褐藻寡糖用于海水小球藻和鹽生杜氏藻異養(yǎng)培養(yǎng)及其促生長作用機(jī)制?

馬冬冬， 李永富

(1. 中國海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，山東 青島 261000；2.中國科學(xué)院海洋研究所實(shí)驗海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室,山東 青島 266071)

海水小球藻(Chlorellasp.)是河蟹幼體、輪蟲和鹵蟲的理想餌料，在海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中發(fā)揮重要作用。鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina)繁殖迅速，對高溫、高鹽、強(qiáng)光等脅迫條件具有很強(qiáng)耐受能力，主要用作海參育苗餌料和生產(chǎn)β-胡蘿卜素的原料[17]。本研究選取上述兩種微藻為研究對象，考察酶解褐藻(海帶)寡糖的生長促進(jìn)作用，旨在為提高微藻生長速率，改進(jìn)培養(yǎng)方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻種

Chlorellasp.和D.salina均取自中國海洋大學(xué)藻種庫。用f/2培養(yǎng)基[18]對兩種微藻進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，其他條件為溫度25 ℃、光照強(qiáng)度60 μmol·m-2·s-1，將微藻預(yù)培養(yǎng)至指數(shù)生長期備用。

1.2 海水

實(shí)驗用天然清潔海水(pH=7.90±0.02、鹽度32)取自青島市石老人海域，經(jīng)0.45 μm醋酸纖維濾膜過濾，并在121 °C條件下滅菌，冷卻后備用。

1.3 海洋寡糖

褐藻寡糖(Alginate-derived oligosaccharide，ADO)由中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院應(yīng)用微生物實(shí)驗室提供，是褐藻膠經(jīng)Vibriosp. 510-64菌株產(chǎn)生專一性褐藻膠裂合酶酶解制備的寡糖片段。前期研究表明，ADO以二糖和三糖為主，分子量范圍低于1 000[19]。

1.4 ADO對微藻生長影響實(shí)驗設(shè)計

探究光照和黑暗兩種培養(yǎng)方式下褐藻寡糖對兩種微藻生長的影響。將預(yù)培養(yǎng)至指數(shù)生長期的微藻接種于含150 mL新鮮培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，使每種微藻的初始接種密度為5×105cells·mL-1。按5%固液比用量添加ADO，即每瓶藻液中加入7.5 mg(50 mg·L-1)，以不加ADO的微藻為對照組(Control)，不接入微藻但添加ADO的處理為空白組(Blank)，Control和光照處理組(Sample-light)在培養(yǎng)箱中光強(qiáng)60 μmol·m-2·s-1下培養(yǎng)；黑暗處理組(Sample-dark)用黑色硬紙板營造無光條件，其他條件同Sample-light組。各組均設(shè)3個平行，分別培養(yǎng)8 d，每隔2 d測定藻液750 nm處吸光度(A750)，培養(yǎng)第4天測定藻液色素含量。

1.5 光合色素含量及比生長速率測定

取5 mL待測藻液，于2 500×g下離心15 min。除去上清液后加入5 mL 90%丙酮，搖勻后于完全黑暗條件下提取24 h。將提取液于2 500×g下離心15 min，上清液即為色素提取液。分別于470、647和664 nm處測定吸光度。葉綠素a(Chla)和葉綠素b(Chlb)按式(1)～(2)計算[20]，類胡蘿卜素(Car)按式(3)計算[21]：

Chla=11.93 OD664-1.93 OD647；

(1)

Chlb=20.36 OD647- 5.50 OD664；

(2)

(3)

微藻指數(shù)生長期比生長速率(μ)按下式計算：

(4)

式中N1、N2分別為t1和t2時刻微藻光密度。

1.6 呼吸耗氧速率和光合放氧速率測定

參考文獻(xiàn)[22]的方法，室溫下用Chlorolab-2型液相氧電極 (英國Hansatech公司)測定：使用零點(diǎn)校正法，進(jìn)行電極校正，即向液相體系中加入連二亞硫酸鈉設(shè)定氧電極零點(diǎn)基線，將反應(yīng)室清洗干凈。向其中加入1.5 mL藻液，開啟攪拌器并保持轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速80 r/min，開始測定，首先營造無光環(huán)境持續(xù)20 min，以溶解氧濃度下降速率表示暗呼吸耗氧速率(Rd)；之后開啟光源，在60 μmol·m-2·s-1光強(qiáng)下測定氧信號至穩(wěn)定增長或降低，截取此時的變化速率即為凈光合作用放氧速率(PNet)，總光合作用速率PGross=Rd+| PNet|。

