè)衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心2017年和2018年全國(guó)室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)的標(biāo)本10個(gè)（編號(hào)為：201721～201725；201811～201815）,按照國(guó)家衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心的判斷標(biāo)準(zhǔn),要求結(jié)果落在靶值±0.4 Log值為符合要求,10個(gè)標(biāo)本至少8個(gè)符合要求為驗(yàn)證通過(guò)。

1.3.4 分析測(cè)量范圍驗(yàn)證 參照WS/T 420-2013[5]文件。將HCV-RNA高濃度陽(yáng)性標(biāo)本用陰性血清進(jìn)行系列 10 倍梯度稀釋（1：10、1：100、1：1000…）至試劑說(shuō)明書聲明的分析測(cè)量范圍下限,將高濃度陽(yáng)性標(biāo)本和所有稀釋度標(biāo)本在同一批檢測(cè),每個(gè)濃度標(biāo)本重復(fù)測(cè)量3次，計(jì)算測(cè)定Log值和預(yù)測(cè)Log值進(jìn)行線性回歸分析,要求b在1±0.05范圍內(nèi)，a接近于0，R2≧0.95，且測(cè)定Log值和理論Log值的差值≦±0.4 Log值，則驗(yàn)證通過(guò)。

1.3.5 定量限和檢出限 參照WS/T 514-2017[6]文件。使用陰性血清將康徹斯坦標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：2.2*103 IU/ml（對(duì)數(shù)值為3.34）稀釋至2次方的濃度值，然后再進(jìn)行5個(gè)梯度的倍比稀釋,對(duì)稀釋后的標(biāo)本每天分析一個(gè)批次，每個(gè)稀釋度重復(fù)檢測(cè)7次，連續(xù)測(cè)定3天，每個(gè)水平累計(jì)得到21個(gè)數(shù)據(jù)，并得出檢出和未檢出兩種情況，如檢出，則根據(jù)濃度值的對(duì)數(shù)值求出均值、SD和CV,選擇CV小于允許精密度要求的稀釋度時(shí)的最低濃度作為定量限。當(dāng)檢出結(jié)果比例大于或等于95%時(shí)的稀釋度濃度，則為檢出限?；驒z測(cè)生產(chǎn)企業(yè)聲稱濃度值的樣本25次，至少22次檢出，則為檢出限[7]。

1.3.6 特異性驗(yàn)證 使用試劑盒對(duì)實(shí)驗(yàn)室已確證的HCV-RNA陰性但甲型肝炎病毒（HAV）、乙肝肝炎病毒(HBV)、梅毒螺旋體（CT）、巨細(xì)胞病毒（CMV）、EB病毒（EB）、單純皰疹病毒（HSV）陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行HCV-RNA檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為陰性則符合要求。

1.3.7 抗干擾能力驗(yàn)證 使用接近或高于廠家聲明濃度的膽紅素、血紅蛋白、甘油三酯和總IgG的HCV-RNA陰性樣本，10倍稀釋外觀正常的高濃度HCV-RNA標(biāo)本，重復(fù)檢測(cè)稀釋后的標(biāo)本5次，HCV-RNA測(cè)定均值與預(yù)期值的偏倚應(yīng)在±0.4 Log值范圍內(nèi)。原始高濃度HCV-RNA標(biāo)本用正常陰性血清稀釋復(fù)測(cè)3次的Log均值作為預(yù)期值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Excel 2007軟件對(duì)批內(nèi)精密度、總精密度、抗干擾試驗(yàn)、正確度、分析測(cè)量范圍、檢出限、定量限及特異性結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 精密度驗(yàn)證結(jié)果 低濃度和高濃度標(biāo)本的批內(nèi)精密度和總精密度均≤5%，符合廠家聲明。見表1。

2.2 標(biāo)本攜帶污染驗(yàn)證結(jié)果 將高濃度陽(yáng)性標(biāo)本和陰性標(biāo)本共88個(gè)進(jìn)行穿插排列,同時(shí)提取和PC R擴(kuò)增，陰性結(jié)果全為陰性，均無(wú)交叉污染。見表2。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

