朱歡　蒙春旺　熊亮　朱雅寧　唐莉　郝莉　彭成　周勤梅

摘要：目的??完善黑順片質(zhì)量評價方法，為其質(zhì)量監(jiān)控提供參考。方法??采用薄層色譜法對不同產(chǎn)地黑順片進行定性鑒別;參照2015年版《中華人民共和國藥典》通則方法測定黑順片的水分、灰分、浸出物及農(nóng)藥殘留;采用滴定法對黑順片的鈣離子含量進行測定。結果??不同產(chǎn)地黑順片薄層色譜斑點清晰，分離度好;擬定黑順片中水分不得過14.0%，總灰分不得過6.0%，酸不溶灰分不得過1.0%，水溶性浸出物不得少于8.0%，鈣離子含量為130～280?μmol/g;11批四川江油黑順片均未檢出9種有機氯類農(nóng)藥殘留。結論??本研究建立的方法專屬性強，操作簡單，重復性好，可為黑順片的質(zhì)量評價提供依據(jù)。

關鍵詞：黑順片;質(zhì)量標準;薄層色譜法;浸出物

中圖分類號：R284.1????文獻標識碼：A????文章編號：1005-5304（2020）03-0061-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201905017

Study?on?Quality?Standards?of?Heishunpian

ZHU?Huan1，?MENG?Chunwang1，?XIONG?Liang1，?ZHU?Yaning2，?TANG?Li2，?HAO?Li2，?PENG?Cheng1，?ZHOU?Qinmei1

1.?Pharmacy?College，?Chengdu?University?of?Traditional?Chinese?Medicine，?The?State?Key?Laboratory?of?charactenistic?Chinese?Medicine?Resources?in?Southwest?China，?Chengdu?611137，?China;?2.?Ya'an?Sanjiu?Pharmaceutical?Co.，?Ltd.，?Ya'an?625000，?China

Abstract：?Objective?To?optimize?a?quality?evaluation?method?for?Heishunpian;?To?provide?references?for?the?quality?control?of?Heishunpian.?Methods?Heishunpian?from?different?producing?areas?were?examined?by?TLC?for?qualitative?identification.?According?to?Pharmacopoeia?of?People's?Republic?of?China?（2015?version），?the?moisture，?ash?content，?extraction?and?pesticide?residues?of?Heishunpian?were?determined;?The?content?of?calcium?ion?of?Heishunpian?was?determined?by?titration.?Results?The?spots?of?Heishunpian?from?different?producing?areas?were?clear?and?the?separation?degree?was?good.?The?contents?of?moisture?≤14.0%，?total?ash?≤6.0%，?acid-insoluble?ash?≤1.0%，?water-soluble?extract?≥8.0%?and?the?content?of?calcium?ion?should?be?130–280?μmol/g.?Nine?organochlorine?pesticides?were?not?detected?in?11?batches?of?Heishunpian?from?Jiangyou?in?Sichuan?Province.?Conclusion?The?method?established?in?this?study?is?specific，?simple?and?reliable，?which?can?provide?a?basis?for?the?quality?standards?of?Heishunpian.

Keywords：?Heishunpian;?quality?standards;?TLC;?soluble?extract

黑順片為毛茛科植物烏頭Aconitum?carmichaelii?Debx.的子根的加工品[1]，具有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛功效，臨床應用廣泛，既是目前市場主要流通品種，也是金匱腎氣丸等傳統(tǒng)中成藥的重要原材料，其質(zhì)量優(yōu)劣對相關中成藥的安全性和有效性有重要影響。目前業(yè)內(nèi)以2015年版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）為黑順片質(zhì)控標準，主要包括薄層鑒別、水分、雙酯型生物堿限量、含量測定。其地方標準主要收錄于各省市中藥材/中藥飲片炮制規(guī)范[2-3]，內(nèi)容多以炮制工藝為主。但藥典及地方標準中均未見黑順片灰分、浸出物、農(nóng)藥殘留、鈣離子含量等內(nèi)容，其相關項目有待完善和提高。