1.7 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定方法

采用 FMS-2 便攜式調(diào)制式熒光儀(Hansatech, 英國) 參考文獻(xiàn)[24]的方法測定：將1.5 mL待測藻液放入熒光測定樣品瓶，暗處理15 min 后，測定Fo, 用飽和脈沖光(8 000 μmol·m-2·s-1)照射 0.7 s 測得Fm。300 μmol·m-2·s-1作用光下照射藻液 120 s，及時記錄熒光Ft，F(xiàn)t穩(wěn)定時的熒光為F′s，然后打開飽和脈沖光(8 000 μmol·m-2·s-1) 照射 0.7 s，測定F′m，關(guān)閉作用光，同時打開遠(yuǎn)紅光照射 3 s，測得F′o。 以不加寡糖的微藻為對照，以過濾滅菌海水為空白。PSII 最大光化學(xué)效率Fv/Fm和光化學(xué)淬滅系數(shù)qP按下式計算：

(5)

(6)

1.8 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和顯著性差異檢驗(p<0.05)。

2 研究結(jié)果

2.1 ADO對兩種微藻生長和色素含量的影響

ADO對兩種微藻生長的影響見圖1。培養(yǎng)階段Blank組吸光度均不變，說明純ADO加入對培養(yǎng)體系本底吸光度值無影響，各實(shí)驗組A750變化由微藻細(xì)胞吸收引起。光照條件下，ADO的加入顯著促進(jìn)了兩種微藻的生長。對于Chlorellasp.，培養(yǎng)第4天時微藻光密度達(dá)到最大值，為對照組的2.2倍，之后迅速進(jìn)入平臺期。Sample-light組Chlorellasp.指數(shù)生長期比生長速率可達(dá)0.192 d-1，遠(yuǎn)高于Control組的0.081 d-1和Sample-dark組的0.074 d-1。可見ADO明顯提高了Chlorellasp.的生長速率并縮短了培養(yǎng)周期。對于D.salina，Sample-light組指數(shù)生長期的比生長速率為0.259 d-1，高于Control組的0.139 d-1和Sample-dark組的0.204 d-1。值得注意的是，兩種微藻的Sample-dark組均出現(xiàn)A750增長，比生長速率分別為0.074和0.204 d-1，說明無光條件下Chlorellasp.和D.salina均能依賴ADO維持細(xì)胞增殖。

圖1 ADO加入后不同培養(yǎng)方式下海水小球藻(A)和鹽生杜氏藻(B)的生長曲線(n=3)Fig. 1 Growth curves of Chlorella sp. (A), D. salina (B) under different cultural modes with 50 mg·L-1 ADO added in suspension (n=3)

不同培養(yǎng)方式下的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量變化見圖2。對于Chlorellasp.，雖然生長影響試驗表明光照下ADO的加入促進(jìn)了微藻生長，但與對照組相比，Chla和Car的含量均有顯著降低(p<0.05)，Chlb則未有明顯變化。與Chlorellasp.相反，光照下ADO的加入明顯促進(jìn)了D.salina中Chla、Chlb和Car的含量。

圖2 添加ADO對海水小球藻和鹽生杜氏藻色素含量的影響(n=3)Fig. 2 Effect of ADO on the Chl a, Chl b, and Car concentrations of Chlorella sp. and D. salina, respectively (n=3)

2.2 ADO對微藻呼吸耗氧速率和光合放氧速率的影響

對于Chlorellasp.，光照和黑暗條件下寡糖的添加均促進(jìn)了呼吸作用，表現(xiàn)為Sample-light組和Sample-dark組的Rd均高于Control組。而光下PGross與Control組無顯著性差異甚至略有降低(見圖3(A))。D.salina中Rd的變化規(guī)律與Chlorellasp.類似，無論在光照或黑暗下，寡糖均能促進(jìn)使Rd提高；但是，Samplelight組PGross明顯高于Control組(見圖3(B))。

圖3 添加ADO對海水小球藻(A)和鹽生杜氏藻(B)光合速率與呼吸速率的影響(n=3)Fig. 3 Effect of ADO on the Photosynthetic rate and respiratory rate of Chlorella sp. (A) and D. salina (B), respectively (n=3)

2.3 寡糖作用下微藻的葉綠素?zé)晒夥治?/h3>

葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)能夠快速靈敏的反映微藻細(xì)胞內(nèi)部生理狀態(tài)，可反映環(huán)境因子對光合作用過程的影響[27]。各參數(shù)中，F(xiàn)v/Fm是經(jīng)過充分暗適應(yīng)的生物樣品PSII最大光能轉(zhuǎn)化效率指標(biāo)，qP表示總PSII反應(yīng)中心中開放的反應(yīng)中心所占的比例。ADO對兩種微藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響見表1。單因子方差分析結(jié)果表明，ADO添加顯著提高了D.salina的Fv/Fm和qP，而未對Chlorellasp.的熒光參數(shù)造成顯著影響(P<0.05)。

