王天澤，譚 佳，杜文斌，甄大衛(wèi)，謝建春

（北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京工商大學，北京 100048）

雞肉具有膽固醇含量低、蛋白質(zhì)含量高、氨基酸種類全等特點，深受大眾喜愛[1-2]。北京油雞，又名中華宮廷黃雞，是北京地區(qū)特有的肉蛋兼用型雞種。在燉煮過程中雞肉可釋放小肽、游離氨基酸、無機鹽、核酸代謝物等物質(zhì)，以賦予雞湯一定的風味和營養(yǎng)特性，使得雞湯滋味鮮美可口，營養(yǎng)價值提高[3]。與其他眾多品種雞肉相比，北京油雞雞肉肉質(zhì)細嫩、味道鮮美，尤其燉煮雞湯風味更佳[4]。

目前，對于雞湯中呈味物質(zhì)的研究已有一些相關(guān)報道。如王琳涵等[5]采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析不同煮制時間雞湯呈味物質(zhì)變化，發(fā)現(xiàn)在5 h內(nèi)5’-胞苷酸（5’-cytidylate monophosphate，5’-CMP）、5’-鳥苷酸（5’-guanosine monophosphate，5’-GMP）、乳酸和游離氨基酸含量隨著煮制時間的延長而增加，而5’-肌苷酸（5’-inosinemonphosphate，5’-IMP）和5’-腺苷酸（5’-adenosine monophosphate，5’-AMP）含量分別在煮制2、3 h時達最大值，且煮制4 h的雞湯滋味最佳。Qi Jun等[6]用HPLC和電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀分析燉煮時間對黃羽雞雞湯中游離氨基酸、5’-IMP和礦物質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)5’-IMP和氯化物含量均隨燉煮時間延長而增加。楊肖等[7]用HPLC法分析不同加鹽方式所得雞湯呈味物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)煮制前加鹽的雞湯中5’-CMP、5’-GMP、乳酸、琥珀酸和游離氨基酸含量最高，雞湯的整體風味最好。

肉湯滋味是湯中各種具有不同風味物質(zhì)的綜合作用結(jié)果。研究表明[8]，構(gòu)成雞湯滋味的風味物質(zhì)主要包括游離氨基酸、核苷酸、呈味肽。先前本課題組通過稀釋法/氣相色譜-嗅聞法，研究了北京油雞雞湯的香氣活性化合物構(gòu)成[4]。本實驗將采用HPLC法分析雞湯中的游離氨基酸、呈味核苷酸組成，采用葡聚糖凝膠色譜分離、高效凝膠色譜測分子質(zhì)量分布、基質(zhì)輔助激光解析-高分辨質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）結(jié)構(gòu)鑒定研究北京油雞雞湯的呈味肽組分，以期為模擬北京油雞雞湯風味品質(zhì)特性、制備高品質(zhì)肉味香精提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北京油雞 北京百年栗園生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司；葡聚糖凝膠Sephadex G-15 美國GE Healthcare公司；甲酸、乙腈、甲醇、三氟乙酸（均為色譜純） 賽默飛世爾科技有限公司；二水合5-磺基水楊酸、磷酸氫二鈉、硼酸鈉、甲酸銨（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；17 種氨基酸標準品（分析純） 美國Sigma公司；氨基酸分析衍生試劑鄰苯二甲醛溶液（10 mg/mL）、9-芴甲基氯甲酸酯溶液（2.5 mg/mL） 美國Agilent公司；多肽標準品混合液含乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（189 Da）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（451 Da）、桿菌酶（1 450 Da）、抑肽酶（6 500 Da）、細胞色素（12 500 Da） 上海曦玉分析儀器科技有限公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸（純度99%）德國Merk公司。5’-AMP、5’-GMP、5’-IMP（純度均為99%） 北京百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ALPHA 2-4 LSC冷凍干燥機 德國Christ公司；3-30K高速離心機 美國Sigma公司；1200型HPLC儀 美國Agilent公司；PHSJ-3F實驗室pH計 上海儀電有限公司；5800型MALDI-TOF MS儀 美國AB Sciex公司；MD-99自動液相色譜分離儀 上海青浦滬西儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