本試驗通過優(yōu)化薄層鑒別條件，以區(qū)分不同產(chǎn)地黑順片及其他炮制品。在常規(guī)檢查項中，針對黑順片在采收加工過程中常會粘附或夾雜有塵土、泥沙，炮制加工時對膽巴漂洗不充分會導致鈣離子含量增加，以及水分過高可能發(fā)生霉變等問題，為保證黑順片飲片質(zhì)量穩(wěn)定可靠，本試驗在《中國藥典》基礎上增加了灰分檢查項、鈣離子含量，并提高了水分標準。在安全檢查項中，針對黑順片原藥材種植栽培過程中常使用農(nóng)藥防治病蟲等問題，為保證藥材安全性，本試驗對其農(nóng)藥殘留進行測定。另外，黑順片主要以水煎入藥，其水溶性生物堿具有顯著的強心[4-5]、抗心律失常和降壓等作用[6-7]，通過增加水溶性浸出物測定，為初步衡量黑順片質(zhì)量優(yōu)劣提供依據(jù)。本試驗對3個產(chǎn)地共35批黑順片及15批不同類型附子炮制品開展質(zhì)量研究，為黑順片的質(zhì)量標準完善提供參考。

1??儀器與試藥

島津GC-2010Plus氣相色譜儀（島津公司），63Ni-ECD電子捕獲檢測器（島津公司），KQ5200E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮儀器生化廠），TDZ5-WS臺式低速離心機（湘儀離心機儀器有限公司），MiLi-Q純水器（Direct?8，美國Milipore公司），202-00型干燥箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司），DLD-30程控煅藥爐（杭州海善制藥設備有限公司），ZDHW型調(diào)溫電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司），HX-200高速中藥粉碎機（浙江永康市溪岸五金藥具廠），Sartorius系列電子分析天平（BP221S，德國賽多利斯公司），藥典2號篩、4號篩（道墟化驗儀器設備廠），定量濾紙（撫順市民政濾紙廠），電陶爐（康佳KES-?W21CS323）。

對照品新烏頭堿（批號110799-200404）、次烏頭堿（批號110798-200404），中國食品藥品檢定研究院;對照品烏頭堿（批號MUST-17022206）、苯甲酰次烏頭原堿（批號MUST-15010806）、苯甲酰烏頭原堿（批號MUST-15012215）、苯甲酰新烏頭原堿（批號MUST-15012216），成都曼斯特生物科技有限公司，純度均大于98%;附子靈、尼奧靈、宋果靈，本課題組自制，純度均大于98%。六六六、滴滴涕溶液（農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，批號201802），五氯硝基苯（農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，批號201705）。無水硫酸鈉、乙醚、正己烷、氯化鈉、二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚、甲醇、異丙醇、丙酮、硫酸、硝酸銀、二乙胺、氨水均為分析純（成都市科龍化工試劑廠），高氯酸（上海桃浦化工廠），硝酸（四川德陽化學試劑廠），乙二胺四醋酸二鈉、鈣紫紅素指示劑、氫氧化鈉、三乙醇胺（成都市科隆化學品有限公司），鹽酸（西隴科學有限公司，批號180201）。

35批黑順片，其中四川江油11批、云南12批、四川布拖12批，均由四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司參照2015年版《中國藥典》（一部）炮制加工而成，見表1。另收集4種附子炮制品飲片15批，來源信息見表2。所有樣品均經(jīng)成都中醫(yī)藥大學高繼海副教授鑒定為毛茛科植物烏頭Aconitum?carmichaelii?Debx.的子根加工品。

2??方法與結果

2.1??薄層鑒別

2.1.1??溶液制備

取對照品烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿，以及附子靈、尼奧靈、宋果靈自制對照品適量，精密稱定，各加異丙醇-二氯甲烷（1∶1）混合溶液，制成每1?mL各含0.5?mg的溶液，即得對照品溶液。

取黑順片及其余4種炮制品粉末各2?g，加氨試液3?mL潤濕，加乙醚25?mL，超聲處理30?min，過濾，濾液揮干，殘渣加二氯甲烷0.5?mL使溶解，作為供試品溶液。

2.1.2??條件篩選

將黑順片供試品溶液，對照品烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿及自制對照品（附子靈、宋果靈、多根烏頭堿、尼奧靈）進行展開。發(fā)現(xiàn)黑順片在苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿對應位置上有明顯斑點，而在烏頭堿對照品、次烏頭堿對照品、新烏頭堿對照品及附子靈、尼奧靈、多根烏頭堿、宋果靈的對應位置上無明顯斑點，因而確定薄層色譜鑒別的對照品為苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿。

