姜珊珊， 苗晶晶， 劉力銣， 潘魯青

(中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院水產(chǎn)動物環(huán)境生理學(xué)研究室，山東 青島 266003)

促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone,GnRH)是一種神經(jīng)肽類激素，是性激素合成與性腺發(fā)育的關(guān)鍵內(nèi)分泌調(diào)控因子[1]。在魚類和其它脊椎動物中，GnRH通過刺激垂體促性腺激素(Gonadotropin, GtH)的產(chǎn)生從而調(diào)節(jié)性腺類固醇激素的合成與釋放，促進(jìn)性腺發(fā)育成熟[2]，然而目前對貝類GnRH的調(diào)控機(jī)制了解甚少。近年來，在幾種貝類體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)了GnRH多肽的存在，GnRH基因在蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)和長牡蠣(Crassostreagigas)的神經(jīng)組織中高度表達(dá)，且與脊椎動物GnRH基因相比具有較高的同源性和結(jié)構(gòu)相似性[3-5]。此外，Rodet等在長牡蠣體內(nèi)克隆到了GnRH受體基因，并發(fā)現(xiàn)該基因主要在雌雄性腺中表達(dá)[6]。Treen等研究發(fā)現(xiàn)GnRH多肽可刺激體外培養(yǎng)的蝦夷扇貝精原細(xì)胞分裂[7]。目前在軟體動物中尚未發(fā)現(xiàn)GtH同源基因的存在，Kah等[8]推測GnRH的作用方式可能隨動物神經(jīng)系統(tǒng)的進(jìn)化而演變，在神經(jīng)系統(tǒng)較為簡單的無脊椎動物中，GnRH可能通過直接作用于性腺發(fā)揮其生殖調(diào)控作用，目前這一觀點仍有待于進(jìn)一步證實。

脊椎動物通過“GnRH-GTHs-性激素合成通路”調(diào)控性腺發(fā)育，性激素由孕烯醇酮通過Δ4和Δ5兩種主要途徑合成，這兩條途徑都涉及細(xì)胞色素P450c17(CYP17)以及3β-羥類固醇脫氫酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD)和17β-羥基類固醇脫氫酶(17β-hydroxysteroid dehydrogenase, 17β-HSD)[9]。在雙殼動物體內(nèi)，性激素(雌二醇、睪酮和孕酮等)已經(jīng)被廣泛的鑒定和量化，許多研究通過對雙殼貝類性腺組織中類固醇激素代謝、生化變化的研究，提出雙殼貝類體內(nèi)性激素的主要合成途徑與脊椎動物類似，且類固醇合成酶對性激素的生物合成至關(guān)重要，其中，CYP17、3β-HSD和17β-HSD是關(guān)鍵的性激素合成酶[10-13]。脊椎動物中CYP17、3β-HSD和17β-HSD在轉(zhuǎn)錄水平由GnRH、GtH通過其受體激活。然而在軟體動物中這3種酶基因表達(dá)調(diào)控的相關(guān)研究尚未見報道。本文在前期克隆了菲律賓蛤仔(Ruditapesphili-ppinarum)rp-GnRH全長cDNA序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計并篩選了特異性干擾GnRHmRNA表達(dá)的dsRNA，旨在通過RNAi技術(shù)，研究菲律賓蛤仔rp-GnRH基因沉默對性腺中性激素合成相關(guān)基因表達(dá)的影響，進(jìn)而探討GnRH在菲律賓蛤仔生殖內(nèi)分泌調(diào)控中的作用。

1 材料與方法

1.1 dsRNA制備

采用體外合成法制備GnRH及綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein)的dsRNA用于干擾實驗。根據(jù)菲律賓蛤仔GnRH基因序列信息(GenBank KF891317)和RNAi引物設(shè)計原則設(shè)計了兩組不同的引物，并分別在每組引物的正義鏈和反義鏈的5’末端添加T7序列(見表1)，以蛤仔臟神經(jīng)節(jié)cDNA為模板，PCR擴(kuò)增特異序列。根據(jù)綠色熒光蛋白(EGFP-C1，Clontech)序列信息設(shè)計RNAi引物，用以從EGFP-C1中擴(kuò)增特異序列。

