杜陽陽，張 放，苗智穎，趙 紅，馬 迪，王 靜，李淑英，鄭春陽，李勁濤

宮頸癌發(fā)病率在世界范圍內(nèi)居女性惡性腫瘤的第二位，是危及全球婦女健康的嚴重疾病，據(jù)國際癌癥中心(IARC)估計，全球每年宮頸癌新發(fā)病例數(shù)約52.8萬，死亡人數(shù)約26.6萬[1]。研究證明，人乳頭狀瘤病毒 (human papillomavirus，HPV) 中13種高危型長期反復感染是宮頸癌發(fā)生的必要條件[2-4]；有研究表明HPV 58型在我國感染率較高[5-6]。盡管Gardasil 9 (HPV9價疫苗)已經(jīng)在世界范圍內(nèi)上市，該疫苗可預防9型HPV所致某些疾病(包括HPV型16，18，31，33，45，52和58型所致宮頸癌、外陰癌、陰道癌和肛門癌，以及HPV 6或11型所致尖銳濕疣)[7-8]，然而這種疫苗只適用于沒有感染過HPV的人群，對于已經(jīng)感染上述相應型別HPV而導致的病變患者沒有作用，因此，研制HPV58型治療性疫苗是非常必要的。依據(jù)上述事實和原理，本項研究以HPV58突變型E6E7(Mutant type E6E7，mE6E7)融合基因為靶點，用HPV58野生型E6E7(Wild type E6E7，wE6E7)融合基因片段作對照，利用對人無致病性的巨細胞病毒株(Towne株)細菌人工染色體(SW102 Towne bacterial artificial chromosome，SW102-T-BAC)為載體，構建攜帶HPV58 mE6E7及wE6E7融合基因的重組巨細胞病毒，探討HPV58mE6E7的轉化活性，為HPV58型治療性疫苗研制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料 GalK質(zhì)粒(pGalK), 對人無致病性的巨細胞病毒株(Towne株)細菌人工染色體(SW102 Towne bacterial artificial chromosome，SW102-T-BAC)包含巨細胞病毒的全基因組，并帶有氯霉素抗性基因，為美國羅格斯大學，新澤西醫(yī)學院朱樺教授惠贈。

1.2 方法

1.2.1HPV58 E6和E7野生型與突變型融合基因片段的合成 HPV E6和E7基因特有的Cys-x-x-Cys基序具有鋅指結構與抑癌基因p53，Rb結合并降解抑癌基因。為消除E6，E7基因可能的惡性轉化活性，將鋅指結構進行突變[9-10]，構建E6E7突變型融合基因。根據(jù)GenBank提供的基因編碼區(qū)序列， 對野生型基因序列加以改造，同時將E7與E6之間的終止子進行改造，使其形成連續(xù)編碼序列，而形成融合基因(具體改造方法見圖1)，這樣mE6E7融合基因保證了讀碼框的正確性，既可消除E6與E7的轉化活性又能保留其抗原性。委托北京賽思萊博科技有限公司合成突變型E6E7(mE6E7)與野生型E6E7(wE6E7)融合基因。

1.2.2帶有T-ORF75左/右同源臂GalK、HPV58 wE6E7與mE6E7融合基因引物的設計及片段擴增

1)依據(jù)GenBank提供的Towne株(FJ616285.1)基因序列，分別設計其開放讀碼框ORF75(Towne-ORF75左/右同源臂GalK，HPV58 E6E7融合基因引物(見表1)。委托北京賽思萊博科技有限公司引物合成。2)用所設計引物，以質(zhì)粒GalK、HPV58 wE6E7及mE6E7融合基因片段為模板，分別擴增GalK片斷、野生型及突變型融合基因wE6E7與mE6E7片段，反應體系 (100 μL)：PCR mix包括Buffer、dNTP Mixture及Taq DNA polymerase，primers 10 μmol/L (表1 GalK Primers及HPV58 E6E7 Primers)， 和 200 ng GalK質(zhì)粒DNA。 PCR反應循環(huán)：95 ℃/15 min； 31個循環(huán)95 ℃/30 s；55 ℃/30 s；72 ℃/1.5 min； 延伸72 ℃/10 min，4 ℃儲存。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并切膠純化回收。

表1 本項實驗中所需引物名稱、序列及大小
Tab.1 the name, sequence and size of the primers required in this experiment