北京油雞（1 kg）去除內(nèi)臟、清水洗凈后，按質(zhì)量比1∶2將油雞和水置于燉煮鍋中，95 ℃燉煮3 h。燉煮后將雞湯過濾，石油醚（1∶1，V/V）萃取3 次除脂，再凍干成粉待用。

1.3.2 游離氨基酸分析

取3 g凍干粉置于燒杯中，加入32 mL磺基水楊酸溶液（質(zhì)量濃度36 g/L）混勻，靜置10 min，0 ℃、20 000 r/min離心15 min，取上清液，0.22 μm聚醚砜膜過濾，待分析。

HPLC條件：Poroshell HPH-C18分析柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）；柱溫40 ℃；流速1.5 mL/min；二極管陣列檢測器，檢測器程序：0～11.0 min，波長338 nm；11.0～18.0 min，波長262 nm（僅用于分析脯氨酸）。流動相A：10 mmol/L磷酸氫二鈉-10 mmol/L硼酸鈉緩沖液（pH 8.2）；流動相B：甲醇-乙腈-水（45∶45∶10，V/V）；梯度洗脫程序：0～0.35 min，2% B；0.35～13.4 min，2%～57% B；13.4～13.5 min，57%～100% B；13.5～15.7 min，100% B；15.7～15.8 min，100%～2% B；15.8～18.0 min，2% B。衍生化試劑：9-芴甲基氯甲酸酯和鄰苯二甲醛，質(zhì)量濃度分別為2.5、10 mg/mL；進樣1 μL。重復測定3 次。

將氨基酸標準品用蒸餾水逐級稀釋，配制胱氨酸標準溶液濃度為1.250、0.625、0.313、0.156、0.078 μmol/mL，其他16 種氨基酸標準溶液濃度為2.500、1.250、0.635、0.313、0.150 μmol/mL。以濃度（μmol/mL）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制17 種氨基酸標準曲線，外標法進行定量分析。

1.3.3 核苷酸測定

樣品為凍干粉加蒸餾水復溶的雞湯，質(zhì)量濃度25 mg/mL。HPLC條件：Waters Xbridge Amide柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；柱溫40 ℃；流動相為0.01 mol/L甲酸銨溶液（pH 4.5）-乙腈（15∶85，V/V）；流速1.0 mL/min，等度洗脫15 min；二極管陣列檢測器，檢測波長260 nm；進樣20 μL。重復測定3 次。

采用外標法定量分析。用蒸餾水配制5’-AMP、5’-GMP、5’-IMP的混合標準溶液儲備液16 mg/100 mL，然后稀釋為0.5、1、2、4、8 mg/100 mL。以質(zhì)量濃度（mg/100 mL）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線。

加標回收實驗：準備4 份雞湯樣品，3 份分別加入5’-AMP、5’-GMP和5’-IMP標準品至最終質(zhì)量濃度2.5、37、1.5 mg/100 mL，1 份作為空白實驗。4 份樣品均采用以上HPLC條件進樣分析。

1.3.4 葡聚糖凝膠色譜分離

裝有Sephadex G-15葡聚糖凝膠的色譜柱（玻璃管3.0 cm×60 cm），超純水洗脫，流速3.0 mL/min，紫外檢測波長220 nm，雞湯除脂凍干粉用蒸餾水配成質(zhì)量濃度100 mg/mL的溶液，經(jīng)0.45 μm聚醚砜膜過濾上樣，上樣量5 mL。根據(jù)檢測到的譜峰進行餾分收集，共收集了3 個譜峰的餾分，收集到的餾分凍干待用。

1.3.5 高效凝膠液相色譜分析

取一定量的1.3.4節(jié)獲得的凍干餾分以及一定量的原始雞湯除脂凍干粉，用蒸餾水配成質(zhì)量濃度為10 mg/mL溶液，過0.22 μm聚醚砜膜后，待HPLC分析。

色譜柱TSK gel G2000 SWXL柱（7.8 mm×300 mm，5 μm）；流動相為水-乙腈-三氟乙酸（80∶20∶0.1，V/V）；流速0.5 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量10 μL；二極管陣列檢測器，檢測波長220 nm。