用TIANgel Midi Purification Kit(TIANGEN)純化PCR產(chǎn)物，按照T7 RiboMAXTM Express RNAi System(Promega)試劑盒說明書的方法，體外合成用于干擾GnRH表達(dá)的dsRNA及EGFP-dsRNA(陰性對照)，并用不含RNase的DNaseⅠ(Takara)消化模板DNA。將獲得的 dsRNA 以1%瓊脂糖凝膠電泳分析其大小和純度，用核酸蛋白儀(Ultrospec 2100)測定合成的dsRNA 濃度和OD值，OD260/OD280為1.84～2.16。

表1 RNAi dsRNA合成引物

1.2 GnRH-dsRNA篩選及不同時間作用下的干擾效率

菲律賓蛤仔于2017年11月采自青島市紅島養(yǎng)殖場，殼長(3.4±0.3) cm，性腺發(fā)育處于休止期。實驗前于實驗室暫養(yǎng)一周，定期換水和投喂螺旋藻粉。將菲律賓蛤仔隨機(jī)分為4組：空白對照組(PBS組)、陰性對照組(EGFP-dsRNA組)和2個GnRH干擾組(GnRH-ds1組、GnRH-ds2組)，每組3個平行，每個平行注射3個個體。將體外轉(zhuǎn)錄合成的dsRNA 溶解于滅菌的 PBS 緩沖液中，用注射器從菲律賓蛤仔雙殼鉸合部注入血腔中，其中空白對照組每個個體注射50 μL滅菌的PBS，陰性對照組和2個GnRH干擾組每個個體分別注射50 μL(10 μg/50 μL)的EGFP-dsRNA、GnRH-ds1和GnRH-ds2。參考王曉安等[14]，菲律賓蛤仔臟神經(jīng)節(jié)位于后閉殼肌膜上，在注射后的0、24、48和72 h用鑷子取臟神經(jīng)節(jié)提取總RNA，用RT-qPCR法測定GnRH的表達(dá)水平，計算干擾率。

1.3 不同濃度GnRH-dsRNA的干擾率

挑選36只健康的蛤仔，隨機(jī)分為4組，根據(jù)GnRH基因干擾鏈篩選結(jié)果，參考合浦珠母貝(Pinctadafucata)[15]目的基因dsRNA的濃度設(shè)定，設(shè)定空白對照組(注射50 μL滅菌的PBS)、陰性對照組(注射50 μL 20 μg/50 μLEGFP-dsRNA)、GnRH-ds1低濃度組(注射50 μL20 μg/50 μL GnRH-ds1)和GnRH-ds1高濃度組(注射 50 μL 30 μg/50 μLGnRH-ds1)，于48 h后用鑷子取臟神經(jīng)節(jié)提取總RNA，用RT-qPCR法測定GnRH的表達(dá)水平，計算干擾率。

1.4 GnRH干擾對性腺發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)研究

將菲律賓蛤仔隨機(jī)分為3組，包括空白對照組(PBS)、陰性對照組(EGFP-dsRNA)和GnRH-ds1組?？瞻讓φ战M每個個體注射50 μL滅菌的PBS緩沖液，陰性對照組每個個體注射50 μLEGFP-dsRNA，RNAi組每個個體分別注射50μL篩選出的30 μg/50 μLGnRH-ds1。于48 h后取性腺組織提取總RNA，用RT-qPCR法測定性激素合成相關(guān)基因的表達(dá)。

1.5 基因表達(dá)的RT-qPCR分析

根據(jù)RNAiso Plus(TaKaRa，大連)說明書分別提取臟神經(jīng)節(jié)、性腺總RNA。每一樣品取1 μg總RNA，按照 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，大連)試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模版，進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)用于檢測rp-GnRH及性激素合成相關(guān)基因表達(dá)量, 所用引物見表2。以18s rRNA為內(nèi)參基因，熒光定量數(shù)據(jù)分析采用 2-ΔΔCt 法。用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，采用Tukey’s多重比較檢驗差異顯著性，以p<0.05作為差異顯著標(biāo)準(zhǔn)。

表2 熒光定量引物

2 實驗結(jié)果

2.1 兩種 GnRH-dsRNA干擾的效果檢測

注射后的 0、24、48和72 h，提取臟神經(jīng)節(jié)檢測GnRH的相對表達(dá)量。結(jié)果表明， PBS組與陰性對照組(EGFP-dsRNA)相比，GnRH的表達(dá)量無顯著性差異(p>0.05)。在注射后48 h，兩個干擾組GnRH的表達(dá)量出現(xiàn)顯著下降(p<0.05)，其中GnRH-ds1注射組GnRH表達(dá)量干擾率為63.3%，GnRH-ds2注射組干擾效率為38.9%(見圖1)。