引物名稱序列產(chǎn)物大小/bpGalk Primers GalK ForwardcaaccaccacctggatcacgccgctgaacccagcggcgcggccgcgctatgCCTGTTGAC-AATTAATCATCGGCA GalK Reversegctgaggagacagacggcgaggacgatgaggtaggaggggaggcctggccg-TCAGCACT-GTCCTGCTCCTT1 400HPV58E6E7 Primers HPV58E6E7 Forwardcaaccaccacctggatcacgccgctgaac-ccagcggcgcggccgcgctatgATGTTCCAGGACGCAGAGGAG HPV58E6E7 Reversegctgaggagacagacggcgaggacgatgaggtaggaggggaggcctggccg TCCTTGCTG-TGCACA GCTAG861Galk Check Primers Check Forwardgcgacttttgtaacccgtag Check Reversegcagtaggtgaaacgctttg1 550HPV58E6E7 check Primers Check Forwardgcgacttttgtaacccgtag Check Reversegcagtaggtgaaacgctttg1 012

1.2.3將已純化的Galk片段插入Towne開放讀碼框75(T-ORF75) 將上述純化的GalK片段電轉到SW102-T-BAC感受態(tài)細胞，然后用1 mL LB培養(yǎng)液，于32 ℃振搖1 h后，離心，再用1×M9液洗滌沉淀物2次，將洗滌后的菌均勻涂布于M63配制的含有Galk的培養(yǎng)基[7]，在32 ℃培養(yǎng)3 d后長出細菌克??；挑選3個克隆，提取質(zhì)粒DNA，PCR檢測GalK(表1 GalK Check Primers)。檢測正確克隆質(zhì)粒命名為SW102-T-ORF75-GalK-BAC。并制備其電轉感受態(tài)細胞，負80 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4HPV58E6E7融合基因代替GalK基因 取約800 ng已純化的T-ORF75左/右同源臂HPV58 wE6E7與mE6E7融合基因片段，分別電轉化到SW102-T-ORF75-GalK-BAC感受態(tài)細胞，用1 mL LB培養(yǎng)液，于32 ℃振搖4 h 30 min，離心，再用1×M9液洗滌細菌沉淀物2次，將細菌沉淀物混懸于1 mL M9洗滌液后，分別在進行10倍及100倍稀釋后，用不同濃度的稀釋菌液涂布于脫GalK培養(yǎng)基[11]，32 ℃培養(yǎng)3 d，有克隆形成；分別選2個克隆，提取質(zhì)粒DNA，PCR檢測(表1 HPV58E6E7 Check Primers)，正確克隆命名為SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC，SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC。

1.2.5轉染 ARPE-19細胞接種于12孔細胞培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)，待ARPE-19細胞生長到匯合度為60%時，用脂質(zhì)體介導分別將SW102-T-BAC、SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC與SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC質(zhì)粒轉染ARPE-19細胞，每種質(zhì)粒轉染3個復孔，剩余培養(yǎng)板中的3個孔細胞作為對照。24 h后將細胞培養(yǎng)液更換；并且每天觀察細胞生長狀況。待細胞長滿各孔后，轉移到培養(yǎng)皿(直徑為10 cm)繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.6轉染細胞中HPV58 mE6E7與wE6E7表達狀況 待10 cm培養(yǎng)皿中細胞完全匯合后，收集各組細胞，分別提取各組細胞RNA，逆轉錄PCR擴增檢測所收集細胞中HPV58 mE6E7與wE6E7的表達，并將PCR產(chǎn)物測序分析。

1.2.7軟瓊脂克隆實驗 底層軟瓊脂制備：配制1.5%瓊脂10 mL高壓滅菌，待其冷卻至大約50 ℃，加入2XDMEM 10 mL，混均，于24孔板的每個孔中加入0.8 mL，于室溫使其凝固。

上層瓊脂制備：將10 mL已滅菌含0.7%瓊脂冷卻至大約50 ℃，迅速加入10 mL含20%血清的2XDMEM培養(yǎng)液和穩(wěn)定表達SW102-T-BAC、SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC與SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC及未轉染的ARPE-19對數(shù)生長期細胞(濃度為3×103個/mL)，混勻，澆入底層鋪有軟瓊脂的24孔培養(yǎng)板中，每組細胞接種6個復孔，瓊脂凝固后將培養(yǎng)板放置在5% CO2、溫度為37 ℃及飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)12 d。每天在倒置顯微鏡下觀察軟瓊脂中細胞克隆形成情況，并記錄克隆形成數(shù)量，以分裂3次增殖8個細胞作為1個克隆，計算克隆形成率。克隆形成率(%)=(克隆數(shù)/接種細胞數(shù))×100%。

2 結 果

2.1HPV58 E6和E7野生型與突變型融合基因片段的合成 將HPV58 E6蛋白降解P53的活性部位、E7蛋白與pRB結合位點關鍵氨基酸改造后，所得片段基因序列如圖1。

圖1 HPV58 E6E7野生型與突變型融合基因突變位點序列Fig.1 HPV58 E6E7 fusion gene sequence of Wild-type and Mutant type