繪制分子質(zhì)量校正曲線所用標準品：乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（189 Da）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（451 Da）、桿菌酶（1 450 Da）、抑肽酶（6 500 Da）、細胞色素（12 500 Da）。標準曲線：lgm＝-0.294 7x＋6.858 3，R2＝0.997 2（m為分子質(zhì)量/Da，x為保留時間/min）。將樣品組分HPLC分析的保留時間代入此方程，計算分子質(zhì)量m。

1.3.6 感官評價

取一定量1.3.4節(jié)獲得的凍干餾分以及一定量的原始雞湯除脂凍干粉，加蒸餾水配成質(zhì)量濃度10 mg/mL的溶液，待分析。感官評價小組由6 位經(jīng)培訓后篩選出的具有感官分析經(jīng)驗的成員組成，年齡在21～27 周歲，其中男性3 人，女性3 人。滋味評價描述詞為：鮮味、甜味、苦味、咸味、醇厚感和持續(xù)性。滋味強度分為5 個等級：無味、弱、一般、較強、強。評價小組成員先用純凈水漱口后，取2～3 mL樣品置于口中，15 s后吐出，2 個樣品評價時間間隔2 min。

1.3.7 MALDI-TOF MS分析

經(jīng)葡聚糖凝膠柱分離收集的2#峰餾分凍干的樣品，加蒸餾水配成10 mg/mL溶液。5800型MALDI-TOF MS儀，以60%乙腈溶液配制的飽和α-氰基-4-羥基肉桂酸溶液作為基質(zhì)，將基質(zhì)溶液與樣品溶液1∶1（V/V）混合，取1 μL點在MALDI靶板上，在室溫下自然干燥。

一級質(zhì)譜分析：激光光源為固態(tài)激光光源，脈沖加速電壓7 kV，波長349 nm，采用正離子反射模式采集數(shù)據(jù)，分子質(zhì)量掃描范圍200～3 000 u。二級質(zhì)譜（MS/MS）分析：選擇一級譜中強度高的母離子峰（m/z522.561 6、550.592 5、888.085 4和935.977 8），加速電壓2 kV，采用CID碰撞裂解獲取母離子的離子碎片。根據(jù)母離子及其碎片峰，推測呈味肽組分結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

圖表采用Microsoft Excel 2017軟件繪制。游離氨基酸、核苷酸含量均為3 次測定結(jié)果的平均值。各種氨基酸的呈味特性參照文獻[9]。游離氨基酸或呈味核苷酸的滋味活性值（taste active value，TAV），采用測定濃度除以閾值計算得到[6]。氨基酸、核苷酸的呈味閾值參考文獻[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞湯的游離氨基酸組成

如表1所示，按照滋味類型，分為鮮、甜、苦、無味氨基酸。雞湯中質(zhì)量濃度最高的為丙氨酸（60.79 mg/100 mL），其次為酪氨酸（54.84 mg/100 mL）、谷氨酸（53.66 mg/100 mL）等，其中鮮、甜味氨基酸總量為201.75 mg/100 mL，占比為54.52%；苦味氨基酸總量為127.58 mg/mL，占比為34.47%。據(jù)報道[6]，滋味鮮美的黃羽雞燉煮雞湯中，含量最高的為賴氨酸，其次為谷氨酸，而鮮甜味氨基酸占比（49.28%）也遠高于苦味氨基酸占比（8.45%），與燉煮北京油雞雞湯一致。但燉煮三黃雞雞湯與北京油雞雞湯不同，其含量最高的為組氨酸，其次為谷氨酸、丙氨酸，而鮮甜味氨基酸占比為39.85%，苦味氨基酸占比48.10%[8]，即苦味氨基酸占比高于鮮甜味氨基酸。以上游離氨基酸組成的特點可能是造成北京油雞雞湯滋味佳的原因之一。

表 1 雞湯中游離氨基酸組成Table 1 Composition of free amino acids in chicken broth

物質(zhì)對滋味的貢獻可采用TAV進行評估，一般TAV值大于1時，該成分對樣品滋味有貢獻；當TAV值小于1時，該成分對樣品滋味幾乎無貢獻。由表1可知，所有氨基酸中，僅鮮、甜味氨基酸谷氨酸和丙氨酸的TAV值大于1，分別為1.79和1.01，說明二者對雞湯滋味貢獻大?？辔栋被嶂械淖罡逿AV值僅為0.69（組氨酸），且異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸TAV值均很?。ǎ?.1）。另外，鮮、甜味氨基酸TAV值總和大于苦味氨基酸TAV值總和。以上TAV分析進一步表明，鮮甜味游離氨基酸占比高可能是北京油雞雞湯有較強鮮味的原因之一。