采用2015年版《中國藥典》黑順片項下薄層鑒別展開比例[1]對比自制硅膠G板、默克板、預制硅膠G板的薄層鑒別效果。發(fā)現(xiàn)自制硅膠G板的分離效果較差，但顯色后斑點保留時間較長;默克板的分離效果較好，而顯色后斑點保留時間較短，不便于觀察和記錄;預制硅膠G板的分離效果較好，且顯色后斑點保留時間相對較長，確定為最優(yōu)薄層板。

對不同展開體系（正己烷-乙酸乙酯-甲醇、正己烷-乙酸乙酯-丙酮-二乙胺、正己烷-二氯甲烷-丙酮-二乙胺、二氯甲烷-丙酮-二乙胺、二氯甲烷-甲醇-二乙胺、乙酸乙酯-丙酮-二乙胺、乙酸乙酯-甲醇-二乙胺、二氯甲烷-甲醇-氨水等）、不同展開比例（二氯甲烷-甲醇-氨水=16∶2∶0.1、10∶1∶0.1、8∶1∶0.1）及展開劑中不同氨水比例（二氯甲烷-甲醇-氨水=16∶2∶0.1、16∶2∶0.15、16∶2∶0.2、16∶2∶0.25）進行考察，結果表明二氯甲烷-甲醇-氨水=16∶2∶0.15的展開效果最優(yōu)，確定為最優(yōu)展開條件。

最終確定薄層鑒別最佳條件為：參照薄層色譜法（2015年版《中國藥典》四部通則0502）試驗，吸取苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿對照品溶液及供試品溶液各5～10?μL，點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-氨水（16∶2∶0.15）為展開劑，在展開缸中飽和40?min，展開，取出，晾干，噴以改良碘化鉍鉀試液顯色。

2.1.3??鑒別結果

采用上述方法對35批黑順片及其余4種炮制品進行薄層鑒別分析，發(fā)現(xiàn)樣品中生物堿成點性好，分離度佳。11批四川江油黑順片在3個對照品對應位置上均有明顯的顯色斑點;12批云南黑順片和12批四川布拖黑順片在苯甲酰新烏頭原堿的對應位置上有明顯顯色，苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿顯色較弱。淡附片與黑順片的薄層色譜情況最為相似，但黑順片中單酯型生物堿顯色更為明顯，炮附片苯甲酰烏頭原堿顯色較黑順片弱;鹽附子和白附片的薄層圖譜中未見單酯型生物堿的斑點。見圖1～圖4。

2.2??水分、總灰分、酸不溶灰分及水溶性浸出物檢查及鈣離子含量測定

參照2015年版《中國藥典》四部通則0832水分測定法第二法（烘干法）、2302灰分測定法、2201熱浸法對35批黑順片的水分、總灰分、酸不溶灰分及水溶性浸出物進行考察。

采用滴定法[9]測定鈣離子含量。精密稱取黑順片粉末（過4號篩）0.5?g，加硝酸-高氯酸（4∶1）混合溶液10?mL，緩慢加熱消解，保持微沸，持續(xù)加熱至冒濃煙，直至白煙散盡，揮干。如未消解完全，重復加入硝酸-高氯酸（4∶1）混合溶液10?mL，直至消解完全。加5%鹽酸溶液5?mL溶解，加水50?mL，加入15?mL氫氧化鈉試液，加30%三乙醇胺2?mL，搖勻，再加適量鈣紫紅素指示劑，用0.01?mol/L乙二胺四醋酸二鈉滴定液滴定至溶液由紫紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榧兯{色，每1?mL乙二胺四醋酸二鈉滴定液（0.01?mol/L）相當于10??mol鈣。

由表3可以看出，35批黑順片水分含量為8.83%～12.20%，四川江油、布拖及云南黑順片的水分均值分別為11.41%、10.37%、9.91%;35批黑順片總灰分及酸不溶灰分為2.08%～4.27%、0.06%～0.51%，四川江油、布拖及云南黑順片的總灰分均值分別為2.34%、3.44%、3.55%，酸不溶灰分均值分別為0.20%、0.30%、0.13%;35批黑順片水溶性浸出物為8.57%～35.83%，四川江油、布拖及云南黑順片的水溶性浸出物均值分別為12.57%、29.03%、31.23%。參考2015年版《中國藥典》及相關標準，結合測定結果，擬定黑順片中水分不得過14.0%，水溶性浸出物不得少于8.0%。鑒于黑順片在炮制加工方法與黃附片較為相似，均為膽巴浸數(shù)日-煮至透心-撈出（剝皮）-切片浸漂-調(diào)色-蒸至透心，出現(xiàn)油面光澤再烘干，其中黃附片撈出后需剝皮，而黑順片不剝皮，因此，參考《四川省中藥飲片炮制規(guī)范（2015年版）》對黃附片總灰分及酸不溶灰分的限定[8]并結合本試驗數(shù)據(jù)，規(guī)定黑順片總灰分不得過6.0%，酸不溶性灰分不得過1.0%。