表2 標(biāo)本攜帶污染驗(yàn)證結(jié)果

2.3 正確度驗(yàn)證結(jié)果 采用衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)評(píng)標(biāo)本（編號(hào)： 201721～201725、201811～201 815）評(píng)估正確度，全部通過(guò)，正確度符合要求。見表3。

表3 正確度驗(yàn)證結(jié)果

表4 分析測(cè)量范圍驗(yàn)證結(jié)果

2.4 分析測(cè)量范圍驗(yàn)證結(jié)果 實(shí)驗(yàn)室收集到的最高濃度標(biāo)本為1.98×107IU/ml，對(duì)其進(jìn)行系列10倍梯度稀釋至19.8IU/ml，驗(yàn)證的分析測(cè)量范圍為（19.8～1.98×107）IU/ml， 廠家聲明的分析測(cè)量范圍為（50～1×108）IU/ml，驗(yàn)證通過(guò)。 見表 4、圖 1。

2.5 定量限和檢出限驗(yàn)證 廠家聲明的定量限為50 IU/ml，Log值為1.70，按照衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)評(píng)的判斷標(biāo)準(zhǔn)，TEa在±0.4的范圍內(nèi)可接受，則在該濃度的TEa為23.5%,參照CNAS-CL 02-A009附錄A,在定量限濃度處的精密度允許范圍為4/5 TEa（18.8%）。標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過(guò)稀釋后接近定量限時(shí)的濃度為55 IU/ml，Log值為1.74,正確度在允許范圍（1.34～2.14）內(nèi)。驗(yàn)證的定量限實(shí)測(cè)濃度的Log均值為1.51，CV為16.06%，精密度也在允許范圍內(nèi)，定量限驗(yàn)證通過(guò)。廠家聲明的檢出限為25 IU/ml,在濃度值為22.5 IU/ml時(shí)，21次檢測(cè)中檢出20次，檢出結(jié)果大于95%，檢出限驗(yàn)證也通過(guò)。見表5。

圖1 分析測(cè)量范圍驗(yàn)證回歸曲線

表5 定量限和檢出限驗(yàn)證結(jié)果

2.6 特異性驗(yàn)證結(jié)果 HCV-RNA檢測(cè)試劑盒與甲型肝炎病毒（HAV）、乙肝肝炎病毒（HBV）、梅毒螺旋體（CT）、巨細(xì)胞病毒（CMV）、EB 病毒（EB）、單純皰疹病毒（HSV）病原體感染的標(biāo)本無(wú)交叉反應(yīng)，特異性符合要求。見表6。

表6 特異性驗(yàn)證結(jié)果

2.7 抗干擾能力驗(yàn)證結(jié)果 高膽紅素（550mmol/L）、高血紅蛋白（23g/L）、高甘油三酯（40mmol/L）和總IgG（45g/L）對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響在允許的偏倚范圍內(nèi)，符合廠家聲明。見表7。

3 討論

丙型肝炎呈全球性流行,據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)（2014）,全球HCV的感染率約為2.8%,估計(jì)約1.85億人感染HCV，其中約1.5億為慢性感染，每年因HCV感染導(dǎo)致的死亡病例約35萬(wàn)例。但由于HCV感染具有隱匿性,多數(shù)感染者并不知道感染HCV。暴露于HCV后1～3周，在外周血可檢測(cè)到HCV RNA。HCV RNA定量檢測(cè)主要用來(lái)檢測(cè)HCV在血液中的含量，適用于HCV現(xiàn)癥感染的確認(rèn)、抗病毒治療前基線病毒載量分析、以及抗病毒治療過(guò)程中及治療后的應(yīng)答評(píng)估[8]。無(wú)論急性還是慢性丙型肝炎病毒感染，確診均有賴于HCV RNA的檢測(cè),并由于丙肝患者在應(yīng)用聚乙二醇干擾素聯(lián)合RBV治療方案時(shí)，高靈敏的HCV-RNA檢測(cè)試劑有助于更準(zhǔn)確鑒定RVR,從而為確定抗病毒治療療程提供更可靠的依據(jù)[8，9]。由此可見，HCV RNA定量檢測(cè)對(duì)于臨床丙型肝炎的診治具有重要的意義。