2.2 雞湯中核苷酸含量

核苷酸是肉中主要呈鮮味物質(zhì)之一，其中代表性呈鮮味核苷酸主要為5’-AMP、5’-IMP和5’-GMP[10]。核苷酸常采用C18反相色譜柱方法測定[11-13]，如Qi Jun等[6]先采用高氯酸溶液前處理，然后C18反相色譜柱分析了黃羽雞燉煮雞湯的核苷酸組成。C18反相色譜柱方法缺陷是使用磷酸鹽溶液作流動相，不利于液相色譜泵的壽命，且對于有些樣品分離效果欠佳[14]。

Amide柱采用鍵合酰胺官能團固定相，分離機理為近年發(fā)展的替代反相色譜，用于強極性親水性化合物分離的親水作用色譜（hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC）模式。常使用有機溶劑-水作流動相，能較好地分離極性化合物如氨基酸和核酸等[15-16]。本實驗嘗試用Amide柱，以乙腈-甲酸銨為流動相對未經(jīng)前處理的樣品中的5’-AMP、5’-IMP和5’-GMP進行分析，所得HPLC圖見圖1，測定結(jié)果如表2?？芍獦悠方M分得到了較好分離，且基質(zhì)干擾較小。進一步在所測定核苷酸含量范圍，采用加標回收方法驗證準確性，得出3 種核苷酸的加標回收率為93.5%～101.3%，表明此分析方法可靠。

圖 1 雞湯中3 種核苷酸含量的HPLC圖Fig. 1 HPLC chromatograms of three nucleotides in chicken broth

表 2 雞湯中3 種核苷酸含量Table 2 Contents of three nucleotides in chicken broth

據(jù)文獻報道，雞肉中5’-IMP是含量高的核苷酸[17]，蘑菇中5’-AMP為含量高的核苷酸[18-19]，馬鈴薯中5’-GMP及5’-AMP為含量高的核苷酸[14]，螃蟹、魷魚中5’-AMP為含量高的核苷酸[20-22]。由表2可知，與雞肉的核苷酸組成類似，在雞湯中檢測的3 種核苷酸也是5’-IMP含量高。3 種核苷酸中5’-IMP的TAV值大于1，而5’-AMP和5’-GMP的TAV值均小于1，說明主要是5’-IMP對雞湯的滋味有貢獻。同樣，黃羽雞雞湯中也是5’-IMP對雞湯的滋味有主要貢獻[6]。

此外，鮮味氨基酸如谷氨酸鈉和核苷酸之間具有協(xié)同作用，可增強雞湯的鮮味[23]。尤其檢測到的北京油雞雞湯中5’-IMP含量最高，可與丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸等甜味氨基酸產(chǎn)生協(xié)同作用，增強雞湯鮮味[24]。核苷酸中5’-AMP雖TAV值小于1，但其在低濃度時具有甜味，與5’-IMP之間可產(chǎn)生協(xié)同作用使雞湯鮮味增強[25]。

2.3 呈味肽組分的分離鑒定

2.3.1 雞湯中呈味肽組分的分離

圖2為雞湯經(jīng)葡聚糖凝膠色譜分離所得色譜圖。收集譜1#～3#峰的餾分，凍干，高效凝膠液相色譜測定分子質(zhì)量分布，并以原始雞湯的脫脂凍干粉樣品為對照，進行感官評價，結(jié)果如表3所示。

圖 2 雞湯經(jīng)葡聚糖凝膠分離色譜圖Fig. 2 Chromatograms of chicken broth separated on Sephadex G-15

表3 雞湯及其葡聚糖凝膠色譜分離收集餾分的分子質(zhì)量分布、滋味比較Table 3 Molecular mass distribution and taste of chicken broth and fractions from Sephadex G-15 chromatographic separation