圖1 dsRNA注射對菲律賓蛤仔臟神經(jīng)節(jié)GnRH基因表達(dá)的影響

2.2 不同濃度GnRH-ds1的RNAi效果

根據(jù)2.1中GnRH的干擾效果，選擇GnRH-ds1進(jìn)行注射，設(shè)置濃度梯度為20 μg/50 μL和30 μg/50 μL，于48 h取樣檢測抑制效果。結(jié)果表明，注射后48 h，PBS組與陰性對照組相比，GnRH基因表達(dá)量無顯著性差異(p>0.05)。高濃度(30 μg/50 μL)GnRH-ds1注射組的干擾率為73.3%，低濃度(20 μg/50 μL)注射組的干擾率為54.3%(見圖2)。

圖2 不同濃度dsRNA注射對菲律賓蛤仔臟神經(jīng)節(jié)GnRH基因表達(dá)的影響

2.3 GnRH基因干擾后性激素合成基因表達(dá)量的變化

如圖3所示，注射dsRNA 48 h后，GnRH干擾組的菲律賓蛤仔性腺中17β-HSD和CYP17的基因表達(dá)較空白對照組、陰性對照組顯著性下降(p<0.05)，而3β-HSD基因表達(dá)量沒有出現(xiàn)顯著變化(p>0.05)。與PBS對照組相比，GnRH干擾組中17β-HSD及CYP17基因的表達(dá)量分別下降了86.3%、84.9%；與陰性對照組相比，17β-HSD及CYP17基因表達(dá)量分別下降了78.6%、81.3%。

圖3 不同處理組3β-HSD、17β-HSD和CYP17基因的相對表達(dá)量

3 討論

目前，RNAi作為一種簡單、高效、特異性沉默同源目標(biāo)基因的敲減工具, 為動物基因功能的研究提供了新的思路和方法。Fabioux等體外合成了牡蠣性腺基因Oyvlg的RNA干擾鏈(Oyvlg-dsRNA)，將其注射到牡蠣性腺中成功引起不育現(xiàn)象，首次證明雙殼貝類體內(nèi)注射dsRNA的有效性[16]。這項技術(shù)在日本合浦珠母貝、三角帆蚌、櫛孔扇貝等雙殼貝類中也均有應(yīng)用報道[15,17-18]。RNAi在生物體內(nèi)具有一定的時效性，多數(shù)研究表明RNAi持續(xù)的時間為2～4 d。對甲殼動物的研究發(fā)現(xiàn)在南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)和克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)中，注射目的基因dsRNA干擾鏈后48 h即可達(dá)到有效干擾效果[19-20]。Feng等探究櫛孔扇貝Cf-dmrt-likemRNA基因功能時dsRNA注射后72 hCf-dmrt-like表達(dá)量顯著性降低[18]。本研究結(jié)果顯示，GnRH-ds1干擾鏈注射后48 h顯著下降，在注射后72 h，GnRH基因的表達(dá)量開始回升(見圖1)。在RNAi實驗中，dsRNA處理后目的基因mRNA表達(dá)水平下降70%被認(rèn)為干擾有效[21]。已有研究表明在RNAi實驗中dsRNA的有效注射濃度有所區(qū)別：如李穎翔等設(shè)計的長牡蠣Toll樣受體(Toll-like receptor)的dsRNA的有效注射濃度為100 μg/100 μL[22]。Fang等以合浦珠母貝為研究對象，設(shè)計了3種不同濃度的dsRNA用以抑制5個與貝殼礦化有關(guān)的基因的表達(dá)，結(jié)果顯示高濃度組(160 μg/100 μL dsRNA)對目的基因的抑制率顯著高于低濃度組(40 μg/100 μL或80 μg/100 μL)[15]。本研究結(jié)果顯示向菲律賓蛤仔血腔中注射10 μg/50 μLGnRH-ds1和ds2即可抑制GnRH的表達(dá)(抑制率分別為63.3%和38.9%)，但尚未達(dá)到有效抑制率，而注射30 μg/50 μLGnRH-ds1 48 h后GnRH的抑制率達(dá)73.31%, 說明臟神經(jīng)節(jié)中GnRH的mRNA表達(dá)被有效抑制。由此可見，本實驗中對GnRH基因的干擾效果也主要受到dsRNA注射濃度的影響有關(guān)，30 μg/50 μL為GnRH-ds1注射48 h的有效濃度。

