超高效液相色譜-質(zhì)譜法檢測灘羊宰后成熟過程中風(fēng)味前體物質(zhì)的變化

尤麗琴，羅瑞明*，苑昱東，李子欣

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

羊肉是世界上較重要的動物蛋白質(zhì)來源，而灘羊是寧夏優(yōu)勢特色畜種，其肉質(zhì)細嫩鮮美、營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨特[1]。消費者大都根據(jù)風(fēng)味、多汁性和嫩度評價羊肉品質(zhì)，其中風(fēng)味是消費者評價肉品質(zhì)最常用的感官指標[2-3]。肉在加熱過程中，肉中的風(fēng)味前體物質(zhì)包括水溶性化合物和脂質(zhì)發(fā)生一系列復(fù)雜的反應(yīng)，如美拉德反應(yīng)、脂類氧化、氨基酸降解和硫胺素?zé)峤馍筛鞣N呈味物質(zhì)，賦予肉以滋味和香味[4-7]。影響肉類風(fēng)味宰前和宰后的因素包括動物的種類、年齡、體質(zhì)量、性別、飼料和宰后肌肉的生化反應(yīng)[8]。宰后胴體在成熟過程中風(fēng)味前體形成的生化反應(yīng)對于改善肉品質(zhì)有重要作用[9]，亦有研究報道宰后成熟會影響風(fēng)味前體濃度，肉中成分如糖、有機酸、肽、游離氨基酸和腺嘌呤核苷酸的含量變化顯著[10-11]。

代謝組學(xué)是分析低分子質(zhì)量代謝物生物化學(xué)過程的研究，對代謝物進行定性或定量及探討代謝物在生物體生物系統(tǒng)中的變化[12]。食品代謝組學(xué)中幾種常用的分析方法包括核磁共振光譜、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）和液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LCMS）[13-14]。通常GC-MS用于分析小分子質(zhì)量的揮發(fā)性化合物，而LC-MS用于分析小分子質(zhì)量的非揮發(fā)性化合物[15]。在肉品科學(xué)中，代謝組學(xué)已被用于研究肉中的異味來源和評價食物腐敗機制[16-20]，檢測食品中機械回收肉[21]，評估牛肉成熟時間和保存期[22]，并分析和預(yù)測干腌火腿的工藝條件[15]。關(guān)于肉類風(fēng)味物質(zhì)變化研究報道中，主要采用GC-MS對肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)定量、定性分析，對比揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類和含量[23-27]；針對肉中呈味核苷酸及其他非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)多采用高效液相色譜法分析[28-30]，而LC-MS技術(shù)為代謝組學(xué)分析中較成熟的技術(shù)之一，其樣本前處理較為簡單，并且檢測到的代謝物多為有機酸、氨基酸、核苷酸及某些脂類[31-32]。但目前采用LC-MS系統(tǒng)分析宰后成熟期間肉類風(fēng)味物質(zhì)變化的研究報道較少。

本研究以灘羊宰后背最長肌為研究對象，采用超高效液相色譜-質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS）法分析宰后肌肉在4 ℃成熟期間與風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)的代謝物種類和相對含量的變化，通過代謝途徑的映射，進一步探討灘羊肉成熟過程中風(fēng)味物質(zhì)前體、中間體代謝過程及其調(diào)控機制，為灘羊肉生產(chǎn)中風(fēng)味控制技術(shù)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灘羊背最長肌 寧夏鹽池縣大夏牧場食品有限公司。

L-2-氯苯丙氨酸標準品 上海恒創(chuàng)生物科技有限公司；甲醇、甲酸、乙腈（均為色譜純） 德國CNW公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY超高效液相色譜、ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm） 美國Waters公司；AB Triple TOF 5600高分辨質(zhì)譜 美國AB Sciex公司；XFSTPRP-24/32全自動樣品快速研磨儀上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；TGL-16MS臺式高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

采集貯藏溫度為4 ℃，相對濕度為80%的灘羊背最長肌200 mg，封裝于滅菌冷凍管中待用。采樣周期為4 d，即采樣時間點為第0、4、8天，每組樣本做8 個平行。

1.3.2 樣品預(yù)處理

精確稱取30 mg組織樣本到1.5 mL EP管中，加入20 μL內(nèi)標（L-2-氯-苯丙氨酸，0.3 mg/mL，甲醇配制），加入400 μL甲醇-水（4∶1，V/V）溶液；加入兩個小鋼珠，在-80 ℃冰箱中放置2 min后，放入研磨機中研磨（60 Hz，2 min）；冰水浴中超聲提取10 min；-20 ℃靜置30 min；4 ℃、13 000 r/min離心15 min，用注射器吸取150 μL的上清液，使用0.22 μm的有機相針孔過濾器過濾后，轉(zhuǎn)移到LC進樣小瓶，-80 ℃保存，直到進行LC-MS分析。質(zhì)控樣本（quality control，QC）由所有樣本的提取液等體積混合制備而成，每個QC的體積與樣本相同。