2.2GalK插入SW102-T-ORF75-BAC GalK培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后，選取其中3個菌落，提取質(zhì)粒DNA，以3個菌落質(zhì)粒DNA為模板PCR擴增，檢測到大小為 1 550 bp的PCR產(chǎn)物(圖2)，所得產(chǎn)物大小與預期結果相一致，表明GalK已克隆至Towne細菌人工染色體的開放讀碼框75，將正確克隆命名為SW102-T-ORF75-GalK-BAC。

M為1kb plus DNA ladder，1為陰性對照，2-4為GalK插入SW102-T-ORF75-BAC后，所選取的GalK培養(yǎng)基中生長的3個克隆，以所選的3個克隆質(zhì)粒DNA為模板，PCR產(chǎn)物電泳的結果。圖2 GalK克隆到SW102-T-ORF75-BAC后PCR擴增檢測結果Fig.2 Results of PCR amplification for detection GalK cloned to SW102-T-ORF75-BAC

2.3HPV58E6E7融合基因代替galK基因 經(jīng)過脫GalK培養(yǎng)基培養(yǎng)后，分別選取2個菌落，檢測到大小為1 012 bp的PCR擴增產(chǎn)物(圖3)，所檢測到的片段與預期結果一致，證實HPV58 wE6E7與mE6E7分別克隆至SW102-T-ORF75-GalK-BAC。正確克隆命名為SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC，SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC。

M為1kb plus DNA ladder，1是陰性對照，2-3 ：HPV58-mE6E7替代GalK所選2個克隆PCR擴增后電泳結果，4-5：HPV58 wE6E7替代GalK所選2個克隆PCR擴增后電泳結果。圖3 HPV58 mE6E7與wE6E7插入SW102-T-ORF75-GalK-BAC替代GalK所選克隆PCR擴增后電泳結果Fig.3 Results of PCR amplification for verification galk replaced by HPV58-mE6E7與wE6E7 in SW102-T-ORF75-GalK-BAC

2.4轉染與未轉染細胞生長狀況 分別將 SW102-T-BAC、SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC與SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC質(zhì)粒轉染ARPE-19細胞，培養(yǎng)10 d 后，在倒置顯微鏡下觀察，轉染SW102-T-ORF75-wE6E7-BAC的細胞生長失去接觸抑制，出現(xiàn)重疊生長現(xiàn)象，其形態(tài)由原來長梭形變?yōu)樽儓A、腫脹、胞漿顆粒增多(圖4)。

A為未轉染細胞; B為轉染SW102-T-BAC至ARPE-19的細胞; C為轉染SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC至ARPE-19的細胞;D為轉染SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC至ARPE-19的細胞。圖4 轉染ARPE-19細胞生長狀況(倒置顯微鏡下觀察結果 ×200)Fig.4 Growth of ARPE-19 cells were transfected (The results were observed under an inverted microscope ×200)

2.5轉染與未轉染細胞中T-ORF75-HPV58-mE6E7與T-ORF75-HPV58-wE6E7表達狀況 第20 d 收集轉染后細胞，分別提取各組細胞RNA，逆轉錄PCR檢測T-ORF75-HPV58-mE6E7與T-ORF75-HPV58-wE6E7 表達狀況，逆轉錄PCR檢測到轉約250 bp、1 012 bp及1 012 bp PCR產(chǎn)物，分別為轉染SW102-T-BAC、SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC及SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC的結果(圖 5)。 測序分析表明HPV58-mE6E7與HPV58-wE6E7穩(wěn)定表達于轉染的細胞中。

M為1kb plus DNA ladder，1：將SW102-T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC轉染 ARPE-19細胞，培養(yǎng)后提取細胞RNA，逆轉錄PCR擴增產(chǎn)物電泳的結果；2：將SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC 轉染 ARPE-19細胞，培養(yǎng)后提取細胞RNA，逆轉錄PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳的結果；3：用SW102-T-BAC轉染細胞ARPE-19，將轉染的細胞培養(yǎng)后提取RNA，然后逆轉錄PCR擴增產(chǎn)物電泳的結果，4：將未轉染細胞提取的RNA，進行逆轉錄PCR擴增，其產(chǎn)物電泳的結果；5：是陰性對照。圖5 細胞中T-ORF75-HPV58-mE6E7與T-ORF75-HPV58-wE6E7逆轉錄PCR檢測結果Fig.5 Results of reverse transcription PCR of T-ORF75-HPV58-mE6E7 and T-ORF75-HPV58-wE6E7 in transfected cells