表1 褐藻寡糖對兩種微藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響(n=4)Table 1 Effect of alginate oligosaccharide to photosynthetic parameters of two microalgae (n=4)

3 討論

當(dāng)前，異養(yǎng)化技術(shù)成為微藻培養(yǎng)研究的熱點(diǎn)，且已進(jìn)入了一個從單純的實(shí)驗室培養(yǎng)研究到大批量產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用的階段。但是，海水藻株可異養(yǎng)培養(yǎng)的不多見，僅有寇氏隱甲藻(Crypthecodiniumcohnii)、小環(huán)藻(Cyclotellasp.)、平滑菱形藻(Nitzschialaevis)、綠球藻(Chlorococcumsp.)、亞心形扁藻(Platymonassubcordiformis)、四爿藻(Tetraselmissuecica)以及球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)等少數(shù)幾株的報道[23-27]。一般認(rèn)為，微藻不能異養(yǎng)的可能原因：一是通透性障礙，即有機(jī)物難以透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞或者缺乏濃縮有機(jī)物的能力而不能被異養(yǎng)；二是缺乏與有機(jī)物分解代謝相關(guān)的酶；三是限制性的呼吸能力。在異養(yǎng)條件下，某些微藻雖然能利用有機(jī)物，但能力非常微弱，使得呼吸作用所提供的能量不足以維持其生長[28]。孫俊楠等[29]發(fā)現(xiàn)，添加葡萄糖可促進(jìn)D.salina生長。本研究中發(fā)現(xiàn)了ADO可作為有機(jī)碳源供兩株微藻利用，說明該物質(zhì)有助于突破海水藻難以異養(yǎng)培養(yǎng)的生物學(xué)屏障，可為Chlorellasp.和D.salina提供新的有機(jī)碳源。在Yokose等的研究中，20 g·L-1的寡糖加入量可將擬眼點(diǎn)微綠球藻的生長速率提高5倍[15]，但用量遠(yuǎn)大于本研究的50 mg·L-1；Yamasaki等對萊茵衣藻生長促進(jìn)作用研究中的褐藻寡糖用量也高達(dá)1 000 mg·L-1 [16]。本研究表明，相對極低量的褐藻寡糖即可明顯促進(jìn)Chlorellasp.和D.salina生長。從生長促進(jìn)和用量兩方面考慮，褐藻寡糖用于Chlorellasp.和D.salina異養(yǎng)培養(yǎng)更有應(yīng)用潛力。

添加褐藻寡糖對兩種微藻呼吸作用均有提升作用。黑暗中，兩株藻均維持較高的呼吸速率，這一現(xiàn)象說明褐藻寡糖作為呼吸作用底物參與了Chlorellasp.和D.salina的代謝過程。與呼吸耗氧速率不同，光照條件下寡糖的加入未能促進(jìn)Chlorellasp.的光合放氧速率。呼吸耗氧速率和光合放氧速率的測定結(jié)果表明，ADO不能促進(jìn)Chlorellasp.的光合作用，其促進(jìn)Chlorellasp.的生長主要通過提高異養(yǎng)作用實(shí)現(xiàn)。與Chlorellasp.不同，光照條件下D.salina寡糖添加的試驗組光合放氧速率明顯提高，表明褐藻寡糖促進(jìn)了D.salina的光合作用，這與色素和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定結(jié)果一致，原因可能是ADO通過促進(jìn)呼吸作用提高了色素合成所需的能量[30]或可溶性糖參與色素合成相關(guān)酶編碼基因表達(dá)的分子調(diào)控[31]。前人研究發(fā)現(xiàn)，高等植物果實(shí)果皮中可溶性糖的代謝、轉(zhuǎn)化酶活性變化和果皮的轉(zhuǎn)紅發(fā)生在同一時期，可見可溶性糖與花青素的合成有著密切的聯(lián)系[32]。但ADO對微藻色素的影響是通過糖酵解途徑還是調(diào)控基因表達(dá)尚不清楚，需要更多研究。

4 結(jié)論

(1)褐藻寡糖可作為有機(jī)碳源顯著提高Chlorellasp.和D.salina在光下的生長速率。黑暗條件下，兩種微藻均可依賴褐藻寡糖實(shí)現(xiàn)完全異養(yǎng)培養(yǎng)。光照條件下，添加褐藻寡糖的D.salina葉綠素含量、光合放氧速率以及光化學(xué)效率均有顯著提高，但Chlorellasp.光合放氧速率未發(fā)生顯著變化，且色素含量降低。

(2)褐藻寡糖對兩種微藻的生長促進(jìn)作用機(jī)制不同，促進(jìn)Chlorellasp.的生長主要通過異養(yǎng)同化作用；對于D.salina，除異養(yǎng)同化作用外，褐藻寡糖還可以通過促進(jìn)光合作用促進(jìn)其生長。