1.3.3 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采集

采用UPLC-MS聯(lián)用分析，樣品質(zhì)譜信號采集分別采用電噴霧離子源正負離子掃描模式。色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱溫保持在45 ℃，流速0.4 mL/min；進樣量5 μL。流動相A為水（含0.1%甲酸），B為乙腈（含0.1%甲酸）。梯度洗脫程序：0～2 min，5%～20% B；2～4 min，20%～60% B；4～11 min，60%～100% B；100% B保持2 min，然后降至5%，保持1 min，以平衡色譜柱。數(shù)據(jù)采集以全掃描模式（m/z70～1 000）與數(shù)據(jù)依賴型掃描模式結(jié)合進行。質(zhì)譜條件：離子源溫度550 ℃；離子噴霧電壓4 500 V；霧化氣壓35 psi；溶劑化離子去簇電壓100 V，碰撞能量10 eV；接口加熱器溫度550 ℃。對于數(shù)據(jù)依賴型掃描模式（m/z50～1 000），碰撞能量30 eV。

1.4 數(shù)據(jù)處理

從UPLC-MS分析儀采集的信號和質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)出后，對數(shù)據(jù)集預(yù)處理后得到一個由代謝物的相對峰面積、保留時間、離子模式和質(zhì)荷比組成的二維數(shù)據(jù)矩陣。此矩陣被導(dǎo)入SIMCA 14.0軟件（瑞典Umetrics AB公司）的主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）進行模式識別分析，篩選差異代謝物，作為灘羊肉宰后成熟的潛在特征物。根據(jù)差異代謝物的質(zhì)荷比，主要通過儀器自帶的快速鑒定系統(tǒng)（OSI/SMMS）結(jié)合The Human Metabolome Database（http://www.hmdb.ca/）和METLIN（http://metlin.scripps.edu/）兩個數(shù)據(jù)庫鑒定差異代謝物。將差異代謝物的相對峰面積通過分析平臺（Metaboanalysti 3.0）進行層次聚類分析，從而獲得代謝物的相對含量變化趨勢。為了進一步識別和可視化成熟對肌肉代謝途徑的影響，將鑒定后的差異代謝輸入KEGG數(shù)據(jù)庫（http://www.kegg.com），選擇Ovis Aries（sheep通路）為通路路徑庫，進行代謝通路的構(gòu)建和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多元統(tǒng)計分析

將所得數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA 14.0軟件進行模式識別，采用非監(jiān)督類的模式識別方法PCA和監(jiān)督模式識別方法OPLS-DA對灘羊肉UPLC-MS代謝指紋峰組內(nèi)和組間樣品進行識別。

圖 1 灘羊肉4 ℃冷藏成熟0、4 d和8 d的PCA得分、響應(yīng)排序檢驗和OPLS-DA得分圖Fig. 1 PCA score plots, corresponding validation plots of OPLS-DA,and OPLS-DA score plots derived from UPLC-MS for Tan sheep meat aged for 0, 4 and 8 days 4 ℃

在PCA得分圖中，每個點代表一個獨立的樣品，圖1A顯示樣品在95%置信區(qū)間且組間分離程度良好，表明成熟時間對灘羊肉代謝存在差異。在PCA模型基礎(chǔ)上，采用OPLS-DA模型進一步分析成熟對灘羊肉代謝模式影響，繼而篩選差異代謝物，由圖1B可知，模型的可解釋變量（R2X）分別為0.648和0.811，模型的可預(yù)測度（Q2）分別為0.627和0.673，說明該模型能很好地解釋和預(yù)測兩組樣本之間的差異。采用7 次循環(huán)交互驗證和200 次響應(yīng)排序檢驗的方法檢驗?zāi)Ｐ偷馁|(zhì)量，由圖1C可知，截距值R2分別為0.522和0.844，Q2分別為-0.325和-0.799，體現(xiàn)了模型的可靠性，說明基于UPLC-MS建立的OPLS-DA模型用于灘羊肉成熟期各組之間的差異是可信的。

2.2 差異代謝物篩選和鑒定

采用多維分析和單維分析相結(jié)合的辦法，篩選組間差異代謝物，篩選標準為OPLS-DA模型PC1的VIP值大于1.2、t檢驗的P值小于0.05和離子質(zhì)量測量準確度值小于10×10―6）。根據(jù)OSI/SMMS軟件結(jié)合HMDB和METLIN數(shù)據(jù)庫鑒定代謝物，表1列出了灘羊肉4 ℃冷藏成熟0、4 d和8 d差異代謝物的相關(guān)信息。