35批黑順片鈣離子含量為114.68～303.89?μmol/g，四川江油、布拖及云南黑順片鈣離子含量均值分別為168.22、202.12、230?μmol/g。鑒于3個產(chǎn)地黑順片均為同一企業(yè)采用相同方法炮制而成，從測定結果來看，產(chǎn)地不同對黑順片鈣離子含量有明顯影響，故按均值上下浮動20%計算，建議黑順片中鈣離子含量為130～280?μmol/g。

2.3??有機氯農(nóng)藥殘留測定

2.3.1??溶液制備

取六六六、滴滴涕溶液各0.50?mL，用正己烷定容至5?mL，得5??g/mL標準貯備液。取標準貯備液1.0?mL，用正己烷定容至10?mL，得0.5??g/mL標準溶液。分別取0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0?mL標準溶液定容至10?mL，即得六六六（α-HCH、β-HCH、γ-HCH、δ-HCH）和滴滴涕（p，p-DDE、p，p-DDD、o，p-DDT、p，p-DDT）標準品溶液。

取五氯硝基苯液1.0?mL，用正己烷定容至5?mL，得20??g/mL標準貯備液。取標準貯備液1.0?mL，用正己烷定容至10?mL，得2??g/mL溶液。取2??g/mL溶液2.5?mL，用正己烷定容至10?mL，得500??g/L標準溶液。分別取標準溶液0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0?mL，定容至10?mL，即得五氯硝基苯標準品溶液。

參照2015年版《中國藥典》四部通則2341農(nóng)藥殘留量測定法農(nóng)藥殘留測定法第一法（9種有機氯類農(nóng)藥殘留量測定法）制備黑順片供試品溶液。

2.3.2??線性關系考察

吸取上述標準品溶液各1?μL，注入氣相色譜儀，參照2015年版《中國藥典》四部通則2341農(nóng)藥殘留量測定法農(nóng)藥殘留測定法第一法（9種有機氯類農(nóng)藥殘留量測定法）色譜條件測定，以峰面積（mAU）為橫坐標，進樣量（μg）為縱坐標，進行線性回歸，線性關系考察結果見表4，色譜圖見圖5。

2.3.3??樣品測定

取供試品溶液1?μL，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，HSP-1氣相色譜圖見圖6。結果11批四川江油黑順片均未檢出9種有機氯類農(nóng)藥。

3??討論

附子生品有大毒，其毒性成分雙酯型生物堿經(jīng)炮制加工后可轉(zhuǎn)化為毒性較小的苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿及苯甲酰次烏頭原堿等單酯型生物堿[10-11]，但由于附子產(chǎn)地及炮制方法不同，使其炮制品中生物堿成分具有差異[12]。陳苡然等[13]對10批黑順片進行了薄層色譜鑒定，尚未涉及不同產(chǎn)地黑順片及附子不同炮制品的快速鑒定區(qū)分。本試驗對3個產(chǎn)地共35批黑順片、15批附子不同炮制品進行薄層鑒別，能明顯區(qū)分不同產(chǎn)地黑順片并辨別不同炮制品種。四川布拖和云南黑順片薄層檢識苯甲酰新烏頭原堿顯色明顯，但在苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿位置幾乎無顯色，四川江油黑順片的3個單酯型生物堿均能被檢識，能快速、靈敏地反映產(chǎn)地差異，故薄層鑒別對于區(qū)別不同產(chǎn)地黑順片有一定意義;同時發(fā)現(xiàn)四川江油黑順片與淡附片、炮附片、鹽附子和白附片的薄層色譜有差異，故薄層色譜法對區(qū)分四川江油黑順片與鹽附子、白附片和炮附片有一定意義。本試驗通過優(yōu)化黑順片薄層色譜鑒別方法，可為不同產(chǎn)地黑順片及附子不同炮制品種的鑒別提供一定依據(jù)。

