肖楚麗,肖煦暉,彭麗文,謝一銘,肖志勇

(1.邵陽學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,湖南 邵陽,422000；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院,湖南 衡陽,421001)

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的主要興奮性氨基酸,并且參與各種關(guān)鍵性生理和病理過程。谷氨酸穩(wěn)態(tài)的破壞可導(dǎo)致許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1-4]。興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(excitatory amino acid transporters,EAATs)在谷氨酸的突觸再攝取中起關(guān)鍵作用。EAAT家族包括5種亞型,即人類中的EAAT1-5以及嚙齒動(dòng)物中相應(yīng)的膠質(zhì)谷氨酸/天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(the glial glutamate/aspartate transporter,GLAST)、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(glutamate transporter-1,GLT-1)、興奮性氨基酸載體1(excitatory amino acid carrier 1,EAAC1)、興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體4(excitatory amino acid transporter 4,EAAT4)和興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體5(excitatory amino acid transporter 5,EAAT5)[5]。 GLAST(EAAT1)和GLT-1(EAAT2)主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá),而EAAC1(EAAT3),EAAT4和EAAT5是神經(jīng)元特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[6]。其中,GLT-1是主要的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,占腦組織中谷氨酸攝取總量的90%以上[5,7]。

諸多證據(jù)表明,阻斷谷氨酸攝取會(huì)導(dǎo)致異常行為。例如,側(cè)腦室內(nèi)注射或前額葉皮層顯微注射GLT-1抑制劑二氫紅藻氨酸(dihydrokainic acid,DHK)皮層會(huì)誘導(dǎo)快感缺失[8-9]，鞘內(nèi)或側(cè)腦室內(nèi)注射非選擇性谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑L-trans-PDC誘導(dǎo)對(duì)排尿反射起抑制作用[10]，GLT1復(fù)合物表達(dá)水平與記憶訓(xùn)練相關(guān)[11]。谷氨酸攝取的阻斷影響突觸傳遞和可塑性[12-14]，側(cè)腦室注射DHK損害小鼠新穎物體識(shí)別學(xué)習(xí)能力[15]。然而,GLT1阻斷對(duì)焦慮樣行為的影響仍然很少受到關(guān)注。曠場測試是一種檢測焦慮樣行為的方法,如今已得到廣泛應(yīng)用。本研究基于曠場測試評(píng)價(jià)側(cè)腦室注射DHK對(duì)小鼠焦慮樣行為的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

18只雄性ICR小鼠(30～35 g)購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。小鼠配對(duì)飼養(yǎng),自由飲水?dāng)z食。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為24 ℃,濕度為50%,明暗周期為7:00至19:00。實(shí)驗(yàn)開始前1周,實(shí)驗(yàn)者每天撫摸小鼠(3 min/只)。所有行為實(shí)驗(yàn)均在白天進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)操作遵照美國國立衛(wèi)生研究院NIH的《國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康與管理?xiàng)l例》。實(shí)驗(yàn)時(shí)隨機(jī)將小鼠分成溶媒組和DHK組,每組9只,其中對(duì)溶媒組進(jìn)行側(cè)腦室注射PBS(1 μL/只),DHK組側(cè)腦室注射DHK[6.25 μmd/(L·只)],并于給藥后30 min以及其后24 h分別進(jìn)行1次曠場實(shí)驗(yàn)。

1.2 側(cè)腦室置管及微量給藥

小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(65 mg/kg),待其麻醉后固定于腦立體定位儀上,暴露顱骨并標(biāo)記前囟點(diǎn),以前囟點(diǎn)為原點(diǎn)將導(dǎo)管(62202型,瑞沃德生命科學(xué)有限公司)向后0.3 mm、向右1.0 mm、向下2.5 mm植入右側(cè)腦室。手術(shù)后,小鼠單籠飼養(yǎng)恢復(fù)5～7 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,組織解剖發(fā)現(xiàn)每組1只導(dǎo)管位置錯(cuò)誤,其數(shù)據(jù)被剔除。

DHK(abcam,cambridge,UK)溶于0.01 M PBS(pH 7.4)側(cè)腦室微量給藥。在小鼠清醒狀態(tài)下用毛巾輕微束縛進(jìn)行,用微量注射泵通過引導(dǎo)管向側(cè)腦室注射DHK[6.25 nmol/(μl/只)]或PBS緩沖液(1 μl/只),注射速度為0.5 μl/min[15]。

1.3 曠場實(shí)驗(yàn)

曠場測試是在1個(gè)長寬高為50 cm×50 cm×60 cm的方形黑色聚乙烯的隔音箱中進(jìn)行。箱子的底部被平均分割成25(5×5)個(gè)格子,將中央16(4×4)個(gè)格子所組成的區(qū)域定義為中央?yún)^(qū)域[16]。實(shí)驗(yàn)時(shí),將小鼠置于箱子中自由探索10 min。通過箱頂攝像頭記錄小鼠行為并由熟練者雙盲統(tǒng)計(jì)小鼠直立時(shí)間(兩只前爪全部離地)、理毛時(shí)間、進(jìn)入中央?yún)^(qū)域的時(shí)間以及小鼠穿越格子數(shù)。兩組小鼠進(jìn)行連續(xù)2天的曠場測試,每天各10 min。在第1次曠場測試(OFT1)前30 min小鼠側(cè)腦室注射DHK或溶媒,OFT1后24 h進(jìn)行第2次曠場測試(OFT2),觀察2次曠場測試中小鼠理毛時(shí)間、進(jìn)入中央?yún)^(qū)時(shí)間和穿越格子數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用sigmastat 3.5軟件處理,組間比較使用非配對(duì)t檢驗(yàn),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用(mean±SE)表示,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DHK注射30 min后對(duì)小鼠OFT1焦慮行為的影響