表 1 灘羊肉4 ℃冷藏成熟0、4 d和8 d的差異代謝物Table 1 Differential metabolites in Tan sheep meat aged at 4 ℃ for 0, 4 and 8 days

由表1可知，灘羊肉4 ℃冷藏成熟過程中主要的代謝物種類有氨基酸類及其衍生物、有機酸類、碳水化合物及其代謝物、脂質(zhì)、核酸及其衍生物和輔因子。據(jù)研究報道，肉類風(fēng)味形成是由肉中天然水溶性前體物如游離氨基酸、小肽、核酸、糖類、脂質(zhì)等經(jīng)加熱生成[33]。肉中產(chǎn)生甜味的糖由尸僵后的糖酵解產(chǎn)生，肉中咸味來主要自于肉鹽（谷氨酸單鈉）、有機酸和呈味氨基酸，鮮味氨基酸和呈味核苷酸的含量決定了肌肉的鮮美程度，尤其谷氨酸是決定羊肉鮮味的重要物質(zhì)，還具有形成肉鮮味和緩沖酸、堿等不良味道的特殊功效，對肉品的味道有重要影響[34-36]，此外，脂肪酸作為前體物，其在肌肉中的組成和含量可間接影響風(fēng)味的形成[37]。在本研究中灘羊肉4 ℃冷藏成熟期間碳水化合物和有機酸類在4 d組和0 d組中差異顯著，賦予肌肉甜味和酸味特征，而成熟8 d游離氨基酸及其衍生物、脂類和核酸及其衍生物差異較顯著且含量明顯增加，使肌肉中風(fēng)味特征更加豐富。生肉中風(fēng)味前體物質(zhì)可能潛在影響羊肉加工中風(fēng)味物質(zhì)的形成，因此在冷鮮羊肉加工時應(yīng)控制和合理選擇最佳成熟期，以保證產(chǎn)品風(fēng)味。

2.3 差異代謝物變化分析

圖2為UPLC-MS分析鑒定出灘羊肉冷藏成熟期間23 種差異代謝物的相對含量變化，0 d組樣品中腺苷二磷酸、DL-乳酸、D-赤蘚糖-4-磷酸、肌苷酸、戊烯二酸單酰輔酶A、DL-蘋果酸、D-核酮糖-5-磷酸、不對稱二甲基精氨酸和DL-7-羥基硬脂酸相對含量較高。成熟4 d時，樣品中N-乙?；?L-蛋氨酸、組氨精氨酸、L-苯丙氨酸、哌啶、檸檬酸、全順式-4,7,10,13,16-二十二碳五烯酸、肌苷和D-苯丙氨酸相對含量較高。而成熟第8天，大多數(shù)氨基酸及其衍生物、脂質(zhì)和核酸及其衍生物相對含量較第4天時增加，其中組氨精氨酸、β-檸檬?；?L-谷氨酸、D-苯丙氨酸、哌啶、肌苷和二十碳五烯酸相對含量顯著增加。

圖 2 灘羊肉4 ℃冷藏成熟0、4 d和8 d的差異代謝物相對含量變化趨勢Fig. 2 Concentrations of differential metabolites in Tan sheep meat aged at 4 ℃ for 0, 4 and 8 days