目前有關黑順片水分、灰分、鈣離子含量、農(nóng)藥殘留及水溶性浸出物等內(nèi)容報道較少，而此類常規(guī)檢查、安全性檢查在黑順片質(zhì)量控制中極為重要。陳苡然[14]對20批不同等級黑順片的水分、灰分及水溶性浸出物進行比較，但并未對其限量;黃慧蓮等[15]測定了22批黑順片的水分、灰分及醇浸出物，規(guī)定水分不得過14.0%，總灰分不得過10.0%，酸不溶灰分不得過1.0%，醇浸出物不低于7.0%。本試驗較之增加了黑順片樣品批次，且各產(chǎn)地批次更均衡;水分的限定較2015年版《中國藥典》有所提升;參考《四川省中藥飲片炮制規(guī)范（2015年版）》[8]黃附片總灰分限定并結合試驗數(shù)據(jù)，擬定總灰分不得過6.0%，較文獻[15]規(guī)定的總灰分不得過10.0%有所提升，這一差異可能由不同廠家的黑順片炮制工藝不同或藥材本身質(zhì)量所致。

通過對不同產(chǎn)地黑順片樣品薄層鑒別、水分、灰分、酸不溶灰分、水溶性浸出物、鈣離子含量及有機氯農(nóng)藥殘留進行測定，本研究擬定黑順片中水分不得過14.0%，總灰分不得過6.0%，酸不溶灰分不得過1.0%，水溶性浸出物不低于8.0%，鈣離子含量為130～280?μmol/g，并建議有機氯農(nóng)藥殘留不納入黑順片質(zhì)量標準草案。

參考文獻：

[1]?國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：191.

[2]?湖南省食品藥品監(jiān)督管理局.湖南省中藥飲片炮制規(guī)范：2010年版[M].長沙：湖南科學技術出版社，2010.

[3]?重慶市食品藥品監(jiān)督管理局.重慶市中藥飲片炮制規(guī)范及標準：二OO六年版[M].重慶：重慶市食品藥品監(jiān)督管理局，2006.

[4]?陳海媚，陳秋伶，李夢婷，等.附子不同組分抗急性心力衰竭大鼠的實驗研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2019，31（3）：408-414.

[5]?張明璐.附子黑順片的加工工藝研究進展[J].廣東化工，2018，45（22）：58-66.

[6]?羅春梅，黃志芳，湯依娜，等.附子水溶性生物堿提取純化工藝研究[J].中草藥，2017，48（12）：2415-2424.

[7]?張梅，張藝，陳海紅，等.附子抗心律失常有效組分研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2000，11（3）：193-194.

[8]?四川省食品藥品監(jiān)督管理局.四川省中藥飲片炮制規(guī)范（2015年版）[M].成都：四川科學技術出版社，2016：127.

[9]?劉紅梅，王江瑞，方成鑫，等.鹽附子漂洗過程中鈣離子含量的測定方法[J].中國科技論文，2016，11（6）：615-618.

[10]?陳榮昌，孫桂波，張強，等.附子炮制減毒的研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20（15）：237-241.

[11]?YUE?H，?PI?Z?F，?SONG?F?R，?et?al.?Studies?on?the?aconitine-type?alkaloids?in?the?roots?of?Aconitum?Carmichaeli?Debx.?by?HPLC/ESIMS/MSn[J].?Talanta，2009，77（5）：1800-1807.

[12]?葉強，劉雨詩，劉紅梅，等.不同炮制工藝對附子生物堿類成分的影響[J].中成藥，2019，41（3）：601-607.

[13]?陳苡然，周霞，黃勤挽，等.對《中國藥典》黑順片薄層色譜鑒別方法的商榷[J].時珍國醫(yī)國藥，2013，24（10）：2481-2483.

[14]?陳苡然.附片（黑順片）分級及其質(zhì)量評價標準研究[D].成都：成都中醫(yī)藥大學，2013.

[15]?黃慧蓮，邵峰，任剛，等.主產(chǎn)地附子炮制品水分、灰分和浸出物測定[J].中藥材，2010，33（9）：1386-1388.

（收稿日期：2019-05-06）

（修回日期：2019-06-01;編輯：陳靜）