由表3可以看出，未經(jīng)分離的雞湯有較強的鮮味、甜味、醇厚感和持續(xù)性，而分離得到的1#峰幾乎無味，2#峰有比雞湯更強的鮮味和類似雞湯的甜味、醇厚感和持續(xù)性，3#峰有稍弱于雞湯的鮮味和甜味，但無醇厚感和持續(xù)性。未經(jīng)分離的雞湯主要為分子質(zhì)量＞5 kDa和1～3 kDa的組分；1#峰樣品分子質(zhì)量＞5 kDa的組分百分比高于雞湯，＜3 kDa的組分百分比顯著低于雞湯；2#峰和3#峰樣品＞5 kDa的組分百分比均顯著低于雞湯，＜3 kDa的組分百分比均顯著高于雞湯，尤其2#峰的＜3 kDa的組分百分比又高于3#峰。

呈味肽通常為＜3 kDa的寡肽類物質(zhì)[26-28]，1#峰中＞5 kDa的組分為主，因此導致其幾乎無味。2#峰和3#峰＞5 kDa的組分均很少，二者滋味差異可能與＜3 kDa的組分所占百分比不同有關(guān)，還可能與組成二者的多肽種類和結(jié)構(gòu)不同有關(guān)。

2.3.2 雞湯中呈味肽組分結(jié)構(gòu)鑒定

對呈味最強的2#峰樣品進行分析，先采用MADLITOF MS進行一級質(zhì)譜分析，再選擇一級質(zhì)譜圖中豐度較高的峰進行二級質(zhì)譜分析[29]。由圖3a可知，一級質(zhì)譜顯示2#峰樣品中，豐度高的主要為＜1 kDa的多肽，且集中在m/z500和900周圍質(zhì)譜峰的豐度強，包括m/z911、935、550、888、522。對4 個質(zhì)譜峰進行碰撞誘導解離，得到的二級質(zhì)譜圖，如圖3b～e所示。

根據(jù)一級質(zhì)譜母離子及其對應的二級質(zhì)譜碎片推斷結(jié)構(gòu)。按照肽的質(zhì)譜裂分規(guī)律[30]，如表4所示，a、b、c、x、y、z方式斷裂的肽段離子均被檢測到。鑒定出的m/z550.590 0、888.080 0、935.970 0 3 個肽均含有鮮味氨基酸谷氨酸或甜味氨基酸丙氨酸，這與游離氨基酸分析結(jié)果一致。另外，m/z522.560 0、888.080 0、935.970 0 3 個肽還含有鮮味氨基酸谷氨酰胺，也有利于肽呈鮮味。

表 4 2#峰中肽的可能氨基酸組成Table 4 Possible amino acid composition of peptides in peak 2#

圖 3 2#峰的MALDI-TOF一級質(zhì)譜圖（a）及m/z 522.56、550.59、888.08和935.97對應的二級質(zhì)譜圖（b～e）Fig. 3 Mass spectrum (a) of peak 2# and tandem mass spectra (b–e) of peaks at m/z 522.56, 550.59, 888.08 and 935.97 as shown in (a)

3 結(jié) 論

北京油雞燉煮雞湯中鮮、甜味游離氨基酸占比及TAV均遠大于苦味氨基酸，這可能是雞湯滋味較佳原因之一。尤其谷氨酸和丙氨酸含量最高且TAV值大于1，對雞湯鮮味貢獻最大；呈味核苷酸中5’-IMP含量最高且TAV值大于1，對雞湯滋味貢獻大。

盡管雞湯中分子質(zhì)量＞5 kDa和1～3 kDa的肽組分含量高，二者占比達85.85%，但采用葡聚糖凝膠色譜分離收集餾分，發(fā)現(xiàn)鮮味、醇厚感和持續(xù)性均最強的組分主要為寡肽類（＜3 kDa），占比達84.29%。

對最強的呈味餾分采用MALDI-TOF MS/MS分析，鑒定出4 個肽，分別為Leu-Val-Gln-Tyr、Val-His-Ala-His-Ser、Ala-Gln-Asn-Ser-Tyr-Pro-His-Ala和Ala-Glu-Gln-Tyr-Arg-Leu-Val-Gly。因主要由谷氨酰胺、丙氨酸、絲氨酸等鮮甜味氨基酸構(gòu)成，推測可能對雞湯鮮味有貢獻。