宰后肌肉成熟過程中主要變化是細胞死亡過程和內(nèi)源性蛋白酶對結(jié)構(gòu)蛋白的降解，這些變化都涉及肉類風(fēng)味前體[26]。國際上已把肌苷酸（inosine monphosphate，IMP）作為衡量肉質(zhì)鮮味的一項重要指標[38]，Macy等[39]指出IMP是肉味形成的必要條件，核苷酸和核苷是游離核糖和磷酸的潛在前體，其參與美拉德反應(yīng)。本研究顯示IMP含量在成熟第4天時下降，表明成熟前期IMP已出現(xiàn)降解，成熟后期肌苷含量的增加也證明在成熟第8天時仍有足夠的IMP進一步降解，研究結(jié)果與Williamoson等[40]報道的野牛肉背最長肌4 ℃冷藏期間水和脂溶性風(fēng)味前體研究結(jié)論一致。隨著成熟時間的延長，構(gòu)成肌漿蛋白的肽鏈打開，由于氨肽酶的作用下多肽和蛋白質(zhì)水解使灘羊肉成熟后期氨基酸及其衍生物種類和含量明顯增加，Koutsidis等[41]提到葡萄糖、果糖和甘露糖是生羊肉中的主要碳水化合物，而還原糖和氨基化合物之間的美拉德反應(yīng)是熟肉中風(fēng)味形成最重要的方式之一。Kim等[4]指出牛肉成熟過程中游離氨基酸總體含量的增加潛在影響熟肉風(fēng)味的增強。因此，生肉中的風(fēng)味前體無論是在美拉德反應(yīng)中還是作為美拉德反應(yīng)的前體，對煮熟的肉類風(fēng)味都有貢獻。肉中脂質(zhì)組成和脂肪酸的含量是影響肉和肉制品風(fēng)味的因素之一，脂肪酸是蒸煮肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)重要的前體物[42]，肌內(nèi)脂肪中含有大量不飽和脂肪酸，其中二十碳五烯酸可以抑制酸味和苦味，增加甜味和鮮味特征[43]，本研究中灘羊肉成熟第8天時二十碳五烯酸相對含量顯著增加。結(jié)果表明，隨著成熟時間的延長，灘羊背最長肌中核苷酸降解物、碳水化合物以及游離氨基酸等呈味物質(zhì)含量隨之增加，灘羊肉4 ℃冷藏成熟第8天時風(fēng)味前體物質(zhì)的總體水平較高，因此宰后成熟工藝有利于灘羊肉風(fēng)味的改善。

2.4 關(guān)鍵代謝通路分析

圖 3 代謝通路整合分析圖Fig. 3 Integrated metabolic pathways

將分析得到的差異代謝物映射到KEGG數(shù)據(jù)庫進行代謝途徑分析，結(jié)果顯示，在冷藏成熟過程中關(guān)鍵的代謝途徑為戊糖磷酸代謝、三羧酸循環(huán)、氨基酸合成和嘌呤代謝。基于KEGG代謝通路圖，將關(guān)鍵代謝通路和差異代謝物相互關(guān)聯(lián)，整合分析結(jié)果見圖3。

動物屠宰后肌肉處于厭氧狀態(tài)糖酵解途徑增強，ATP含量下降，導(dǎo)致肉中核苷酸減少和乳酸積累，此階段肉風(fēng)味較差[44]。在成熟早期，由于糖原供應(yīng)不足，木酮糖磷酸-3-差向異構(gòu)酶和核酮糖-磷酸-3-差向異構(gòu)酶活性減弱，使D-赤蘚糖-4-磷酸和D-核酮糖-5-磷酸含量降低。為維持肌肉細胞持有的生化過程，ATP在一系列腺苷酸激酶和AMP脫氨酶的作用下生成IMP，此階段肉質(zhì)柔嫩多汁，風(fēng)味較好[7]。在成熟后期，IMP在肌苷激酶的作用下進一步降解為肌苷。隨著成熟的延長，糖酵解所生成的丙酮酸不僅在一些輔酶的作用下，參與脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的代謝，進一步生成脂肪酸和游離氨基酸，也可以進入三羧酸循環(huán)，在此蘋果酸通過蘋果酸脫氫酶轉(zhuǎn)化為草酰乙酸，檸檬酸在草酰乙酸和乙酰輔酶A的縮合下含量增加，此階段肉中呈味物質(zhì)較多，肉質(zhì)風(fēng)味更加豐富[35]。綜上所述，整合圖中包含了關(guān)鍵代謝通路、代謝物及相關(guān)酶的關(guān)聯(lián)信息，以便理解灘羊肉成熟過程中風(fēng)味前體物質(zhì)變化的調(diào)控機理。

3 結(jié) 論

為系統(tǒng)分析成熟對灘羊肌肉代謝物及代謝通路的影響。本研究采用UPLC-MS代謝組學(xué)方法研究成熟過程對灘羊宰后背最長肌中內(nèi)源性小分子物質(zhì)代謝的影響，鑒定出23 種差異代謝物，包括7 種氨基酸及其衍生物、2 種碳水化合物及其代謝物、3 種有機酸類、5 種脂質(zhì)類、5 種核酸及其衍生物和1 種輔因子。從不同成熟期差異代謝物種類和含量的對比分析得出，隨著成熟時間的延長，差異代謝物中風(fēng)味特征物質(zhì)種類和含量總體水平顯著增加，從而灘羊肉的風(fēng)味特征更為豐富。代謝通路分析顯示，戊糖磷酸代謝、三羧酸循環(huán)、氨基酸合成和嘌呤代謝在灘羊宰后成熟期間風(fēng)味前體物質(zhì)形成中起主要調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果可為灘羊肉生產(chǎn)中風(fēng)味形成控制技術(shù)提供理論指導(dǎo)。