在OFT1階段,非配對(duì)t檢驗(yàn)表明,各組小鼠直立樣行為時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖1A)。各組小鼠理毛時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖1B)。各組小鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖1C)。此外,各組小鼠穿越的的格子數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖1D)。

A-DHK注射30 min后對(duì)小鼠OFT1中直立樣行為時(shí)間的影響；B-DHK注射30 min后對(duì)小鼠OFT1中理毛時(shí)間的影響；C-DHK注射30 min后對(duì)小鼠OFT1中進(jìn)入中央?yún)^(qū)時(shí)間的影響；D-DHK注射30 min后對(duì)小鼠OFT1中穿越的格子數(shù)的影響圖1 DHK注射30 min后對(duì)小鼠OFT1中焦慮樣行為的影響(n=8)Fig.1 Effect of DHK injection on anxiety-like behaviors in OFT1 after 30 min(n=8)

2.2 DHK注射24 h后對(duì)小鼠OFT2焦慮行為的影響

在OFT2階段,非配對(duì)t檢驗(yàn)表明,各組小鼠直立樣行為時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖2a)。各組小鼠理毛時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖2b)。各組小鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖2c)。此外,各組小鼠穿越格子數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖2d)。

(a)DHK注射24 h后對(duì)小鼠OFT1中直立樣行為時(shí)間的影響；(b)DHK注射24 h后對(duì)小鼠OFT1中理毛時(shí)間的影響；(c)DHK注射24 h后對(duì)小鼠OFT1中進(jìn)入中央?yún)^(qū)時(shí)間的影響；(d)DHK注射24 h后對(duì)小鼠OFT1中穿越的格子數(shù)的影響圖2 DHK注射24 h后對(duì)小鼠OFT2中焦慮樣行為的影響(n=8)Fig.2 The effect of DHK injection on anxiety-like behaviors in OFT2 after 24 h(n=8)

3 討論

既往研究檢測了側(cè)腦室分別注射6.25，12.50，25.00 mmol/L 3種劑量的DHK,30 min后對(duì)小鼠活動(dòng)度的影響[15]。結(jié)果顯示劑量為12.5 mmol/L和25 mmol/L的DHK小鼠活動(dòng)度明顯降低,而劑量為6.25 mmol/L的DHK小鼠的活動(dòng)度不受影響。鑒于活動(dòng)度對(duì)小鼠焦慮樣行為的影響,當(dāng)前研究選擇6.25 mmol/μl的DHK檢測其對(duì)焦慮樣行為的影響。曠場測試是一種廣泛應(yīng)用的檢測焦慮樣行為的方法。小鼠在曠場中的直立樣行為、理毛行為和貼壁行為體現(xiàn)了小鼠的焦慮程度，因此，當(dāng)前研究統(tǒng)計(jì)了小鼠直立樣行為時(shí)間、理毛行為的時(shí)間和進(jìn)入中央?yún)^(qū)域的時(shí)間來衡量小鼠的焦慮樣行為。研究發(fā)現(xiàn)6.25 mmol/L的DHK不影響30 min和24 h后曠場測試中小鼠的直立樣行為時(shí)間、理毛時(shí)間、進(jìn)入中央?yún)^(qū)時(shí)間。此外,實(shí)驗(yàn)檢測了小鼠穿越的格子數(shù),結(jié)果顯示DHK不影響30 min后OFT1中小鼠的穿越的格子數(shù)以及24 h后OFT2中小鼠穿越的格子數(shù)。

有研究表明,在高架十字迷宮模型和恐懼條件化中,DHK中央杏仁核注射(12.5 mmol/L)可導(dǎo)致大鼠焦慮樣和抑郁樣行為[17]。本研究表明側(cè)腦室注射DHK不影響小鼠焦慮樣行為。造成這種差異的原因可能是注射區(qū)域的不同。有研究表明，緣下皮層注射DHK(0.5 mmol/L)在大鼠強(qiáng)迫游泳測試中發(fā)揮抗抑郁樣作用,并且能激活5-TH1A受體[18]。由于抑郁和焦慮的共病性,以及5-TH1A受體激活參與多種抗焦慮作用,提示緣前皮層注射DHK可能具有抗焦慮樣作用。本研究側(cè)腦室注射DHK通過腦脊液的循環(huán)藥物使DHK到達(dá)全腦。但因中央杏仁核和緣前皮層2個(gè)部位在焦慮行為中的相反作用,從而使側(cè)腦室注射DHK顯現(xiàn)出不影響小鼠焦慮樣行為的效果。然而,緣前皮層注射DHK對(duì)焦慮行為的改善作用仍缺乏直接證據(jù),今后的研究將驗(yàn)證緣前皮層注射DHK的抗焦慮作用。

研究表明,6.25 mmol/L的DHK損害小鼠新穎物體識(shí)別記憶獲得、鞏固和提取[15]。鑒于DHK杏仁核注射誘導(dǎo)小鼠焦慮樣行為,因而無法排除是否是DHK誘導(dǎo)焦慮從而損害學(xué)習(xí)記憶。本研究排除了該劑量DHK對(duì)小鼠焦慮樣水平的影響，為DHK作為一種新的記憶擦除藥物排除其對(duì)焦慮情緒的影響提供了證據(jù)。然而,1種測試方法難免有局限性,之后的研究將運(yùn)用高架十字迷宮、黑白箱等檢測方式進(jìn)一步評(píng)價(jià)DHK對(duì)焦慮樣行為的影響。

綜上所述,DHK注射30 min及24 h均不影響小鼠在OFT中的直立樣行為時(shí)間、理毛時(shí)間、進(jìn)入中央?yún)^(qū)時(shí)間和穿越的格子數(shù)。