脊椎動物中促性腺激素釋放激素(GnRH)是性激素合成與性腺發(fā)育的關(guān)鍵神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控因子。對硬骨魚類的研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)注射GnRH短期內(nèi)可誘導(dǎo)垂體GTHs合成，同時注射GnRH和多巴胺拮抗劑可促進(jìn)多數(shù)種類的性腺發(fā)育成熟[23-24]。目前關(guān)于軟體動物GnRH功能的研究較少：Lisa等研究發(fā)現(xiàn)人工合成的真蛸(Octopusvulgaris)GnRH多肽可促進(jìn)離體培養(yǎng)的真蛸卵巢和精巢組織中孕酮、睪酮和雌二醇含量顯著升高[25-26]；Nakamura等采用人工合成的GnRH離體孵育蝦夷扇貝(P.yessoensis)的精巢，發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)精原細(xì)胞分裂[27]；Song等發(fā)現(xiàn)菲律賓蛤仔臟神經(jīng)節(jié)rpGnRH基因表達(dá)在性腺發(fā)育過程中具有明顯的變化規(guī)律，其相對表達(dá)量與血液中孕酮、睪酮的含量具有顯著正相關(guān)性[5]。這些研究結(jié)果均體現(xiàn)了GnRH在軟體動物的性腺發(fā)育與性激素合成中可能具有重要作用。脊椎動物中性激素合成關(guān)鍵酶CYP17、3β-HSD及17β-HSD等基因在轉(zhuǎn)錄水平受到GnRH和GtHs的調(diào)控[10]，但是貝類中GnRH對性激素合成酶基因表達(dá)的影響尚未見報道。在本實驗中，處于性腺發(fā)育休止期的菲律賓蛤仔的GnRH表達(dá)被抑制時，兩種關(guān)鍵的性激素合成酶CYP17與17β-HSD的基因表達(dá)均顯著下調(diào)，間接證實了雙殼貝類中GnRH對其性激素合成的調(diào)控作用。另一方面，有研究表明，菲律賓蛤仔在性腺發(fā)育時期血淋巴中性激素水平(孕酮、睪酮和雌二醇)的含量及變化均存在雌雄差異[5]，但是GnRH功能在軟體動物中的性別差異研究尚未見報道。本實驗中的受試菲律賓蛤仔處于性腺發(fā)育休止期，因此在本研究中未區(qū)分GnRH表達(dá)抑制對不同性別菲律賓蛤仔的影響，在今后的實驗中將測試GnRH表達(dá)抑制對不同發(fā)育階段、不同性別的菲律賓蛤仔性激素合成、主要性激素含量的影響，為查明GnRH在不同發(fā)育階段和不同性別菲律賓蛤仔中的功能提供依據(jù)。