表7 抗干擾能力驗(yàn)證結(jié)果

本文的HCV RNA定量檢測(cè)系統(tǒng)，使用的是湖南圣湘的檢測(cè)試劑,廠家的說(shuō)明書中明確說(shuō)明了使用ABI7500熒光定量PCR分析儀進(jìn)行擴(kuò)增的程序，并提供了該檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)應(yīng)的產(chǎn)品性能指標(biāo)。對(duì)于此類廠家能夠提供完整產(chǎn)品性能指標(biāo)的檢測(cè)系統(tǒng)，可以當(dāng)做封閉系統(tǒng)來(lái)對(duì)待，只需要對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)做基本的性能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)即可,無(wú)需進(jìn)行更加繁瑣的性能確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。CNAS文件明確指出分子診斷領(lǐng)域定量檢測(cè)方法和程序的分析性能驗(yàn)證內(nèi)容，中國(guó)人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等對(duì)各性能指標(biāo)的驗(yàn)證方法提供了具體的實(shí)驗(yàn)方案,本文旨在對(duì)本實(shí)驗(yàn)室的HCV RNA定量檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行性能驗(yàn)證，為PCR定量方法學(xué)的性能驗(yàn)證提供方案。具體驗(yàn)證內(nèi)容包括精密度、標(biāo)本攜帶污染、正確度、分析測(cè)量范圍、檢出限和定量限、特異性以及抗干擾能力。由于PCR定量項(xiàng)目的數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布,在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí),均將初始濃度轉(zhuǎn)化成對(duì)數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。畢波和呂元的文章[10]指出，不同檢測(cè)項(xiàng)目應(yīng)選擇不同的方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),對(duì)于低值特別有意義的檢測(cè)項(xiàng)目，必須進(jìn)行功能靈敏度的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，也就是本文中所進(jìn)行的檢出限和定量限驗(yàn)證，由于HCV RNA屬于病原體微生物，在正常人體內(nèi)不含有，所以微量的病毒檢出具有重要的臨床意義。畢波和呂元的文章中還指出,檢測(cè)系統(tǒng)良好的精密度和無(wú)標(biāo)本攜帶污染是進(jìn)行其他驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的前提，然后再進(jìn)行正確度驗(yàn)證，最后可依次進(jìn)行最大稀釋度驗(yàn)證、功能靈敏度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)和分析測(cè)量范圍驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，本文的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)順序跟其基本一致。精密度驗(yàn)證方案本研究參考的是WS/T 492-2016[4]。通過(guò)對(duì)接近廠家聲明的線性范圍上限的高濃度標(biāo)本（1.98×107IU/ml）進(jìn)行 10倍梯度稀釋，獲得一系列的等比稀釋后的標(biāo)本,使用6次方的高值標(biāo)本和3次方的低值標(biāo)本進(jìn)行精密度驗(yàn)證,其他系列濃度的樣本和精密度驗(yàn)證后多余的樣本于-70℃冰箱保存，用于分析測(cè)量范圍驗(yàn)證。所有樣本避免反復(fù)凍融，保證樣本的穩(wěn)定性。

標(biāo)本攜帶污染驗(yàn)證使用的臨床收集到的不同濃度的高值標(biāo)本和陰性血清，高濃度樣本和陰性樣本各44份，交叉排列，外加1個(gè)陰性對(duì)照、1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照、高低濃度2個(gè)質(zhì)控品和4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，共96孔，布滿整版，保證每孔均被驗(yàn)證。