2.6軟瓊脂克隆實驗 以分裂3次增殖8個細胞作為一個克隆，培養(yǎng)至第6 d，在倒置顯微鏡下可觀察到穩(wěn)定表達T-ORF75-HPV58-wE6E7-BAC的細胞組有克隆形成，而穩(wěn)定表達T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC、T-BAC及未轉染的ARPE-19細胞未見克隆形成；培養(yǎng)至12 d，克隆明顯增多增大，細胞呈堆積生長(圖6)，克隆形成率為23.5%(47/200)。穩(wěn)定表達T-ORF75-HPV58-mE6E7-BAC、 T-BAC、及未轉染的ARPE-19細胞組未見有克隆形成。

圖6 轉染SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7的ARPE-19細胞在軟瓊脂中形成的典型克隆(×200)Fig.6 Clone of ARPE-19 cells were transfected with SW102-T-ORF75-HPV58-wE6E7 in soft AGAR(×200)

3 討 論

雖然世界范圍內(nèi)已有HPV預防性疫苗上市[8,12]，預防HPV疫苗可保護健康人群免患相應型別HPV感染所導致的疾病，但對已感染相應HPV型別患病的人群沒有治療的效果，對已感染各型別HPV導致的各類疾病，還需相應的治療性疫苗。目前治療性HPV疫苗還處于研發(fā)階段，理想治療性HPV疫苗既要在患者體內(nèi)產(chǎn)生強的細胞免疫，又要清除患者體內(nèi)已感染的HPV，同時還要在患者體內(nèi)產(chǎn)生中和抗體，中和患者體內(nèi)病毒，而抑制病毒的傳播。

高危型HPV感染的惡性腫瘤中，E7與E6蛋白是形成HPV相關惡性腫瘤及維持其惡性表型所必需的蛋白；E6通過降解P53，降低細胞對DNA合成修復能力，容易出現(xiàn)錯誤的基因結構；E7與pRb基因結合，誘導中心體合成異常增多，使得有絲分裂異常紊亂，非整倍體細胞出現(xiàn)，從而導致細胞的惡性轉化[13-14]。E6和E7兩個癌基因在HPV陽性惡性腫瘤細胞中持續(xù)表達，而在正常細胞中不表達，因此，E6和E7蛋白屬于腫瘤細胞中特異性的病毒抗原，是HPV陽性腫瘤免疫治療的理想靶抗原，可將HPV E6和E7基因加以改造研制成治療性疫苗；但如果用野生型E7與E6基因直接作抗原，構建E6E7融合基因，有潛在致癌性；因此，需將野生型E7基因與pRB基因結合位點加以改造，E6降解P53基因位點加以改造，使其發(fā)生突變，敲除E7與E6基因的轉化活性，并將E7與E6各自的終止密碼子加以改造，這樣所構建的突變型融合基因，既保留了其抗原性，又去除了其致癌性，同時，也保證了融合基因讀碼框的正確性。因此，本項研究將E6基因結合p53、E7結合Rb活性部位鋅指結構域內(nèi)一些氨基酸序列加以改變，消除E6結合p53、E7結合Rb基因的降解活性，即E6第50位的亮氨酸在高危HPV中高度保守，可能在E6轉化過程中起重要作用；第63位和第106位的半胱氨酸位于E6的一對鋅指結構的兩側，在對p53的結合中起重要作用。E7中第24位半胱氨酸和第26位谷氨酸位于一對鋅指結構的兩側，第92位半胱氨酸位于一個獨立的鋅指結構中[10]，因此，我們將這些部位堿基序列加以改變，消除E6終止密碼子，并保證E6與E7讀碼框的正確性，使其形成融合基因，分別構建了HPV58mE6E7和HPV58wE6E7融合基因的重組病毒。通過轉染細胞形態(tài)學觀察及軟瓊脂克隆實驗證實所構建的重組病毒T-ORF75-HPV58-mE6E7已消除致癌活性。

利用Towne細菌人工染色體為載體，通過同源重組，已成功將HPV58E6E7融合基因連接到Towne的ORF75；Towne的ORF75編碼包膜糖蛋白gH，具有免疫原性，在誘導宿主免疫反應方面發(fā)揮著重要作用。今后將進一步探討重組病毒T-ORF75-HPV58-mE6E7的免疫原性、免疫反應性及其作為治療性疫苗的免疫效果。

本項研究采用巨細胞病毒減毒活疫苗Towne株[15-16]細菌人工人色體為載體，構建表達HPV58E6E7去除其轉化活性融合蛋白的重組巨細胞病毒，并轉染ARPE-19細胞，結果顯示已成功構建了攜帶Towne-ORF75-HPV58 mE6E7與wE6E7基因的重組病毒，為HPV58型治療性疫苗的研究奠定了基礎。

利益沖突：無