目前研究發(fā)現(xiàn)貝類體內(nèi)的性激素合成途徑與脊椎動物類似，主要由CYP17、3β和17β-HSDs等性激素合成關(guān)鍵酶介導(dǎo)完成[11-13]。Thitiphuree等研究表明CYP17、3β-HSD和17β-HSD在蝦夷扇貝的外周和性腺組織中普遍表達(dá)，并且3β-HSD和17β-HSD基因的mRNA表達(dá)與性腺成熟度有關(guān)[28]。CYP17同時具有17α-羥化酶和17，20-裂解酶的兩種活性，參與脊椎動物中孕烯醇酮和孕酮的17-羥化、催化17-羥孕酮轉(zhuǎn)化為雄烯二酮和17-羥孕烯醇酮轉(zhuǎn)化為去氫表雄酮(DHEA)。Mu等研究許氏平鲉發(fā)現(xiàn)，性腺中CYP17a1的表達(dá)與血清中睪酮濃度密切相關(guān)[29]。研究表明在斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)和日本鰻鱺(Anguillajaponica)卵泡發(fā)育過程中,CYP17的含量變化極為顯著[30-31]。早在1973年，De等利用使用氚和氧化標(biāo)記的前體，在紫貽貝中發(fā)現(xiàn)了CYP17酶活性，隨后Carreau等利用同樣的方法在烏賊(SepiaofficinalisL.)性腺中也發(fā)現(xiàn)CYP17酶活性[32]。Thitiphuree等在蝦夷扇貝性腺中克隆到了一種CYP17的cDNA全長，與脊椎動物氨基酸序列相比具有較高的保守性，并且蝦夷扇貝CYP17mRNA的表達(dá)水平在配子早期分化階段較高，在性腺成熟中期、后期受到抑制，說明CYP17在貝類的性腺發(fā)育過程中具有重要的作用[28]。在脊椎動物中，17β-HSD主要功能是參與性激素的代謝，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)甾體類激素水平從而在生殖系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。它可以將脫氫表雄酮轉(zhuǎn)化為雄烯二酮， 并能將雌酮轉(zhuǎn)化為雌二醇。對貝類的研究表明，長牡蠣和蝦夷扇貝的雌性性腺中均可檢測到雌二醇和17β-HSD酶活性，且雌二醇的含量隨性腺成熟升高，而排卵后17β-HSD的酶活性與早期性腺分化階段相比明顯降低[33]。Liu等通過實驗證明櫛孔扇貝中的17β-HSD 能有效地將17β-雌二醇轉(zhuǎn)化為雌酮，并可催化睪酮向雄烯二酮的轉(zhuǎn)化。此外，櫛孔扇貝雌雄性腺17β-HSD的表達(dá)量隨配子發(fā)育而增加，在生長期和成熟期雄性性腺17β-HSD的表達(dá)量顯著高于雌性性腺[34]。Zhou等研究證實九孔鮑(Haliotisdiversicolorsupertexta)中17β-HSD可以催化雌酮轉(zhuǎn)化為雌二醇，并且在成熟期性腺內(nèi)17β-HSDmRNA表達(dá)量顯著升高，在產(chǎn)卵后顯著性下降[35]。這些研究表明17β-HSD在貝類性類固醇激素的合成中發(fā)揮重要作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)貝類性腺發(fā)育。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)GnRH表達(dá)被抑制時，CYP17、17β-HSDmRNA的表達(dá)均顯著下降，由此我們推測在性腺發(fā)育處于休止期的菲律賓蛤仔中，CYP17、17β-HSD基因表達(dá)可能在轉(zhuǎn)錄水平受到GnRH的調(diào)控。

3β-HSD作為動物體內(nèi)大多數(shù)性激素生物合成的關(guān)鍵酶，在睪酮生物合成中起限速酶的作用。Thitiphuree等通過RACE技術(shù)獲得了蝦夷扇貝(Mizuhopectenyessoensis)性腺組織3β-HSD的cDNA全長，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)扇貝性成熟出現(xiàn)大量生殖細(xì)胞時，3β-HSD的表達(dá)量最高[28]，說明3β-HSD在貝類性腺發(fā)育中也可能具有重要作用。Lin等通過GnRH體外培養(yǎng)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，GnRH可促進(jìn)細(xì)胞中3β-HSD的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)睪酮的分泌[36]。Chianese等研究發(fā)現(xiàn)蛙(Rana esculenta)體內(nèi)內(nèi)源性大麻素通過與大麻素受體(Cannabinoidreceptor，CB1)結(jié)合抑制下丘腦GnRH分泌及GtH的釋放從而降低了蛙睪丸中3β-HSD的表達(dá)進(jìn)而影響睪酮的生成[37]。本研究結(jié)果顯示當(dāng)GnRH被干擾時，菲律賓蛤仔性腺內(nèi)3β-HSD的表達(dá)并沒有發(fā)生顯著變化。在脊椎動物中，3β-HSD可能受多種其他因素調(diào)節(jié)，如卵巢內(nèi)ghrelin的表達(dá)參與抑制3β-HSD活性，降低性激素生成[38]。此外，3β-HSD主要表達(dá)于精巢間質(zhì)細(xì)胞、精原細(xì)胞、顆粒細(xì)胞以及精子中參與睪酮的合成，其中精巢間質(zhì)細(xì)胞是雄激素合成的主要場所，且僅在減數(shù)分裂時期發(fā)揮上述功能[39]。由此，我們推測菲律賓蛤仔雌雄性腺內(nèi)3β-HSD的表達(dá)調(diào)控可能與其所處的性腺發(fā)育時期有關(guān)。