WS/T 492-2016 和 WS/T 420-2013[4，5]均指出，可以使用患者樣本與其他檢驗(yàn)方法比較進(jìn)行正確度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),也可以使用參考物質(zhì)進(jìn)行正確度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。若使用參考物質(zhì)進(jìn)行正確度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，可以選擇大型能力比對(duì)或室間質(zhì)評(píng)的樣本。本文選擇的是使用衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心2017年和2018年下發(fā)的2次共10個(gè)樣本進(jìn)行驗(yàn)證，正確度符合要求。

廠家聲明的分析測(cè)量范圍為50～108IU/ml。依據(jù)WS/T 420-2013[5]中線性驗(yàn)證相關(guān)內(nèi)容,結(jié)合WS/T 408-2012[11]和相關(guān)文獻(xiàn)[12-14]，本方案中選用的上限標(biāo)本濃度為1.98×107IU/ml,下限標(biāo)本選用陰性血清，驗(yàn)證得到的分析測(cè)量范圍為（19.8～1.98×107）IU/ml，符合廠家聲明。

定量限指滿足聲明的精密度和正確度,在聲明的實(shí)驗(yàn)條件下能夠可靠定量的分析物的最低濃度。WS/T 514-2017指出，最簡(jiǎn)單的檢測(cè)限試驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)包括一個(gè)試劑批號(hào)；一個(gè)儀器系統(tǒng)；3天實(shí)驗(yàn)；2個(gè)LoD和LoQ聲明濃度附近的標(biāo)本;總計(jì)至少2 0個(gè)重復(fù)檢測(cè)結(jié)果[6]。本文正是以此制定實(shí)驗(yàn)方案,通過(guò)正確度和精密度的結(jié)果綜合判斷定量限。定量限的精密度要求是根據(jù)廠家說(shuō)明的定量限濃度、CNAS-CL02-A009文件附錄A和衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)評(píng)的判斷標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算得出,為18.8%,與應(yīng)葳,李萬(wàn)春,宋濤，等人的文章[12]中說(shuō)明的20%接近。通過(guò)驗(yàn)證表明，本實(shí)驗(yàn)室HCV RNA檢測(cè)系統(tǒng)的定量限為55 IU/ml，接近廠家聲明。檢出限為22.5 IU/ml，小于廠家聲明。說(shuō)明驗(yàn)證的定量限和檢出限均符合廠家聲明。

依據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的 《丙型肝炎病毒核酸測(cè)定試劑技術(shù)審查指導(dǎo)原則》[15]，推薦用于特異性研究的微生物包括HCMV、EBV、HSV2等13種,推薦用于干擾研究的物質(zhì)包括膽紅素、血紅蛋白和甘油三酯等7種，其中膽紅素、血紅蛋白和甘油三酯為必須驗(yàn)證的干擾物質(zhì)。由于各類陽(yáng)性病原微生物難以獲得,本實(shí)驗(yàn)選擇甲型肝炎病毒（HAV）、乙肝肝炎病毒（HBV）、梅毒螺旋體（CT）、巨細(xì)胞病毒（CMV）、EB 病毒（EB）、單純皰疹病毒（HSV）6種病毒進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證，使用總膽紅素（550 mmol/L）、血紅蛋白（23 g/L）、甘油三酯（40 mmol/L）和總 IgG（45 g/L）4 種臨床常見的干擾物質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證，均符合要求。

通過(guò)以上驗(yàn)證結(jié)果表明,在高低值分別為6次方和3次方濃度時(shí)的批內(nèi)精密度和總精密度均符合要求；無(wú)標(biāo)本攜帶污染；正確度符合衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)量評(píng)價(jià)要求；在50～108IU/ml分析測(cè)量范圍內(nèi)線性良好;檢出限和定量限符合廠家聲明；特異性驗(yàn)證通過(guò)；高濃度的血紅蛋白、膽紅素、總IgG和甘油三酯均對(duì)試驗(yàn)無(wú)明顯干擾。綜上所述，本文建立的HCV RNA定量檢測(cè)系統(tǒng)的性能驗(yàn)證方案合理,驗(yàn)證的各項(xiàng)性能指標(biāo)均符合廠家聲明，適用于臨床檢測(cè)。